鴨骨骼肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的制備及其特性

劉靜靜 張靜 孫勁沖 吳萌 杜順豐 李春生

摘 要：提取鴨骨骼肌肌鈣蛋白I（skeletal muscle troponin I，sTnI）用于制備單克隆抗體，并對抗體性能進(jìn)行評價。將鴨骨骼肌提取后經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）測定，取凝膠條帶免疫小鼠，融合后經(jīng)篩選獲得分泌抗鴨sTnI的雜交瘤細(xì)胞株，用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測抗體效價、亞型及特異性等特性。結(jié)果表明：鴨骨骼肌提取物經(jīng)SDS-PAGE后出現(xiàn)2 條顏色較深的條帶，取分子質(zhì)量24 kDa條帶用于免疫;篩選后獲得2 株單克隆抗體，其中3E7特異性較好，效價在1∶1.0×105以上，為IgG1亞型，親和常數(shù)（Ka）為5.9×105 L/mol;免疫印跡結(jié)果顯示，抗體3E7能與鴨骨骼肌提取物反應(yīng)，與牛、羊、雞、魚骨骼肌提取物無明顯反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：鴨骨骼肌肌鈣蛋白I;單克隆抗體;肉類來源;免疫學(xué)鑒別;特異性

Abstract： A monoclonal antibody （mAb） against duck skeletal muscle troponin I （sTnI） was prepared and its characteristics were evaluated. sTnI was analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis （SDS-PAGE）. The protein band was excised from the gel and used to immunize mice. Hybridoma cell strains stably secreting mAb were obtained by fusion. The titer， subtype and specificity of monoclonal antibodies were analyzed by enzyme linked immunosorbent assay. The SDS-PAGE showed 2 dark bands. The 24 kDa protein was selected for immunization. Two cell lines that secreted monoclonal antibody against sTnI were obtained after screening， with 3E7 being the one with higher specificity. It belonged to the IgG1 subtype， its titer was 1：1.0 × 105 and its affinity constant was 5.9 × 105 L/mol. Western blot results showed that 3E7 reacted with duck skeletal muscle extracts from duck， but not bovine， sheep， chicken and fish skeletal muscle extracts.

Keywords： duck skeletal muscle troponin I; monoclonal antibody; meat sources; immunological identification; specificity

肉類食品在人類飲食結(jié)構(gòu)中占據(jù)至關(guān)重要的位置。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國肉類食品消費(fèi)逐年增加，相關(guān)的食品安全問題日益凸顯，引起政府和社會各界的高度重視[1-2]。2013年爆發(fā)的“馬肉風(fēng)波”曾經(jīng)使多個歐洲國家卷入丑聞，引起消費(fèi)者反感[3]。在肉類食品加工過程中，不法商販為了賺取更高利潤，常以質(zhì)量差、價格低的肉類冒充優(yōu)質(zhì)高價肉類[4-5]。因飼養(yǎng)周期短、價格低，鴨肉常作為牛羊肉摻假的原材料[6-7]，這種摻假行為損害了消費(fèi)者利益，擾亂了市場規(guī)則[8-9]。因此，研究摻假牛羊肉的快速檢測方法至關(guān)重要。肉類食品的鑒別方法主要有感官鑒別、核酸擴(kuò)增技術(shù)、理化方法和免疫學(xué)方法[10-13]。感官方法主要是通過視覺、嗅覺、味覺和觸覺對肉類進(jìn)行鑒別，主觀性較強(qiáng)，不能滿足檢測要求[14-15]。核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測結(jié)果準(zhǔn)確性較高，是目前國際上檢測肉類食品摻假的主流方法[16-18]，該技術(shù)對操作人員的要求較高，所用儀器價格昂貴，不適合基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用和現(xiàn)場快速檢測[19-20]。電子鼻結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測摻假肉類有一定的準(zhǔn)確性[21-22]，但需要檢測多種揮發(fā)性物質(zhì)，操作過程和結(jié)果處理均較為繁瑣。免疫學(xué)檢測技術(shù)是基于抗原抗體的特異性結(jié)合捕獲待檢物質(zhì)，以酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法應(yīng)用最為廣泛[23]，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，常作為快速篩查手段[24-25]。幾種方法具有各自的特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中常將不同技術(shù)聯(lián)合使用，以達(dá)到檢測目的。ELISA方法適合現(xiàn)場快速檢測，但是在肉類食品加工過程中，其蛋白質(zhì)成分會發(fā)生變性，因此抗原的熱穩(wěn)定性至關(guān)重要[26-27]。

骨骼肌肌鈣蛋白I（skeletal muscle troponin I，sTnI）具有較高的特異性和熱穩(wěn)定性，是理想的抗原之一[28-29]。

Liu Lihua等[30]以豬sTnI為抗原制備單克隆抗體，利用夾心ELISA法能夠檢出雞肉和牛肉中0.05%和0.10%的豬肉成分，并可以檢出大豆飼料中經(jīng)過高溫處理的豬肉成分。本研究將鴨骨骼肌經(jīng)煮沸提取、電泳得到sTnI條帶，并制備其特異性單克隆抗體，對抗體性能進(jìn)行評價，為鴨肉免疫學(xué)鑒定方法的建立和檢測產(chǎn)品的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide，SDS）、三羥甲基氨基甲烷、聚乙二醇、HAT培養(yǎng)基（50×）Hybri-MaxTM、HT培養(yǎng)基（50×）Hybri-MaxTM、免疫球蛋白亞型試劑盒 美國Sigma公司;細(xì)胞培養(yǎng)板、DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco公司;辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG） 北京中杉金橋生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

BALB/c小鼠 河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 儀器與設(shè)備

4710超聲破碎儀 美國Cole-Parmer儀器公司;Heraus Multifuge高速冷凍離心機(jī)、ND2000超微量核酸蛋白測定儀、1510酶標(biāo)儀 德國Thermo公司;MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;SW-CJ-2FD凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;CKX41SF倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原的提取及鑒定

取鴨骨骼肌，去除脂肪和結(jié)締組織，研磨混勻，稱取20 g，加入0.15 mol/L NaCl溶液（1∶2，m/V），渦旋混勻后，超聲提取5 min（100 W），煮沸20 min后，5 000×g離心20 min;去除沉淀，取上清過濾后作為檢測原。另取20 g研磨后的鴨骨骼肌，按照上述方法處理，離心后取上清于121 ℃高壓處理30 min，5 000×g離心30 min;上清用Whatman 1號濾紙過濾，濾液加入90%乙醇（1∶3.74，V/V），靜置2 h;混合液7 000×g離心20 min，取沉淀烘干，為免疫原提取物[27]。選擇12%分離膠、5%濃縮膠，對抗原進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）鑒定，將含有目的條帶的電泳膠加生理鹽水研磨后用于免疫[31]。

1.3.2 動物免疫及雜交瘤細(xì)胞株制備

向研磨后的電泳膠中加入等體積佐劑免疫BALB/c小鼠，頸背部多點(diǎn)注射，1 次電泳免疫3 只小鼠，每2 周免疫1 次，第3次免疫后7～10 d斷尾取血，分離血清，間接ELISA方法檢測血清抗體效價。選取血清效價最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合[31]。融合后置于HAT培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10～12 d后換用HT培養(yǎng)基，用間接ELISA方法檢測。檢測結(jié)果為陽性的孔，挑選吸光度較高、狀態(tài)較好的細(xì)胞，通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，直至得到分泌單一抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

1.3.3 單克隆抗體制備

將獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，并分別進(jìn)行凍存和制備腹水。BALB/c小鼠腹腔注射石蠟油7 d后，于腹腔注射雜交瘤細(xì)胞約106 個，7～10 d后待腹部膨大抽取腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀方法[31]純化，得到單克隆抗體。

1.3.4 單克隆抗體效價測定

采用間接ELISA法[32]進(jìn)行效價測定，具體步驟如下：將質(zhì)量濃度為5 μg/mL的檢測原加入96 孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜;以含體積分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）作為洗液，洗滌3 次，每次用量300 mL，拍干（下同）;每孔加入含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的洗液200 μL，37 ℃孵育2 h，洗滌、拍干;將單克隆抗體以1∶200、1∶400、1∶800…倍比稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃孵育45 min，洗滌、拍干;每孔加入100 μL稀釋10 000 倍的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min，洗滌、拍干;每孔加入顯色液100 μL，37 ℃避光反應(yīng)15 min;每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng);450 nm波長處測定吸光度（A）。

陰性對照孔吸光度為A1，各待測陽性孔吸光度為A2，以A2/A1≥2.1作為效價測定結(jié)果。

1.3.5 單克隆抗體亞型測定

按免疫球蛋白亞型試劑盒說明書步驟進(jìn)行測定。

1.3.6 單克隆抗體特異性測定

分別包被牛、羊、雞、鴨、魚骨骼肌提取物，用間接ELISA方法測定單克隆抗體與不同骨骼肌提取物的效價。測定方法同1.3.4節(jié)，提取物制備方法與檢測原提取方法相同。

1.3.7 免疫印跡

參考康潔[31]的方法，SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，經(jīng)封閉、洗膜，孵育一抗、二抗，顯色后拍照。

1.3.8 單克隆抗體親和力測定

以4 個不同質(zhì)量濃度（1、0.5、0.25、0.125 μg/mL）檢測原進(jìn)行包被，將純化的單克隆抗體倍比稀釋，用Batty飽和法[23]進(jìn)行測定。以抗體質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的A450 nm為縱坐標(biāo)，繪制“S”型曲線。按下式計(jì)算親和常數(shù)（Ka）。

式中：ρ為當(dāng)檢測原質(zhì)量濃度為a時，吸光度最高值的50%所對應(yīng)的抗體質(zhì)量濃度/（μg/mL）;ρ為當(dāng)檢測原質(zhì)量濃度為b時，吸光度最高值的50%所對應(yīng)的抗體質(zhì)量濃度/（μg/mL）;a=nb，n為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Gradpad作圖軟件、Excel軟件、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原的提取

對鴨骨骼肌進(jìn)行提取后，經(jīng)烘干得到固體免疫原提取物99.5 mg，得率為0.5%。用超微量核酸蛋白測定儀測得檢測原質(zhì)量濃度為8.2 mg/mL。

2.2 抗原SDS-PAGE鑒定結(jié)果

泳道1. 免疫原提取物;泳道2. 檢測原。

由圖1可知，帶形清晰、顏色較深的條帶有2 條，對應(yīng)的分子質(zhì)量約為37、24 kDa，與文獻(xiàn)[31]報(bào)道的骨骼肌TnT、TnI亞基相符，證明提取物是鴨TnI。選取分子質(zhì)量24 kDa的sTnI用于免疫。

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的篩選

經(jīng)過3～4 次亞克隆，篩選出分泌抗鴨sTnI單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株2 株，與其分泌的單克隆抗體均分別命名為3E7、4D3。2 株陽性雜交瘤細(xì)胞株誘導(dǎo)的腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀，用超微量核酸蛋白測定儀測得其蛋白質(zhì)量濃度分別為6.6、7.9 mg/mL，表示抗鴨sTnI單克隆抗體制備成功。

2.4 單克隆抗體效價測定結(jié)果

2.5 單克隆抗體亞型測定結(jié)果

采用間接ELISA方法測定2 株單克隆抗體的亞型。雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體與不同亞型的抗體顯色有明顯差異，3E7、4D3均與IgG1抗體反應(yīng)的A450 nm最高，與IgM抗體反應(yīng)的A450 nm較低，約為0.25，而與IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA的反應(yīng)均為陰性，因此3E7、4D3分泌的抗體類型為IgG1。

2.6 單克隆抗體特異性測定

由圖2可知：3E7與鴨骨骼肌提取物反應(yīng)效價達(dá)1∶1.02×105，與羊骨骼肌提取物反應(yīng)效價為1∶1.28×104，與牛、雞、魚骨骼肌提取物反應(yīng)效價均在1∶1.00×104以下;4D3與羊、雞、鴨骨骼肌提取物反應(yīng)效價為1∶1.28×104，與牛、魚骨骼肌提取物反應(yīng)效價均在1∶1.0×104以下。綜合評價得出，3E7效價較高、特異性較好，將其用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.7 單克隆抗體免疫印跡

由圖3可知，3E7分別與轉(zhuǎn)印有牛、羊、雞、鴨、魚骨骼肌提取物的聚偏二氟乙烯膜反應(yīng)，顯色后在鴨骨骼肌提取物的24 kDa條帶位置出現(xiàn)單一條帶，與牛、羊骨骼肌提取物有輕微反應(yīng)，但條帶顯色與鴨骨骼肌提取物相比明顯較淺，與雞、魚骨骼肌提取物無明顯反應(yīng)，初步證實(shí)3E7能結(jié)合鴨骨骼肌提取物，主要結(jié)合sTnI亞基，與雞、魚骨骼肌提取物無明顯交叉，與牛、羊骨骼肌提取物部分交叉。

2.8 單克隆抗體親和力測定結(jié)果

3 結(jié) 論

將鴨骨骼肌經(jīng)過粗提，免疫小鼠后進(jìn)行融合，篩選高效價、高特異性的細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，最后獲得穩(wěn)定分泌抗鴨sTnI單克隆抗體的細(xì)胞株2 株。通過小鼠體內(nèi)誘生腹水，用辛酸-硫酸銨沉淀方法進(jìn)行純化，得到單克隆抗體。經(jīng)過鑒定，單抗3E7效價高，與雞、魚骨骼肌提取物無交叉反應(yīng)，亞型為IgG1型，Ka為5.9×105 L/mol。免疫印跡結(jié)果顯示，單抗3E7能夠區(qū)分鴨骨骼肌提取物和牛、羊、雞、魚骨骼肌提取物，在24 kDa處顯色，證明單抗3E7是抗鴨sTnI的抗體，且可以用于區(qū)分鴨骨骼肌組織與牛、羊、雞、魚骨骼肌組織。本研究結(jié)果能夠?yàn)槭称分续喨庠葱猿煞置庖邔W(xué)鑒別方法的建立提供參考。

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