不同黑脛病發(fā)病程度下植煙根際土壤酶活性及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異比較

史普酉，楊成翠，賈 孟，白羽祥，劉 棋，朱宣全，程亞東，張金峰，王潤玲，譚小兵，楊煥文，王 戈*

（1．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，云南 昆明 650201；2．保山市煙草公司昌寧分公司，云南 保山 678100；3．曲靖市煙草公司羅平分公司，云南 曲靖 655800）

土傳病害嚴(yán)重影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)質(zhì)量形成，長期以來給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-3］?，F(xiàn)已明確，土傳病害的發(fā)生與土壤環(huán)境密切相關(guān)，其中土壤理化特性和微生物群落在與土傳病原菌相互作用中扮演重要角色［4-6］。近年來土壤微生物對(duì)植物健康影響的相關(guān)研究備受關(guān)注，大量研究表明，土壤微生物特別是根際微生物組成、結(jié)構(gòu)、多樣性和生態(tài)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系與植物土傳病害的發(fā)生具有密切聯(lián)系［7-9］。前人在對(duì)煙草青枯病和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究得出，煙株的健康與土壤微生物多樣性有關(guān)，更為復(fù)雜的土壤生態(tài)網(wǎng)絡(luò)可能有利于抑制病原菌的侵染［10］。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，感染青枯病菌土壤和健康土壤微生物的組成和多樣性存在顯著差異，健康土壤擁有更高的土壤微生物多樣性［11］。盡管如此，以往研究更多集中在健康和感病土壤之間的比較［12-13］，而對(duì)植株不同發(fā)病程度條件下土壤環(huán)境因子變化趨勢較少涉及，但其對(duì)進(jìn)一步解釋土壤環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化-病原菌侵染-植株感病三者的相關(guān)響應(yīng)關(guān)系具有重要意義。

煙草黑脛病（Phytophora parasitica var．nicotiana）是煙草上普遍發(fā)生的土傳性真菌病害［14］。近年來，由于我國耕地面積逐漸減少，煙田連作種植模式不斷擴(kuò)展，加上各植煙區(qū)外來優(yōu)勢烤煙品種的頻繁引進(jìn)，煙草黑脛病有愈演愈烈之勢，在某些病害嚴(yán)重的地塊，煙草黑脛病的發(fā)生率高達(dá)75%以上，甚至造成絕收，嚴(yán)重影響了煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的提高，給我國煙草產(chǎn)業(yè)帶來重大威脅［15］。基于此，本研究選擇云南煙區(qū)煙草黑脛病發(fā)病典型地區(qū)，篩選不同發(fā)病程度煙株，系統(tǒng)比較不同發(fā)病程度煙株根際土壤細(xì)菌群落與土壤酶活性的差異，分析其與發(fā)病程度的相關(guān)性，以期進(jìn)一步豐富煙株感病機(jī)理，并為今后防治黑脛病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況

1.1.1 取樣煙田背景

選定煙草黑脛病危害較為嚴(yán)重的3個(gè)區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)監(jiān)測（煙田種植情況如表1所示），即云南省石林縣板橋鎮(zhèn)（北緯24°41′28″、東經(jīng)103°15′28″，海拔 1 670 m），云南省昌寧縣珠街鎮(zhèn)（北緯 25°8′7″、東經(jīng) 99°53′42″，海拔 1 950 m）和云南省昌寧縣耇街鎮(zhèn)（北緯25°0′35″、東經(jīng)99°50′14″，海拔 1 690 m）。各區(qū)域定點(diǎn)一塊煙田進(jìn)行跟蹤監(jiān)測，供試土壤均為紅壤，品種為紅花大金元，供試田塊施肥措施及田間管理一致。

表1 不同煙區(qū)黑脛病發(fā)病情況調(diào)查

1.1.2 取樣處理設(shè)定

參照煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法［16］對(duì)煙株進(jìn)行黑脛病等級(jí)劃分并基于病情指數(shù)調(diào)查結(jié)果將煙株劃分為不同發(fā)病程度煙株（圖1），即正常煙株：全株無??；輕度發(fā)病煙株：莖部病斑不超過莖圍的1/2，或半數(shù)以下葉片出現(xiàn)輕度凋萎及下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；中度發(fā)病煙株：莖部病斑超過莖圍的1/2，或半數(shù)以上葉片出現(xiàn)輕度凋萎及少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；重度發(fā)病煙株：莖部病斑環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片出現(xiàn)凋萎。

圖1 各發(fā)病程度煙株取樣情況

1.1.3 取樣方法

于移栽后40～45 d（進(jìn)入旺長期）進(jìn)行煙株發(fā)病情況調(diào)查和取樣，取各發(fā)病情況煙株2～3株，用抖根法采集根系土壤，混勻后將土壤分成2部分，放入自封袋保存。取保山耇街根際土壤放入液氮罐保存待測土壤微生物，采用五點(diǎn)取樣法，取田間未植煙土壤做基礎(chǔ)土樣。

1.2 土壤酶活性測定

依據(jù)梅守榮［17］的方法測定土壤酶活性。過氧化氫酶活性采用KMnO4滴定法測定，脲酶活性利用靛酚藍(lán)比色法進(jìn)行測量；蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行測定；酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法進(jìn)行測量。

1.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)測定

1.3.1 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

利用CTAB法提取各處理樣本的基因組DNA，然后利用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的純度和濃度。取適量樣品放在離心管中，用無菌水稀釋樣品至濃度為1 ng/μL。以稀釋處理后的基因組DNA為模板，依據(jù)細(xì)菌和真菌測序區(qū)域的選擇，利用帶Barcode的特異引物（New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer）和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.2 引物對(duì)應(yīng)區(qū)域

515F和806R（16S V4區(qū)引物）用于鑒定細(xì)菌多樣性。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

應(yīng)用2%濃度的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，依據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對(duì)得出的目的條帶進(jìn)行拍照記錄，一次電泳條帶不清晰的目的條帶進(jìn)行二次電泳直至條帶清晰可用為準(zhǔn)，之后使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒對(duì)目的條帶產(chǎn)物進(jìn)行回收。

1.3.4 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使用建庫試劑盒（TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit）進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量檢測確定文庫是否合格。

1.3.5 土壤細(xì)菌基因組DNA信息分析

（1）測序數(shù)據(jù)處理

首先從Illumina HiSeq測序平臺(tái)得到的下機(jī)數(shù)據(jù)中分離出樣品數(shù)據(jù)，使用FLASH［18］拼接截去Barcode和引物序列后的樣品reads，得到Raw Tags，Raw Tags經(jīng)過過濾處理［19］后得到Clean Tags。然后按照Tags質(zhì)量控制流程［20］通過數(shù)據(jù)庫Gold database與UCHIME Algorithm［21］比 對(duì) 后將Clean Tags進(jìn)行檢測和去除嵌合體序列［22］的處理，最終得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)Effective Tags。

（2）OTU聚類和物種注釋

利用Uparse軟件［23］對(duì)各處理樣品Effective Tags進(jìn)行聚類。默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，同時(shí)選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA［24］的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫［25］進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1）。獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平：界（kingdom），門（phylum），綱（class），目（order），科（family），屬（genus），種（species）統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。最后對(duì)樣品的數(shù)據(jù)均一化處理，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理。

（3）樣品多樣性分析（Alpha Diversity）

使用Qiime軟件（Version 1.7.0）計(jì)算各處理樣本的 Observed-species，Chao1（the Chao1 estimator），ACE（the ACE estimator），Shannon（the Shannon index），Simpson（the Simpson index），Goods-coverage（the Good’s coverage）指數(shù)，Alpha 多樣性指數(shù)的具體應(yīng)用為：Chao和ACE指數(shù)用于分析菌群豐富度（Community richness），Shannon和Simpson指數(shù)用于分析菌群多樣性（Community diversity），Coverage用于分析測序深度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Office 2016初步處理和作圖，并采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)病程度煙株土壤酶活性變化特征分析

由圖2可以看出，各試驗(yàn)點(diǎn)土壤過氧化氫酶活性隨發(fā)病程度呈下降趨勢，但不同發(fā)病程度間無顯著差異。各試驗(yàn)點(diǎn)不同發(fā)病程度間煙株根際土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性變化存在一定差異，但總體趨勢均表現(xiàn)為隨發(fā)病程度增加，酶活性逐漸降低。不同試驗(yàn)點(diǎn)中，珠街點(diǎn)較其他兩點(diǎn)不同發(fā)病程度煙株土壤酶活性變化較大，其根際土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶活性均顯著低于正常植煙土壤。

2.2 不同發(fā)病程度煙株土壤微生物變化特征分析

2.2.1 不同發(fā)病程度黑脛病土壤細(xì)菌群落在門水平上的差異

植煙根際土壤細(xì)菌菌落優(yōu)勢門類相似（圖3），相對(duì)豐度較大的4個(gè)門類均為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes），但是以上各門類隨發(fā)病程度呈現(xiàn)規(guī)律存在一定差異。隨發(fā)病程度加重，變形菌門和擬桿菌門隨著發(fā)病程度的加重呈先下降再上升趨勢；放線菌門隨發(fā)病程度呈下降趨勢，而酸桿菌門則呈現(xiàn)上升趨勢。以上分析表明，隨發(fā)病程度加重，土壤中細(xì)菌門類出現(xiàn)一定的趨向性變化。

圖2 不同發(fā)病程度煙株土壤酶活性變化特征比較

圖3 不同發(fā)病程度黑脛病土壤細(xì)菌群落在門水平上的差異

2.2.2 不同發(fā)病程度黑脛病土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)變化特征比較

不同發(fā)病程度煙株根際土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)均不同程度低于健康根際土壤（圖4），且隨發(fā)病程度加重呈現(xiàn)一致的先下降后上升趨勢。不同發(fā)病程度間均以輕度發(fā)病煙株根際土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)最低，其中shannon和simpson輕度發(fā)病煙株顯著低于健康煙株。以上分析說明，隨發(fā)病程度加重，土壤中細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)降低，其中以輕度發(fā)病時(shí)最低。

圖4 不同黑脛病發(fā)病程度土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)變化特征比較

2.2.3 不同發(fā)病程度黑脛病土壤屬水平相對(duì)豐富度比較

從31個(gè)相對(duì)豐富度大于0.002的屬中選擇差異顯著的16個(gè)屬進(jìn)行比較（表2）。正常煙株土壤鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）顯著低于未植煙土壤。隨著發(fā)病程度加重，鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Rhizomicrobium屬呈先上升后下降的趨勢，且在煙株輕度發(fā)病的條件下占比最大，隨后呈下降趨勢。甾體桿菌屬（Steroidobacter）、Gaiella屬、阿達(dá)爾桿菌屬（Adhaeribacter）、杜氏桿菌屬（Tumebacillus）隨發(fā)病程度的增加，呈先下降后上升的趨勢，且在輕度發(fā)病條件下最低，unidentified_Acidobacteria屬隨發(fā)病程度的增加持續(xù)增加，重度發(fā)病程度下顯著大于正常、輕度發(fā)病植株。Adhaeribacter屬、Variibacter屬呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。以上結(jié)果表明，植煙及黑脛病發(fā)病程度的加重均會(huì)導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變，煙株輕度發(fā)病時(shí)，對(duì)土壤細(xì)菌群落影響最大。

2.2.4 基于weighted Unifrac距離PCoA分析

Unifrac分析得到的距離矩陣通過PCoA分析，可以直觀顯示不同樣品中微生物的相似性及差異性。從圖5可以看出，第一和第二主成分分別可以解釋28.25%和22.42%的原有變量。不同發(fā)病程度煙株土壤細(xì)菌群落出現(xiàn)了明顯分離，其中沿第一主成分坐標(biāo)分析，輕度發(fā)病、中度發(fā)病煙株與正常煙株、重度發(fā)病煙株土壤群落結(jié)構(gòu)分離；沿第二主成分坐標(biāo)分析，隨發(fā)病程度加重，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)逐步分離，且分離程度隨發(fā)病程度加重而增大。以上分析表明，不同發(fā)病煙株土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，且這種變化與發(fā)病程度相關(guān)。

表2 不同發(fā)病程度黑脛病土壤屬水平相對(duì)豐富度比較 （%）

圖5 基于weighted Unifrac距離PCoA分析

3 討論

土傳病害的發(fā)生與土壤主要環(huán)境因子及其相關(guān)性具有密切聯(lián)系［26］，其中土壤酶活性和微生物群落在植物與土傳病原菌相互作用中扮演重要角色［27-28］。本研究在對(duì)田間自然發(fā)病煙株根際土壤酶活性和微生物群落分析發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)病程度根際土壤酶活性和微生物群落特征存在明顯差異，且隨發(fā)病程度呈一定的趨向性改變。這些結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步明確土壤主要環(huán)境因子與土傳病害發(fā)生的相關(guān)性，豐富土傳病害致病機(jī)理具有一定的理論意義。

土壤酶反應(yīng)土壤生化反應(yīng)的強(qiáng)度和方向，在土壤物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化過程中扮演重要角色，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分［29-30］。蔗糖酶是表征土壤肥力的重要指標(biāo)，與土壤碳代謝密切相關(guān)；脲酶與土壤中氮素的循環(huán)和轉(zhuǎn)化有關(guān)，是表征土壤氮素水平的重要指標(biāo)；磷酸酶的作用是促進(jìn)磷素的循環(huán)和轉(zhuǎn)化，表征土壤磷素的水平［31］。本研究中，各調(diào)查點(diǎn)不同發(fā)病程度煙株根際土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶活性隨發(fā)病程度增加均呈下降趨勢。其他一些研究者在不同的研究中也得出相似的結(jié)論，如尋路路等［32］、何川等［33］、姜飛等［34］、游春梅等［35］及廖梓良等［36］的報(bào)道。說明脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶這4種酶與植物土傳病害的響應(yīng)規(guī)律具有普遍性，在不同植物上都是相同的。李成江等［37］指出，根區(qū)微生物對(duì)糖類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、胺類和酚酸類的利用愈高，土傳病害發(fā)生越輕，與此相對(duì)應(yīng)，土傳病害發(fā)病程度越高，也可能造成烤煙利用根區(qū)附近營養(yǎng)物質(zhì)能力降低，阻礙土壤營養(yǎng)元素的流動(dòng)與循環(huán)［38-39］。

土壤微生物在維持土壤健康上具有重要作用，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，物種越均勻，表明土壤微生態(tài)系統(tǒng)較為穩(wěn)定和平衡，利于作物的生長和抵御病害［40-41］，而土壤中病原微生物的富集不利于土壤微生物種群的平衡［13］。本研究中，不同發(fā)病程度根際土壤細(xì)菌門類水平優(yōu)勢群落組成相似，但隨發(fā)病程度放線菌門相對(duì)豐度呈下降趨勢，而酸桿菌門（Acidobacteria）呈上升趨勢。這可能是因?yàn)橹参锔H土壤中的放線菌具有抵御病原菌侵染的功能，且其中部分根際放線菌還具有促進(jìn)植物生長的能力［42］，煙株受黑脛病侵染后，放線菌減少，根際土壤抗菌能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致病原菌大量滋生，病害加重。而酸桿菌門具有降解植物殘?bào)w多聚物的功能［43］，受黑脛病侵染的植株隨發(fā)病狀態(tài)的加重土壤根系受損，致使土壤中殘?bào)w增多，最終導(dǎo)致酸桿菌門的增加。

細(xì)菌群落豐富度用Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)表示，其值越高表明群落物種的豐富度越高［44］；shannon指數(shù)反映樣品的多樣性程度，其值越高表明群落物種的多樣性越高；simpson指數(shù)反映了物種的優(yōu)勢度［45］。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同發(fā)病程度之間土壤微生物豐富度并不存在顯著變化，但黑脛病初步發(fā)病植株的土壤微生物多樣性與優(yōu)勢度最低，均顯著低于未發(fā)病煙株，隨著發(fā)病程度的加重，shannon指數(shù)與simpson指數(shù)卻逐漸增加，這說明黑脛病初步發(fā)病時(shí)，細(xì)菌群落均勻性最差，此時(shí)黑脛病菌在根際環(huán)境中大量繁殖，抑制了其他微生物生長和代謝，生物群落結(jié)構(gòu)趨于單一，益菌種類減少或代謝降低，微生物區(qū)系從“正常生理組合”向“病理組合”轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致感病品種迅速感?。?，46-47］。但隨著發(fā)病程度的加重，細(xì)菌的均勻性卻逐漸恢復(fù)，其原因有待進(jìn)一步深入研究。根據(jù)基于weighted Unifrac距離PCoA分析結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)未植煙土壤與正常植煙土壤之間相對(duì)較為接近，隨著發(fā)病程度的加深，土壤情況逐步分離，這可能是由于與黑脛病病原菌對(duì)土壤微生物的影響較小，而隨著黑脛病發(fā)病程度的加重，黑脛病病原菌在土壤中不斷富集，致使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變。

4 結(jié)論

健康煙株土壤脲酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶與蔗糖酶活性均高于未植煙土壤與黑脛病發(fā)病煙株土壤酶活性，同時(shí)隨著黑脛病發(fā)病程度的加重會(huì)導(dǎo)致植煙根際土壤中蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶活性降低。不同發(fā)病程度黑脛病發(fā)病植煙土壤菌落組成較為相似。正常植煙土壤細(xì)菌的shannon指數(shù)、chao1指數(shù)、simpson指數(shù)與ACE指數(shù)均高于未植煙土壤，隨著黑脛病發(fā)病程度的加重，shannon、chao1、simpson、ACE指數(shù)均呈現(xiàn)先下降再上升趨勢，并且均表現(xiàn)為黑脛病初步發(fā)病時(shí)細(xì)菌的α多樣性最低。綜上所述，植煙及黑脛病發(fā)病程度的加重均會(huì)導(dǎo)致植煙根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變，煙株輕度發(fā)病時(shí)，對(duì)植煙根際土壤細(xì)菌群落影響最大。