癌癥的基因治療研究進展

楊柳　黃長江　王名雪

摘要：癌癥的基因治療是利用載體通過轉基因技術將外源基因轉入病患體內，以沉默致病基因、修改突變基因、抑制癌細胞生長、提高癌癥藥敏性等手段治療癌癥患者。本文對目前癌癥基因治療最常用的五種技術，即自殺基因療法、基因沉默療法、抑癌基因療法、免疫系統療法和抗血管生成基因療法進行綜述，并分析基因治療的應用價值和目前存在的安全性問題，以期對相關研究提供一定的參考。

關鍵詞：基因治療;癌癥;自殺基因;基因沉默;抑癌基因;免疫療法;抗血管生成

中圖分類號：R730.59? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.03.001

文章編號：1006-1959（2020）03-0001-05

Advances in Gene Therapy for Cancer

YANG Liu，HUANG Chang-jiang，WANG Ming-xue

（Yantai Maibairui International Biomedicine Co.，Ltd.，Yantai 264006，Shandong，China）

Abstract：Gene therapy for cancer is the use of vectors to transfer foreign genes into patients through transgenic technology， and to silence cancer-causing genes， modify mutant genes， inhibit cancer cell growth， and improve cancer drug sensitivity. This article reviews the five most commonly used techniques for cancer gene therapy， namely suicide gene therapy， gene silencing therapy， tumor suppressor gene therapy， immune system therapy， and anti-angiogenic gene therapy，and security issues in order to provide some reference for related research.

Key words：Gene therapy;Cancer;Suicide gene;Gene silencing;Tumor suppressor gene;Immunotherapy;Anti-angiogenesis

自20世紀70年代以來，隨著轉基因技術的發(fā)展，各種基因編輯技術不斷發(fā)展，疾病的基因治療也逐漸被提出。癌癥是目前最難攻克的頑疾之一，傳統的病灶切除、化學療法、放射療法，不僅治療效果有限，而且對患者身體的副作用極大，而基因治療是一種新的治療手段，以其特異性高、針對性強、副作用少等優(yōu)點，備受學者們的關注。本文現就自殺基因療法、基因沉默治療、抑癌基因治療、免疫系統療法和抗血管生成基因治療[1]等目前基因治療的主要手段進行綜述。

1自殺基因

癌癥的自殺基因治療是利用病毒或非病毒載體，將不存在于哺乳動物中的一些細菌或病毒中攜帶的藥物敏感酶的基因轉入癌癥靶細胞中，并使其在癌癥靶細胞中表達，合成藥物敏感酶，該酶可催化無毒或微毒的藥物前體轉化成對細胞具有毒性的藥物，從而殺死攜帶該基因的受體細胞，達到治療癌癥的目的。目前，自殺基因治療系統有很多，如單純皰疹病毒胸苷激酶基因系統（herpes simplex virus type 1 thymidine kinase，HSV-TK）、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因系統（escherichia coli cytosine deaminase，CD）、大腸桿菌嘌呤苷酸磷酸化酶基因系統（purine nucleoside phosphorylase，PNP）、大腸桿菌硝酸還原酶基因系統（escherichia coli nitroreductase）、羧肽酶A羧肽酶G2基因系統（carboxypeptidase A carboxypeptidase G2）和辣根過氧化物酶基因系統（horseradish peroxidase）等，但被研究和應用最多的自殺基因治療系統是：HSV-TK和CD[2]。

近幾年，HSV-TK和CD基因系統被不斷改善和研究。Shao D等[3]報道了一種基于量子點的技術，通過構建近紅外熒光量子點（QDs）和TK基因之間的共價連接來揭示HSV-TK/GCV自殺基因治療的過程。這種穩(wěn)定的QDs標記不影響QDs熒光及TK基因的生物活性，實現了TK基因在體內外抗癌癥過程中，實時動態(tài)的可視化追蹤。Lee M等[4]利用逆轉錄病毒復制載體，構建了一個含有兩個自殺基因的TK-CD系統，對7個膠質母細胞瘤患者進行臨床試驗，以檢驗逆轉錄病毒復制載體構建的自殺基因系統的傳遞效率和抗癌作用。通過流式細胞和高含量分析顯示，在癌細胞組織中，治療基因的傳遞與前藥更昔洛韋（ganciclovir）和5-氟胞嘧啶的易感性之間存在廣泛的轉導效率和良好的相關性。自殺基因系統與前藥協同抑制癌細胞增殖和血管生成，同時增加原位膠質母細胞瘤異種移植物的凋亡。Gwak SJ等[5]開發(fā)了一種聚丙交酯-乙交酯接枝聚乙烯亞胺（PgP）的陽離子雙親共聚物為自殺基因系統的載體，并在細胞和動物模型中證明了其作為藥物和基因載體的功效。

2016年7月，歐洲藥品管理局（EMA）批準了首個“自殺基因”療法Zalmoxis。該療法通過向供者移植物中分離得到的T細胞導入可被誘導的“自殺基因”——HSV-TK基因，使得人們可以隨時使用更昔洛韋藥物殺死引起不良免疫反應的T細胞，以防止移植物抗宿主反應的惡化。

2基因沉默

基因沉默又稱RNA干擾技術，是指內源或外源的dsRNA通過轉基因、轉座子或病毒感染等方式進入受體細胞，引起靶細胞特異性的基因沉默。一般在3種水平上實現基因的特異性沉默，即轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平。理論上，通過siRNA的適當設計，可以使用該技術沉默體內的任何基因，在癌癥以及其他疾病的治療（如乙型肝炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、高膽固醇血癥和肝硬化）方面提供更大的治療潛力[6，7]。Pang W等[8]就通過設計siRNA，研究mir-628基因的表達與胃癌發(fā)生的關系。研究發(fā)現mir-628沉默后，其低表達與胃癌的淋巴結轉移、浸潤深度及TNM分期密切相關。

由于siRNA不與染色體DNA相互作用，具有較低的誘導靶細胞基因改變或突變的風險，且siRNA對靶基因高度特異，毒性低，不誘導多藥耐藥等優(yōu)點較突出。siRNA可以誘導許多癌癥相關的基因沉默，導致腫瘤消退，但不能清除異常基因[9]。siRNA療法可以直接應用于癌癥組織，但是無法全身給藥。因為裸siRNA蛋白容易被酶降解、腎濾過和宿主細胞吞噬等作用而清除。現已開發(fā)出幾種siRNA輸送系統來保護它們免受酶降解，并促進它們對靶基因的沉默作用。其中針對惡性黑色素瘤的藥物CALAA-01（calando pharmaceuticals）[10]和針對肝癌和實體瘤的ALN-VSPOI（alnylam Pharmaceuticals）即目前臨床試驗中比較受關注的siRNA輸送系? ?統[11]。然而，由于毒性相對較高和轉染效率較低，成功率非常有限[6，12]。

近年來，除了RNA干擾技術外，利用表觀遺傳學治療癌癥也頗受各界研究者們的關注，科研者和臨床醫(yī)生研究出多種甲基轉移酶和組蛋白去乙?；敢种苿瑢槟承┌┌Y提供替代治療。表觀遺傳抑制劑可單獨或與其他治療藥物聯合作用于抑癌基因的重新激活并抑制癌細胞生長[13]。廣泛的DNA甲基化是多種惡性腫瘤的重要標志，因此，DNA甲基轉移酶（DNMTS）抑制劑被證明是有希望成為靶向表觀遺傳密碼的藥物。目前已有5-Azacitidine和Decitabine是兩種長期以來被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于治療血液病的DNMTS抑制劑等較多表觀遺傳抑制劑被批準用于癌癥治療[14]。

3抑癌基因

某種基因在某些細胞組織中正常表達，但在該細胞組織病變的惡性癌癥組織中，該基因突變致使功能喪失或表達缺失，若經載體將該基因的野生型轉入相對應的惡性癌癥組織中，癌癥細胞將大部分或全部消亡，這種基因則被稱之為抑癌基因[15]?，F已發(fā)現的抑癌基因有20多種，包括APC、ATM、ARID1A、p53、PTEN和FHIT等。目前基因替代療法也是一種重要的癌癥基因治療手段，即利用載體將正常的抑癌基因轉入癌變靶細胞內，替代突變的抑癌基因，使癌癥細胞恢復正常。

p53基因自發(fā)現以來，一直都是備受關注的熱點抑癌基因。它位于17號染色體上，有11個外顯子和10個內含子[16]。人類的癌癥中近一半是由于p53基因錯義突變引起的，而這個突變相當微小，僅僅是因為肽鏈上的393個氨基酸中的一個被替換，但大多是中心DNA結合區(qū)域的氨基酸被替換才會引發(fā)細胞癌變。目前科學家已鑒定出一些熱點氨基酸替換位置，包括R175、G245、R248、R249、R273和R282等[17]。在卵巢癌的細胞組織中有很高比例的p53功能喪失。在臨床前研究中，野生型p53的轉導可抑制癌癥增殖[18]，并增加對順鉑[19]和PTX[20]的敏感性。此外，有研究顯示[21]，p53的腺病毒感染是激活癌細胞凋亡并使耐藥的卵巢癌癥細胞對紫杉醇（PTX）重新敏感的有效方法，該反應由p53上調的凋亡調節(jié)劑介導，該調節(jié)劑是p53的直接下游促凋亡效應物。近些年為提高基因治療的效率和靶向性，各種載體被開發(fā)和研究。Lin JT等[22]以酰胺化的人免疫缺陷病毒-1轉錄反式激活因子（TAT）修飾的殼聚糖接枝的多聚N-3-羧芐氧基-賴氨酸（CCL）為載體，它可同時將p53和阿霉素共導入細胞核，發(fā)揮其抗腫瘤作用，相比于傳統載體，其具有更高的基因轉染率和藥物傳遞效率。

PTEN基因是自p53基因后最受關注的抑癌基因，位于10號染色體上，有9個外顯子和8個內含子，其表達蛋白具有磷酸酶活性，參與細胞的增殖、遷移、入侵，以及細胞生長周期的調節(jié)，影響DNA的損傷修復等[23]。PTEN基因與人類胃癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌等許多癌癥的發(fā)生密切相關，研究者們在多種癌癥細胞組織中均觀察到了PTEN基因的變異[24]。Wu H等[25]用外源性PTEN質粒轉染卵巢癌細胞系，提高了細胞組織中PTEN基因的表達量，導致在細胞周期的G1期，癌細胞停止生長并凋亡，顯著得消滅了大量癌細胞。這可能是由于PI3K/AKT通路的抑制，以及通過降低MMP-9的表達從而減少癌細胞遷移和侵襲。研究表明PTEN和p53基因間還有著密切的聯系，p53基因能直接調控PTEN基因的轉錄，結合在PTEN基因的序列上游，激活其轉錄，并使表達水平上調[26]。

目前，針對抑癌基因治療應用最多的療法就是溶瘤病毒治療。2005年安柯瑞/Oncorine（重組人5型腺病毒注射液）通過國家食品藥品監(jiān)督管理局審批，成為了全球首個獲批上市的溶瘤腺病毒藥物。2015年10月，Imlygic通過FDA審批，成為首款在美國上市的溶瘤病毒基因療法。Imlygic是一種經過基因改造的溶瘤病毒，改造中去掉了兩個基因，增加了GM-CFS基因，適用于治療不能經手術完全切除的黑色素瘤。

4免疫療法

免疫系統是癌癥消亡或蔓延的關鍵因素，癌癥的免疫治療可分為四大類[27]：主動免疫療法、被動免疫療法、過繼免疫療法和免疫增強療法。免疫療法可包括上述一種或多種方法作為獨特的免疫療法治療，或與其他癌癥療法相結合。

主動免疫療法是直接使宿主免疫系統對癌癥抗原產生高度特異性的敏感，例如癌癥疫苗。Wolff JA等[28]用含有外源轉錄因子的抗原構建DNA質粒，作為一種癌癥疫苗。將其轉染進宿主細胞，轉錄成肽鏈或蛋白質，并誘導細胞和體液免疫反應。與病毒或細菌載體相比，該技術被認為是相對安全的，不會引起感染或自身免疫紊亂，并且易于商業(yè)開發(fā)和生產[29]。然而，其有效性隨著時間的推移而減弱，因此，需要經常加強免疫接種。目前，單抗原質粒疫苗的例子有很多，包括治療前列腺癌的前列腺酸性磷酸酶蛋白[30]、人表皮生長因子受體-2（HER-2/neu）、治療轉移性乳腺癌的皮內低劑量GM-CSF原癌基因[31]和改良的癌胚抗原基因與一種破傷風類毒素融合，用以治療結直腸癌[32]。盡管單抗原質粒疫苗的治療耐受性很好，但反應小且有效性短暫。因而，科研者現在大都使用多抗原質?；呙纾僧a生廣泛的特異性、持久性和多功能免疫刺激[33]。

被動免疫療法是利用人源化或嵌合抗體特異性靶向癌癥抗原，而不直接激活宿主免疫系統，例如FDA批準的幾種抗惡性癌癥的抗體藥物，包括治療乳腺癌的曲妥珠單抗[34]、治療惰性淋巴瘤的利妥昔單抗[35]、治療肺癌的西妥昔單抗[36]和治療各種實體瘤的貝伐單抗[37]等。近幾年，新型抗體偶聯藥物ADC（antibody-drug conjugate）橫空出世，成為現今抗體藥物研發(fā)的前沿領域，其由單克隆抗體和強效毒性藥物偶聯而成，是一種融合了小分子藥物毒性和抗體靶向作用的強效抗癌藥物[38]。目前已上市的ADC藥物一共有四種，包括2011年Seattle Genetics和Millennium公司共同開發(fā)的治療霍奇金淋巴瘤的Adcetris;2013年Genentech和ImmunoGen公司研制的治療HER-2陽性晚期乳腺癌的Kadcyla;2017年輝瑞公司開發(fā)的，分別治療急性骨髓性白血病和急性淋巴細胞白血病的Mylotarg和Besponsa。

過繼免疫療法則是利用患者的免疫細胞，無論是T細胞還是樹突狀細胞，使其在體外受到刺激或操縱，然后注入回體內，以更好地對抗癌癥抗原。Hinrichs CS等[39]在對人乳頭狀癌癥病毒（HPV）誘導的轉移性宮頸癌患者的研究中，收集了癌癥浸潤的T淋巴細胞，再將其輸入患者體內。研究者隨后從患者體內檢測出其白細胞介素-2的表達量升高，并有一半患者體內的癌癥體積減小，其中有兩名患者在治療18個月和11個月后癌癥完全消退，且機體基本沒有產生副作用。2017年8月，Kymriah通過FDA審批，成為全球首個獲批上市的CAR-T細胞治療藥物。該療法通過提取、改造和強化患者自己的免疫細胞來達到抗癌效果。上市時FDA批準適應癥為治療罹患B細胞前體急性淋巴性白血病（ALL），且病情難治，或出現二次及以上復發(fā)的25歲以下患者。2018年5月，FDA批準了Kymriah第2項適應證，治療復發(fā)或難治性大B細胞淋巴瘤的成人患者。

免疫增強療法在近幾年也成為大眾關注的熱點，其旨在增強共刺激分子或阻斷抑制分子，利用人體的免疫系統消滅癌細胞，其中PD-1/PD-L1免疫靶點抑制劑的開發(fā)和應用取得了較好的成績[40]。由再生元（Regeneron）開發(fā)的塞普利單抗于2018年9月28日獲FDA批準上市，后于2019年6月28日獲歐洲藥物管理局（EMA）批準上市，用于治療轉移性皮膚鱗狀細胞癌（CSCC）或不能接受治愈性手術或放療的局部晚期CSCC患者。塞普利單抗是一種靶向于PD-1的全人源單克隆抗體，通過阻斷PD-1和PD-L1的結合阻斷T細胞失活[41]，增強免疫系統的抗腫瘤反應，是FDA批準的第一例針對晚期CSCC的療法，同時也是第三款獲得FDA批準的抗PD-1抗體。

5抗血管生成基因治療

在癌癥組織中，促血管生長因子和抗血管生長因子之間的平衡被打破，血管生成能力增強，利于癌癥細胞的生長和增殖?？寡苌莎煼ǔ晒Φ年P鍵在于使癌癥細胞中的抑制劑長期維持在最佳水平，因此基因治療是實現這一目標的最好策略。

血管生成受血管內皮生長因子及其酪氨酸激酶受體（VEGFR-1/FTL-1、VEGFR-2、VEGFR-3/FTL-4）和血管生成素生長因子及其受體（Tie1和Tie2）的調節(jié)，無論是單藥治療還是聯合治療，這一通路已成為多方研究的目標[42]。一些抗VEGFR酪氨酸激酶抑制劑的小分子如雷戈拉非尼、法米替尼、阿昔替尼和阿帕蒂尼等已被證明是治療轉移性結直腸癌（MCRC）的有效藥物。Fruquintinib是一種新型口服抗VEGFR酪氨酸激酶抑制劑，由和記黃埔醫(yī)藥公司開發(fā)，是一種高效、高選擇性的VEGFR-1、-2和-3小分子抑制劑，同時它也顯示出可接受的安全性和耐受性。根據多次試驗的數據，2018年，中國食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）批準Fruquintinib用于治療至少接受過兩次標準抗癌治療的MCRC患者[43]。2012年，報道了以腺病毒為載體，釋放的可溶性誘餌VEGF（-1，-2和-3，不含酪氨酸激酶的部分）的抗血管生成基因治療，并通過小鼠模型癌癥實驗，闡明了聯合基因治療比單基因治療具有更強的抗癌癥作用[44]。此外，如果將PTX添加到聯合基因治療中，實驗模型大鼠的存活率將升高[45]。

6總結及展望

根據《The Journal of Gene Medicine》雜志的臨床試驗站點（http：//www.abedia.com/wiley/indications.php）統計，自1989年到2018年12月共有1951個癌癥基因治療臨床試驗，占該注冊中心匯編的基因治療臨床試驗總數的66.6%。臨床試驗已經探索了多種癌癥基因治療手段的可行性和有效性，包括免疫治療、自殺基因和溶瘤病毒治療等。迄今為止，臨床試驗登記處共有69701項癌癥相關試驗，其中有約57%的臨床試驗項目涉及基因治療。

隨著二代測序、基因編輯等多種生物技術的涌現，基因治療愈發(fā)成熟和完善。目前的癌癥基因治療遵循生物學“基因-細胞-個體”的基本研究方法，針對致病基因、癌變細胞和癌細胞微環(huán)境三方面，分別進行基因的敲除、沉默和替換等改造;免疫細胞模型的改構與建立;抗癌細胞血管生成、導入細胞因子以提高免疫應答等。無論是最早的自殺基因療法還是最近的生物創(chuàng)新藥物ADC都在癌癥治療領域取得了較好的成績。但另一方面，癌癥致病基因的多樣性、發(fā)病機制的復雜性以及個體先天的差異性，導致癌癥的基因治療在臨床試驗和實際治療中應用較困難，往往需要聯合用藥才會有所成效。探索和研究癌癥的多種靶點也一直是醫(yī)學領域和科研工作者致力的方向。在安全性方面，目前基因治療中病毒載體的使用飽受爭議，病毒載體雖然高效、易于整合到宿主細胞，但病毒其自身的感染性和寄生性也需重點關注，且脫靶問題一直是基因治療的難關，若插入片段隨機整合到宿主細胞，則突變引起的病變將不可預計。

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收稿日期：2019-10-22;修回日期：2019-11-20

編輯/肖婷婷