低溫獅子頭冷藏過程品質(zhì)變化規(guī)律

張志剛 林祥木 胡濤 鄒忠愛 蘇永裕 邵樂樂

摘 要：為研究中華傳統(tǒng)燉煮類肉制品獅子頭貯藏過程中的品質(zhì)變化規(guī)律及其工業(yè)化適應(yīng)性，以低溫獅子頭為研究對象，通過測定感官評分、質(zhì)構(gòu)、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARs）值、羰基含量、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量和高通量測序等研究其冷藏期間的品質(zhì)變化規(guī)律。結(jié)果表明：低溫獅子頭4 ℃冷藏期間感官評分逐漸降低，出現(xiàn)色澤逐漸變暗、產(chǎn)品固有味道逐漸變淡等現(xiàn)象，同時(shí)冷藏期間獅子頭的硬度顯著增加、嫩度降低、內(nèi)聚性略有下降，彈性和咀嚼性則無顯著變化;低溫獅子頭冷藏期間TBARs值、羰基含量和TVB-N含量均明顯升高;隨著冷藏時(shí)間的延長，獅子頭中微生物群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化，微生物多樣性先增加后逐漸降低，冷藏末期獅子頭中的優(yōu)勢菌群為梭狀芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬。

關(guān)鍵詞：低溫獅子頭;高通量測序法;微生物多樣性;菌落結(jié)構(gòu);貯藏品質(zhì)

Abstract： In order to study the quality changes of Chinese large meatballs （a traditional braised dish in China， known in Chinese as Shizitou） during storage and to evaluate its suitability for industrial processing， changes in sensory evaluation， texture profile， thiobarbituric acid reactive substances （TBARs） value， protein carbonyl content and total volatile basic nitrogen （TVB-N） content were determined during chilled storage of low-temperature cooked Shizitou， and high-throughput sequencing technique was employed to analyze changes in microbial diversity and community structure. The sensory evaluation score of Shizitou decreased during storage at 4 ℃; color became darker and intrinsic flavor gradually became weaker. In addition， the hardness significantly increased， tenderness dropped， and cohesiveness decreased slightly. On the other hand， the elasticity and chewiness did not obviously change. TBARs value， carbonyl and TVB-N contents showed a gradual increase with storage time. High-throughput sequencing analysis showed that the microbial flora changed obviously， and microbial diversity initially increased and then decreased. Clostridium and Paenibacillus were the dominant strains at the end of storage.

Keywords： Shizitou; high-throughput sequencing; microbial diversity; microbial flora; storage quality

獅子頭是我國淮揚(yáng)菜系中的一道傳統(tǒng)名菜，由肥肉和瘦肉拌以雞蛋、荸薺或蓮藕、蔥、姜等配料斬成肉糜，制作成拳頭大小的肉丸，經(jīng)炸制或煮制而成[1-2]。獅子頭蛋白質(zhì)、脂肪含量豐富、口感軟嫩，深受消費(fèi)者喜愛。然而，國內(nèi)外學(xué)者對獅子頭的研究大多停留在工藝開發(fā)、保鮮貯藏階段，獅子頭貯藏品質(zhì)劣變機(jī)理及工業(yè)化生產(chǎn)適應(yīng)性等方面的研究卻鮮有報(bào)道。唐建華等[3]采用正交試驗(yàn)法確定清燉獅子頭的最佳工藝，結(jié)果表明，加熱時(shí)間對獅子頭的口感影響較明顯。鮑會梅等[4]通過感官評價(jià)法研究獅子頭制作過程中肥瘦肉比和燉制時(shí)間對其品質(zhì)的影響。周曉燕等[5]探究獅子頭制作過程中的原料配比和加熱時(shí)間，并通過質(zhì)構(gòu)測定明確獅子頭口感與工藝參數(shù)之間的關(guān)系。Turgut等[6]將石榴皮提取物添加到牛肉丸中，研究其在牛肉丸凍藏期間的抗氧化活性，結(jié)果表明，石榴皮提取物能有效抑制脂肪和蛋白質(zhì)氧化。

Akcan等[7]對含有月桂和鼠尾草提取物的乳清蛋白可食用膜對熟肉丸的抗氧化保護(hù)作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，涂抹該可食用膜可延緩熟肉丸凍藏過程中的氧化。上述關(guān)于獅子頭加工工藝及配方的研究對明確獅子頭的主要工藝標(biāo)準(zhǔn)十分必要，但要實(shí)現(xiàn)獅子頭等中華傳統(tǒng)燉煮類肉制品的標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化，對其貯藏期間的品質(zhì)變化規(guī)律進(jìn)行研究也顯得尤為重要。

傳統(tǒng)獅子頭的熟制或經(jīng)油炸或經(jīng)高溫?zé)踔?，致使成品中具有較重過熟味。低溫熟制可以較好地保留其營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味，然而較低的加熱溫度使原料肉以及加工過程中污染的微生物難以徹底被殺滅，造成產(chǎn)品在貯藏、銷售過程中發(fā)生微生物引起的腐敗變質(zhì)[8]。目前，肉制品中微生物及群落多樣性的研究大多為基于傳統(tǒng)培養(yǎng)的菌株鑒定法和免培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)方法?；趥鹘y(tǒng)培養(yǎng)的菌株鑒定法易操作、成本低，但也存在一些突出的缺點(diǎn)，如耗時(shí)長、菌種易污染、靈敏度低，并且對于不可培養(yǎng)的微生物無法鑒定[9]。而分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)則彌補(bǔ)了傳統(tǒng)菌株鑒定法的缺點(diǎn)[10]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，高通量測序技術(shù)因其通量大、靈敏度高和成本低的優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域[11]。高通量測序技術(shù)可對數(shù)百萬個DNA分子同時(shí)測序，根據(jù)16S rRNA基因序列分析特定環(huán)境中微生物群體的構(gòu)成情況或基因的組成以及功能特性[12-13]。Solieri等[14]采用高通量測序?qū)σ獯罄麄鹘y(tǒng)香醋中的酵母菌群進(jìn)行分析測定，獲得香醋中全部酵母菌信息。Aldrete-Tapia等[15]采用高通量測序技術(shù)對墨西哥手工制造干酪中的細(xì)菌菌群多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，研究干酪制作中細(xì)菌群體的變化情況，發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌是其中的優(yōu)勢菌群。

Zhang Qiuqin等[16]采用高通量測序法對含有玫瑰多酚的自然發(fā)酵干香腸中的微生物進(jìn)行研究，結(jié)果表明，玫瑰多酚可選擇性地改變?nèi)樗峋呢S度和生長速率。上述研究結(jié)果表明，高通量測序技術(shù)可用于測定香醋、干酪和香腸等食品中微生物菌落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化，且對于尋找優(yōu)勢微生物種群具有積極作用。

本研究采用低溫熟制方法煮制獅子頭，研究其在冷藏過程中的感官品質(zhì)、質(zhì)構(gòu)、蛋白質(zhì)和脂肪氧化降解情況，并采用Illumina Miseq PE300平臺的高通量測序法對4 ℃條件下冷藏的獅子頭中微生物的多樣性和菌群變化規(guī)律進(jìn)行分析，對于探究獅子頭冷藏期間品質(zhì)劣變機(jī)理、推進(jìn)低溫肉制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后臀尖和背膘 北京順鑫農(nóng)業(yè)鵬程食品分公司。細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒、Taq PCR Master Mix、瓊脂糖 北京博邁德生物技術(shù)有限公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司;FastPfu DNA Polymerase 北京TransGen公司;2%瓊脂糖凝膠?西班牙Biowest公司;其他測試分析用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CI-IF超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)安泰公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;GeneAmp? 9700 PCR儀 美國ABI公司;QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司;5424R冷凍離心機(jī) 德國艾本德股份公司;DZQ400-2D真空包裝機(jī) 上海鼎利輕工機(jī)械制造有限公司;YP-2002電子分析天平 常州市衡正電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 獅子頭的制作

將肥瘦肉分開，分別斬成肉粒（5 mm×5 mm×5 mm），按肥瘦肉質(zhì)量比4∶6分別放入容器中。按肉總質(zhì)量計(jì)，先后將配料食鹽1.6%、淀粉2.5%、荸薺15%、蛋液約10%、醬油2%、料酒2%、白砂糖1%、蔥姜各1%以及冷水10%加入其中，攪拌均勻。取50 g肉餡，將其搓圓后放入85 ℃熱水中加熱，至中心溫度達(dá)到80 ℃后取出，冷卻至室溫后真空包裝。之后85 ℃水浴30 min進(jìn)行二次殺菌，冷卻后置于4 ℃冰箱中貯藏。分別于貯藏0、14、28、35、42、49 d取樣進(jìn)行測定。

1.3.2 獅子頭感官評價(jià)

由8 位經(jīng)過培訓(xùn)的感官評價(jià)人員組成感官評價(jià)小組，從獅子頭的色澤、外觀、氣味和組織狀態(tài)4 個方面進(jìn)行評價(jià)，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。每項(xiàng)分值均為25 分，總分為100 分。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)測定

將獅子頭樣品切成1 cm×1 cm×1 cm的立方塊，對樣品的硬度、內(nèi)聚性、彈性和咀嚼性進(jìn)行測定。質(zhì)構(gòu)儀探頭：P/45;測試前速率3 mm/s，測試速率1 mm/s，測試后速率5 mm/s;循環(huán)次數(shù)：2 次;觸發(fā)類型：自動;觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5.0 g;壓縮樣品高度30%。

1.3.4 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值測定

參照白艷紅[17]的方法測定。稱取10.0 g絞碎的獅子頭樣品，加入50 mL 7.5 g/100 mL三氯乙酸溶液（含0.1 g/100 mL乙二胺四乙酸二鈉），勻漿2 min;吸取5 mL勻漿液與5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液混合均勻，將混合液于沸水浴加熱40 min;待混合液冷卻至室溫后3 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液與5 mL氯仿混勻，靜置10 min后取上清液分別于532、600 nm波長處測定吸光度。TBARs值以每千克肉中丙二醛的含量表示，按下式計(jì)算。

1.3.5 羰基含量測定

參考Armenteros等[18]的方法，并略做修改。稱取1 g獅子頭肉糜樣品，加入10 mL pH 7.4焦磷酸緩沖液（含2.0 mmol/L焦磷酸鈉、10 mmol/L Tris-馬來酸鹽、100 mmol/L氯化鉀、2.0 mmol/L氯化鎂和2.0 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸），4 000 r/min勻漿60 s;取2 份0.1 mL勻漿液分別置于2 mL離心管中，加入1 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，旋渦振蕩30 s后10 000 r/min離心5 min;棄上清，1 組加入1 mL 2 mol/L鹽酸溶液，用于蛋白質(zhì)濃度測定，另1 組加入1 mL 0.2 g/100 mL二硝基苯肼溶液（溶于2 mol/L鹽酸），用于蛋白質(zhì)羰基含量測定;混勻后將2 組混合液于20 ℃水浴振蕩1 h，之后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后10 000 r/min條件下離心5 min;棄去上清液，加入2 mL乙醇-乙酸乙酯混合液（1∶1，V/V），8 000 r/min離心5 min，該步驟重復(fù)2 次;棄去上清液，加入1.5 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5，含6 mol/L鹽酸胍），振蕩混勻;8 000 r/min離心2 min，除去不溶性成分后分別在280 nm和370 nm波長處測定，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度或羰基含量，樣品中每毫克蛋白質(zhì)羰基含量表示為nmol/mg[18]。

1.3.6 總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量測定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[19]中的半微量定氮法。

1.3.7 獅子頭微生物菌群多樣性測定

于無菌環(huán)境中稱取10.0 g不同貯藏時(shí)間獅子頭樣品，加入20 mL無菌生理鹽水（0.85 g/100 mL氯化鈉溶液），混勻后于4 ℃、300 r/min條件下離心5 min，取上清液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀。參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書對待測樣品的DNA進(jìn)行提取，隨后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質(zhì)量。對細(xì)菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，引物為338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和806R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增反應(yīng)體系包括5×FastPfu Buffer 4 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、DNA模板10 ng、正反向引物各0.8 μL和FastPfu Taq酶0.4 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 ?L。PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性3 min后，按照95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s進(jìn)行29 個循環(huán)，最后于72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴(kuò)增合格的產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Illumina Miseq PE300高通量測序平臺對樣品進(jìn)行測序。按97%相似性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，參照Silva 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫，對OTU代表序列進(jìn)行物質(zhì)注釋分析。在此基礎(chǔ)上，使用Mothur程序?qū)?7%相似水平上的OTU代表序列進(jìn)行Alpha多樣性分析，計(jì)算Sobs指數(shù)、反映微生物群落豐度的Chao1、ACE指數(shù)、反映微生物群落多樣性的Simpson、Shannon指數(shù)和反映微生物群落覆蓋率的Coverage指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010和SPSS 16.0等數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著;采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 獅子頭貯藏期間感官評分變化

由圖1可知，貯藏過程中獅子頭的感官評分隨著貯藏時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，由初始的83.19 分下降至貯藏末期的56.81 分。貯藏初期（0～14 d），獅子頭感官評分無顯著變化;當(dāng)貯藏時(shí)間延長至28 d時(shí)，其感官評分顯著下降（P<0.05）。獅子頭4 ℃冷藏過程中，隨著貯藏時(shí)間的延長，產(chǎn)品表現(xiàn)出少許滲油現(xiàn)象，同時(shí)色澤逐漸變暗，產(chǎn)品固有味道逐漸變淡，上述現(xiàn)象可能是獅子頭在較長時(shí)間的貯藏過程中脂肪、蛋白質(zhì)氧化以及微生物共同作用的結(jié)果。

2.2 獅子頭貯藏期間質(zhì)構(gòu)特性變化

由表2可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，獅子頭的硬度顯著增加（P<0.05），嫩度降低，這可能是由于獅子頭經(jīng)真空包裝和二次殺菌后導(dǎo)致汁液流失所致。內(nèi)聚性反映了咀嚼時(shí)樣品抵抗受損并緊密連接使其保持完整的性質(zhì)，揭示了樣品內(nèi)部結(jié)合力的大小。獅子頭的內(nèi)聚性隨著貯藏時(shí)間的延長略有下降，可能是隨著貯藏時(shí)間的延長，獅子頭中肥瘦肉的結(jié)合逐漸變松散，使內(nèi)聚性降低。隨著貯藏時(shí)間的延長，獅子頭彈性和咀嚼性均無顯著變化，可能是由于獅子頭酥軟的特性使其在受到壓力后結(jié)構(gòu)破壞較小，彈性較好。

2.3 獅子頭貯藏期間TBARs值和羰基含量變化

由圖2可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，獅子頭TBARs值和羰基含量均逐漸升高。TBARs值反映的是肉制品中不飽和脂肪酸氧化分解后形成的以丙二醛為代表的次級反應(yīng)產(chǎn)物的量，是評價(jià)肉制品氧化程度的常用指標(biāo)[20]。隨著氧化程度的加深，次級產(chǎn)物不斷增多，使TBARs值不斷升高。貯藏初期（0～28 d），獅子頭TBARs值變化不顯著，從貯藏第28天開始，TBARs值開始顯著升高（P<0.05）;到貯藏末期（42～49 d），TBARs值變化趨緩，但升高趨勢依然顯著（P<0.05），至第49天時(shí)TBARs值為0.46 mg/kg。

蛋白質(zhì)羰基含量的增加是蛋白質(zhì)氧化的主要表現(xiàn)形式，通常將羰基含量作為表示蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)。獅子頭貯藏期間蛋白質(zhì)羰基含量與TBARs值變化情況基本一致。貯藏初期（0～14 d），羰基含量沒有顯著變化，貯藏14～28 d，羰基含量開始顯著增加（P<0.05），這可能是由脂肪氧化誘發(fā)蛋白質(zhì)氧化加速造成的。

2.4 獅子頭貯藏期間TVB-N含量變化

TVB-N是指動物性食品中的蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶及微生物的作用下發(fā)生分解產(chǎn)生的具有揮發(fā)性的氨、伯胺、仲胺和叔胺等低級堿性含氮化合物。由圖3可知，貯藏前期（0～35 d），獅子頭TVB-N含量緩慢升高，貯藏后期（42～49 d）迅速升高，這可能是由于產(chǎn)品在二次殺菌后，殘存的微生物活性不足，對蛋白質(zhì)的分解能力較弱，隨著貯藏時(shí)間的延長，殘存微生物開始大量繁殖，導(dǎo)致獅子頭中的蛋白質(zhì)被較快分解，從而使TVB-N含量快速升高。

2.5 獅子頭中微生物OTU分類及Alpha多樣性分析

采用Illumina Miseq PE300平臺對4 ℃冷藏條件下獅子頭中的微生物16S rRNA的V3～V4區(qū)域進(jìn)行高通量測序。共獲得有效序列數(shù)為302 240，平均有效序列長度為435.67 bp。

由表3可知，貯藏初期，獅子頭中OTU數(shù)為721，冷藏28 d時(shí)升高到1 247，貯藏末期（第49天）時(shí)又降低到678，表明在貯藏過程中微生物種類先增加后逐漸減少，與謝萍[21]對散裝醬鹵鴨肉制品中微生物多樣性和

Zhang Yingtong等[22]對肴肉冷藏過程中微生物群落變化的研究結(jié)果相一致。此外，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的變化趨勢同樣表明，獅子頭貯藏期間微生物多樣性先增加后逐漸下降。覆蓋率均在99.9%以上，表明本次測序結(jié)果可以很好地反映樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的豐度，因此測序結(jié)果能夠比較準(zhǔn)確地反映獅子頭貯藏期間微生物群落的真實(shí)情況。Alpha多樣性指數(shù)測定結(jié)果與OTU結(jié)果相一致，而Chao1指數(shù)略高于OTU值，表明可能樣品中存在一些微生物未被鑒定出來[23]。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是由于低溫殺菌使獅子頭中部分細(xì)菌處于亞致死或芽孢狀態(tài)、細(xì)菌數(shù)量少，未被檢出。隨著貯藏時(shí)間的延長，處于亞致死或芽孢狀態(tài)的細(xì)菌逐漸復(fù)蘇（萌發(fā)）并大量繁殖，使獅子頭中被檢出的微生物多樣性和豐度同時(shí)增加。而隨著貯藏時(shí)間的進(jìn)一步延長，微生物之間進(jìn)行種間競爭，優(yōu)勢微生物豐度進(jìn)一步增加，而另外一些微生物的生長則受到抑制，導(dǎo)致微生物多樣性降低。

2.6 獅子頭中微生物群落組成分析

2.6.1 基于門水平的微生物群落組成分析相對豐度<1%的均按其他分類。圖5同。

由圖4可知，4 ℃條件下貯藏的獅子頭中檢測出的微生物主要為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes）7 種已知菌門。貯藏0 d時(shí)，以厚壁菌門、藍(lán)藻菌門和變形菌門為主，其相對豐度分別為26.6%、31.2%和24.9%。隨著貯藏時(shí)間的延長，獅子頭中厚壁菌門微生物數(shù)量逐漸增加，至貯藏末期（49 d）時(shí)其相對豐度已高達(dá)81.3%，為主要優(yōu)勢菌群。厚壁菌門細(xì)菌為一類具有較強(qiáng)耐熱性的微生物[16]，較低的熟制溫度未能將厚壁菌門微生物全部殺滅，貯藏期間其重新利用營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖。而隨著貯藏時(shí)間的延長，藍(lán)藻菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門相對豐度均逐漸降低，分別降至3.9%、6.3%、5.8%和2.5%。其中，貯藏中期（28 d）出現(xiàn)酸桿菌門和綠彎菌門細(xì)菌，其相對豐度分別為1.8%和2.5%，該時(shí)期微生物種類增多表明此時(shí)期微生物多樣性較高。以上結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長，獅子頭中的微生物主要以厚壁菌門為主，是貯藏末期的優(yōu)勢菌群。

2.6.2 基于屬水平的微生物群落組成分析

由圖5A可知，貯藏初期，獅子頭中屬水平的主要微生物為藍(lán)藻細(xì)菌（Cyanobacteria），但隨著貯藏時(shí)間的延長其相對豐度逐漸下降。除了藍(lán)藻細(xì)菌屬外，貯藏0 d時(shí)，獅子頭中微生物多樣性較高，其主要微生物包括不動桿菌屬（Acinetobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、微球菌屬（Macrococcus），相對豐度分別為9.49%、6.07%和5.36%。貯藏至28 d時(shí)，藍(lán)藻細(xì)菌屬仍然是主要菌群，但是微生物多樣性增加，相對于貯藏0 d時(shí)出現(xiàn)環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、擬桿菌屬（Bacteroides）、庫克菌屬（Kocuria）、紅球菌屬（Rhodococcus）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）等。而貯藏中期（35 d）時(shí)，梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）相對豐度逐漸增多，開始成為獅子頭中占主要地位的微生物菌群，貯藏49 d時(shí)其相對豐度升高至55.76%。而類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）為獅子頭貯藏末期第2位優(yōu)勢菌群，其相對豐度達(dá)到21.10%。

由圖5B可知，貯藏0、14、28、35 d獅子頭的微生物群落結(jié)構(gòu)較為相似，而貯藏42 d和貯藏49 d獅子頭的微生物群落結(jié)構(gòu)更為相似。以上結(jié)果表明，獅子頭在4 ℃貯藏期間，其微生物多樣性在貯藏中期（28 d）達(dá)到最高，而隨著貯藏時(shí)間繼續(xù)延長，其微生物多樣性降低，貯藏末期其主要優(yōu)勢菌群為梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。

本研究制作的獅子頭冷藏過程中存在的細(xì)菌主要為嗜冷菌，如黃桿菌屬、變形桿菌屬、不動桿菌屬、莫拉氏菌屬等，均為肉類中常見的腐敗菌屬。貯藏后期（35～49 d），獅子頭中的優(yōu)勢菌群為梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），這2 種微生物是肉類中常見腐敗菌，其芽孢比較耐熱，其中梭狀芽孢桿菌100 ℃煮沸1 h仍能存活，而類芽孢桿菌屬是芽孢桿菌的分支，芽孢桿菌的孢子100 ℃加熱3 h才可被殺死。本研究中，獅子頭制作過程熟制溫度和二次殺菌溫度均為85 ℃，不能將梭狀芽孢桿菌和類芽孢桿菌孢子全部殺滅，貯藏后芽孢逐漸萌發(fā)并進(jìn)一步生長繁殖成為優(yōu)勢菌。Cousin[24]、Walker[25]等發(fā)現(xiàn)，梭狀芽孢桿菌屬在溫度較低時(shí)生長較慢，但是當(dāng)溫度稍高時(shí)，其生長代謝可以產(chǎn)生氣體，從而使產(chǎn)品有一種硬干酪成熟時(shí)的后熟味。Dainty[26]、Lawson[27]等研究發(fā)現(xiàn)，梭狀芽孢桿菌可以使真空包裝的肉、魚和真空烹調(diào)過的牛肉腐敗。類芽孢桿菌屬是芽孢桿菌屬的分支，1993年將類芽孢桿菌屬從芽孢桿菌屬中分離出來[28-29]。類芽孢桿菌屬的孢子可在極端條件下存活，高溫、壓力、生物殺菌劑和紫外線照射都不能將其完全殺滅，且由于菌株含冷適應(yīng)相關(guān)蛋白，因此即使在低溫條件下類芽孢桿菌仍能較好地生長[30-31]，該特性可能是獅子頭貯藏后期類芽孢桿菌屬相對豐度較高的原因。

3 結(jié) 論

低溫獅子頭在冷藏期間硬度顯著增加、嫩度和內(nèi)聚性下降，脂肪和蛋白質(zhì)也出現(xiàn)明顯的氧化。貯藏初期，獅子頭中微生物種類較多，隨著貯藏時(shí)間延長，微生物種類有所降低;貯藏末期，優(yōu)勢微生物主要為梭狀芽孢桿菌屬（55.76%）和類芽孢桿菌屬（21.10%）。微生物的生長繁殖加速了獅子頭中蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的降解，同時(shí)降解的營養(yǎng)物質(zhì)也進(jìn)一步促進(jìn)了微生物生長。因而，微生物的生長繁殖及脂肪、蛋白質(zhì)的氧化降解共同導(dǎo)致獅子頭貯藏期間感官評分逐漸降低，出現(xiàn)色澤逐漸變暗、產(chǎn)品固有味道逐漸變淡等現(xiàn)象。因此，如何控制耐熱性的梭狀芽孢桿菌和類芽孢桿菌的生長、提高低溫殺菌獅子頭和其他低溫殺菌肉制品的安全性，將是今后的研究重點(diǎn)。本研究結(jié)果對于中華傳統(tǒng)獅子頭的工業(yè)化生產(chǎn)具有借鑒意義。

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