金銀花提取物對冷卻肉中假單胞菌黏附性的影響

王琳 李宇軒 范維 李賀楠 高曉月 陳淑敏

摘 要：研究冷卻肉中假單胞菌的黏附能力及金銀花提取物的降黏附效果。結(jié)果表明：從15 份市售冷卻肉中分離得到46 株假單胞菌，經(jīng)16S rDNA結(jié)合VITEK 2系統(tǒng)鑒定為惡臭假單胞菌22 株，占47.8%;熒光假單胞菌10 株，占21.7%;銅綠假單胞菌6 株，占13.0%;淺黃假單胞菌8 株，占17.4%;33 株（71.7%）假單胞菌具有黏附能力，具有強黏附能力的菌株占17.4%，其中惡臭假單胞菌數(shù)量最多;金銀花提取物能夠降低4 種假單胞菌的黏附能力，且對惡臭假單胞菌5-3和銅綠假單胞菌5-1作用效果更強，作用效果與金銀花提取物質(zhì)量濃度有關(guān);金銀花提取物質(zhì)量濃度高于最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）時，主要通過抑制菌體生長、減少胞外多糖產(chǎn)生而降低假單胞菌的黏附能力;金銀花提取物質(zhì)量濃度低于MIC時，主要通過溶解菌體胞外多糖、增強通透性、降低均勻度而降低假單胞菌的黏附能力。

關(guān)鍵詞：冷卻肉;假單胞菌;黏附能力;金銀花提取物

Abstract： The adhesion ability of Pseudomonas strains from chilled pork and the inhibitory effect of Flos Lonicerae Japonicae extract on it was analyzed in this study. A total of 46 strains of Pseudomonas strains were isolated from 15 commercial chilled pork samples， including 22 strains of Pseudomonas putida （47.8%）， 10 strains of Pseudomonas fluorescens （21.7%）， 6 strains of Pseudomonas aeruginosa （13.0%）， and 8 strains of Pseudomonas luteola （17.4%）， as identified by 16S rDNA sequence analysis and VITEK 2 system. In total 33 （71.7%） of them were found to have adhesion ability， 17.4% of which had strong adhesion ability， mostly Pseudomonas putida. Flos Lonicerae Japonicae extract could reduce the adhesion ability of the four Pseudomonas species， and had stronger effect on P. putida 5-3 and P. aeruginosa 5-1?in a concentration-dependent manner. At concentrations higher than the minimum inhibitory concentration （MIC）， it excerted its effect mainly by inhibiting the growth of bacteria and reducing the production of extracellular polysaccharides. At concentrations lower than the MIC， its excerted its effect mainly by dissolving extracellular polysaccharides， consequently increasing the membrane permeability and reducing uniformity.

Keywords： chilled pork; Pseudomonas; adhesion ability; Flos Lonicerae Japonicae extract

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）02-0020-07

目前，人們對致病菌在食品上的黏附特性研究較多，對腐敗菌在食品上的黏附特性及黏附的控制方法研究較少[5]，研究冷卻肉中假單胞菌的黏附能力及控制方法對冷卻肉保鮮具有重要意義。

黏附能力的形成與菌體分泌胞外多糖有關(guān)，胞外多糖能夠與水、蛋白質(zhì)、脂類形成膜狀結(jié)構(gòu)，包裹在菌體外層，增加菌體耐藥性和抗脅迫能力[6]。雖然黏附能力是在特定初始菌濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間[7-8]、培養(yǎng)基質(zhì)和表面材質(zhì)[9-10]等研究體系中測得，但與胞外多糖的差異性表達及菌株基因型存在相關(guān)性[11-12]，是菌株自身的固有屬性[13]。

植物提取物中含有多糖類活性物質(zhì)，可通過結(jié)合多糖基質(zhì)降低菌群的黏附能力，且能夠通過熒光顯微鏡直接觀察到[14-15]。植物提取物對菌體黏附能力的作用效果也與菌株類型、生長狀態(tài)、多糖物質(zhì)組成和含量有關(guān)。金銀花是一種較為常見的中藥材，具有抑菌[16]、抗炎[17]、抗內(nèi)毒素等藥理作用[18]。金銀花早在2012年就被原國家衛(wèi)生和計劃生育委員會批準作為藥食同源食品原料，研究金銀花提取物對冷卻肉中假單胞菌黏附能力的作用與機理，有助于拓寬新資源食品應用范圍，也能夠為冷卻肉保鮮提供理論支持。

微生物引起的食品安全事件多與其黏附能力有關(guān)[19-20]。

本研究從15 份市售冷卻肉中分離假單胞菌并對其進行鑒定，利用微孔板法測定菌株黏附能力，研究冷卻肉中假單胞菌的類型及黏附能力，并研究金銀花提取物對假單胞菌黏附能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷卻肉購自北京大型超市和農(nóng)貿(mào)市場，采購信息如表1所示。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、氧化酶試劑 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;假單胞菌顯色培養(yǎng)基 法國科瑪嘉公司;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司;異硫氰酸熒光素標記刀豆蛋白A（fluoresce inisothiocyanate-conjugated concanavalin A，F(xiàn)ITC-conA） 美國Sigma公司;金銀花提取物粉末 南京澤朗生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BPC-150F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;MULTISKAN GO 1510酶標儀 美國Thermo公司;BH2顯微鏡、BX 51熒光顯微鏡 日本Olympus公司;MQD-S2R恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司;VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng) 生物梅里埃（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冷卻肉中假單胞菌的分離

多點取樣，共取25 g冷卻肉樣品，加入225 mL無菌生理鹽水，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min ，取200 μL稀釋液涂布至假單胞菌顯色培養(yǎng)基，（30±1） ℃培養(yǎng)48 h。挑取單菌落劃線至假單胞菌顯色培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h。將藍綠色菌落在營養(yǎng)瓊脂平板上進行3 次劃線分離純化，用LB培養(yǎng)基過夜活化單菌落，4 000 r/min離心10 min，用無菌生理鹽水重懸菌株，加入體積分數(shù)20%甘油，菌株于-80 ℃冷凍保存[21]。

1.3.2 菌株鑒定

將篩選出的菌株進行革蘭氏染色、形態(tài)觀察和氧化酶實驗，將鑒定結(jié)果為假單胞菌屬的菌株用16S rDNA進行確證。引物由深圳華大基因科技有限公司合成。上游引物（27F）：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;下游引物（1492R）：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3;以細菌總DNA為模板進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min;30 個循環(huán);72 ℃保溫5 min。PCR產(chǎn)物送深圳華大基因科技有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進行Blast比對，用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22]，利用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)作進一步鑒定[23]。

1.3.3 假單胞菌黏附能力測定

將2 次過夜活化的菌懸液在600 nm波長處的光密度（optical density，OD600 nm）調(diào)整至0.5，移取5 μL菌懸液至含有195 μL TSB培養(yǎng)基的96 孔酶標板中，每株菌做6 個平行，以加入5 μL無菌生理鹽水作空白對照;將上述96 孔板在（30±1）℃條件下培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水清洗孔板3 次去除浮游菌，用200 μL甲醇固定15 min，吸出甲醇并晾干;每孔加入200 μL 1 g/mL草酸銨結(jié)晶紫溶液染色5 min，吸出染液后用流水沖洗孔板至滴水無色;將孔板自然晾干后每孔加入200 μL體積分數(shù)33%乙酸，用酶標儀測定OD655 nm[24-25]。

OD655 nm反映菌株與接觸表面的黏附程度，依據(jù)臨界OD655 nm（ODc）對黏附能力進行分類，表示為相對形成單元（relative forming unit，RU）。RU按式（1）計算。

1.3.4 金銀花提取物對假單胞菌黏附能力的影響

參考Andreia[28]、劉永吉[29]等的方法，利用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。將195 μL用TSB培養(yǎng)基稀釋的金銀花提取物溶液加入到96 孔板中，金銀花提取物質(zhì)量濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195 mg/mL，再分別接種5 μL OD600 nm=0.5的菌懸液。以接菌但不含金銀花提取物的TSB培養(yǎng)基作培養(yǎng)基對照，以不接菌的無菌生理鹽水作空白對照。30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。通過觀察判斷，以明顯不長菌的孔對應的金銀花提取物溶液質(zhì)量濃度為MIC。在MIC實驗基礎上選擇所有澄清的孔，將其培養(yǎng)液稀釋100 倍后取0.2 mL涂布于假單胞菌顯色培養(yǎng)基瓊脂平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，最小殺菌質(zhì)量濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）為菌落數(shù)不超過5的孔對應質(zhì)量濃度中的最低質(zhì)量濃度[30]。

根據(jù)測得的MIC，用TSB液體培養(yǎng)基稀釋金銀花提取物溶液至以下質(zhì)量濃度：1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC、64×MIC、128×MIC，分別取200 μL不同質(zhì)量濃度金銀花提取物溶液加入到96 孔板，每個質(zhì)量濃度重復8 孔。以等體積不含金銀花提取物的TSB培養(yǎng)基為對照，30 ℃培養(yǎng)24 h。按照1.3.3節(jié)的方法測定菌株黏附能力，并按式（2）計算清除率。

1.3.5 熒光顯微鏡表觀成像檢測

在24 孔板中每孔放1 個無菌蓋玻片（直徑15 mm），加入1 mL TSB培養(yǎng)基。實驗孔每孔加入5 μL OD600 nm=0.5的菌懸液，30 ℃培養(yǎng)24 h;將菌液吸出，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗孔板3 次后，分別添加1 mL金銀花提取物質(zhì)量濃度為50、25、12.5、6.25、0 mg/mL的TSB培養(yǎng)基;以不接菌但加入金銀花提取物的TSB培養(yǎng)基作對照，每組3 個復孔。再將24 孔板置于30 ℃培養(yǎng)24 h;吸出菌液，用PBS清洗孔板3 次，每次3～5 min;加入2.5 g/100 mL戊二醛溶液1 mL，固定2 h后再用PBS清洗孔板3 次;從玻片邊緣吸干水分，在玻片上滴加50 μg/mL的FITC-ConA，置于4 ℃避光染色30 min后，用熒光顯微鏡獲取圖像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 7.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷卻肉中假單胞菌的鑒定

將顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍綠色的菌落進行氧化酶實驗和革蘭氏染色。結(jié)果表明，氧化酶實驗呈陽性的革蘭氏陰性桿菌共46 株，16S rDNA鑒定結(jié)果均為假單胞菌屬。假單胞菌屬中的不同種間相似性較大，簡單的生理生化和16S rDNA鑒定難以確定菌株所屬的種。VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)是根據(jù)生化反應結(jié)果與庫中標準菌株進行比對[31-32]。

由表2可知，46 株假單胞菌中包括惡臭假單胞菌22 株，占47.8%;熒光假單胞菌10 株，占21.7%;淺黃假單胞菌8 株，占17.4%;銅綠假單胞菌6 株，占13.0%。VITEK 2鑒定結(jié)果是由儀器根據(jù)生化反應的真實性作出判斷，菌株的實測生化反應與假單胞菌屬的典型反應符合度均在85%以上，結(jié)果可信度較高。

2.2 冷卻肉中假單胞菌的黏附能力測定結(jié)果

46 株假單胞菌中，33 株具有黏附能力，占71.7%。根據(jù)鑒定結(jié)果將菌株以菌種名稱+菌株編號命名。由表3可知：具有黏附能力的33 株假單胞菌中，惡臭假單胞菌共17 株，具有強黏附能力的3 株為Pse. putida 2-4、Pse. putida 3-7、Pse. putida 5-3;淺黃假單胞菌共5 株，具有強黏附能力的2 株為Pse. luteola 8-4、Pse. luteola 7-6;銅綠假單胞菌共4 株，僅1 株（Pse.aeruginosa 5-1）具有強黏附能力;熒光假單胞菌共7 株，具有強黏附能力的2 株為Pse. fluorescens 3-2、Pse. fluorescens 10-3。從4 種類型假單胞菌中各選擇1 株用于后續(xù)研究。

由表4可知：在具有黏附能力的33 株假單胞菌中，具有強黏附能力的菌株占17.4%，具有中等黏附能力的菌株占43.5%，具有弱黏附能力的菌株占10.9%;在具有黏附能力的菌株中，惡臭假單胞菌數(shù)量最多，占37.0%、淺黃假單胞菌占10.9%、銅綠假單胞菌占8.7%、熒光假單胞菌占15.2%，因此，惡臭假單胞菌對黏附能力貢獻最大，后期應重點對其進行研究。

2.3 金銀花提取物對假單胞菌黏附能力的影響

由表5～6可知，冷卻肉中的假單胞菌對金銀花提取物均具有敏感性。質(zhì)量濃度12.5 mg/mL金銀花提取物可以很好地抑制Pse. luteola 8-4和Pse. aeruginosa 5-1生長，質(zhì)量濃度25 mg/mL金銀花提取物能抑制4 種假單胞菌生長，金銀花提取物對Pse. luteola 8-4和Pse. aeruginosa 5-1的MIC為12.5 mg/mL，對Pse. putida 5-3和Pse. fluorescens 3-2的MIC為25 mg/mL。金銀花提取物對Pse. putida 5-3和Pse. aeruginosa 5-1的MBC為50 mg/mL，對Pse. luteola 8-4和Pse. fluorescens 3-2的MBC為25 mg/mL。因此，一定質(zhì)量濃度的金銀花提取物對4 種假單胞菌具有殺菌抑制效果。

在低于MIC的亞抑菌質(zhì)量濃度條件下進行金銀花提取物對上述4 種假單胞菌黏附能力的清除實驗。

由圖1可知，金銀花提取物具有降低假單胞菌黏附能力的效果。隨著金銀花提取物質(zhì)量濃度的增加，冷卻肉中4 種假單胞菌的RU均逐漸降低。在金銀花提取物質(zhì)量濃度為MIC時，其對Pse. putida 5-3和Pse. aeruginosa 5-1的清除率均高于80%，且金銀花提取物對Pse. putida 5-3和Pse. aeruginosa 5-1的作用效果強于Pse. luteola 8-4和Pse. fluorescens 3-2。

2.4 熒光顯微鏡法觀察金銀花提取物對假單胞菌生物被膜的作用

熒光染料FITC標記的ConA與細菌的胞外多糖特異結(jié)合并呈綠色熒光，熒光信號的強弱與多糖黏附量有關(guān)，多糖黏附量增加，熒光信號積累增強。利用熒光顯微鏡檢測金銀花提取物作用下Pse. putida 5-3和Pse. aeruginosa 5-1的胞外多糖。由圖2～3可知：未添加金銀花提取物的TSB培養(yǎng)基中生長的菌體堆積形成褶皺、溝壑狀立體結(jié)構(gòu);隨著金銀花提取物質(zhì)量濃度增加，熒光圖像通透性增加，表現(xiàn)為溝壑狀結(jié)構(gòu)消失，褶皺逐漸減少。圖像明顯變亮表明多糖黏附量增加，與2.3節(jié)中得出的結(jié)論一致，因此熒光顯微鏡觀察能夠直觀驗證2.3節(jié)通過測定數(shù)值得出的結(jié)論，金銀花提取物能夠降低冷卻肉中假單胞菌的黏附能力。

A. 50 mg/mL金銀花提取物;B. 25 mg/mL金銀花提取物;C. 12.5 mg/mL金銀花提取物;D. 6.25 mg/mL金銀花提取物;E. TSB培養(yǎng)基。圖3同。

金銀花提取物降低假單胞菌黏附能力的作用機制也能夠通過熒光顯微鏡觀察結(jié)果體現(xiàn)。在金銀花提取物質(zhì)量濃度為MIC（Pse. putida 5-3為25 mg/mL、Pse. aeruginosa 5-1為12.5 mg/mL）時，Pse. putida 5-3和Pse. aeruginosa 5-1菌體生長受到抑制，無法聚集黏附。在金銀花提取物質(zhì)量濃度50 mg/mL條件下，菌體產(chǎn)生的熒光信號很弱，菌體分泌胞外多糖均較少，僅可見零散分布的少數(shù)菌體，因此該質(zhì)量濃度條件下金銀花提取物對菌體生長具有明顯抑制作用，這與2 種菌MBC為50 mg/mL的測定結(jié)果一致。金銀花提取物質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，Pse. aeruginosa 5-1表面形成大范圍聚集，但未見立體結(jié)構(gòu)，而Pse. putida 5-3未見明顯聚集，金銀花提取物質(zhì)量濃度12.5 mg/mL時才形成明顯聚集。在金銀花提取物質(zhì)量濃度6.25 mg/mL條件下，菌體大量黏連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且堆積形成溝壑。

在高于金銀花提取物對Pse. putida 5-3的MIC時（圖2A），金銀花提取物對Pse. putida 5-3的作用主要是通過抑制菌體生長而降低菌體黏附能力;在低于金銀花提取物對Pse. putida 5-3的MIC時（圖2C、2D），金銀花提取物質(zhì)量濃度降低導致菌體黏連堆積而成的結(jié)構(gòu)立體性增強。金銀花提取物對Pse. aeruginosa 5-1的作用效果也具有相似規(guī)律，高質(zhì)量濃度金銀花提取物抑制菌體生長，隨金銀花提取物質(zhì)量濃度降低，其對菌體的抑制作用減弱。從MIC（12.5 mg/mL）開始，金銀花提取物的作用體現(xiàn)在影響Pse. aeruginosa 5-1黏連堆積形成的立體結(jié)構(gòu)，對菌體生長的抑制效果較微弱。菌體能夠黏連堆積主要是由于多糖的存在，而金銀花提取物的主要功能性成分是綠原酸等多糖，因此能夠產(chǎn)生相似相溶作用，導致胞外多糖分布均勻度降低、改變胞外多糖通透性，從而減少菌體黏附聚集，降低黏附能力。

3 結(jié) 論

鑒定冷卻肉中惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌和淺黃假單胞菌等46 株菌，通過臨界OD值法確定具有黏附能力的菌株占總數(shù)的71.7%，具有強黏附能力的菌株占總數(shù)的17.4%，其中惡臭假單胞菌黏附能力最強，能夠為冷卻肉保鮮提供理論支持。本研究結(jié)果證明金銀花提取物可明顯降低Pse. putida 5-3和Pse. aeruginosa 5-1的黏附能力，其作用效果與金銀花提取物質(zhì)量濃度有關(guān)，并從表觀成像的角度闡釋金銀花提取物影響假單胞菌黏附能力的作用機制，為研究開發(fā)應用于肉制品保鮮的植物資源提供新思路。

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