DPA-Zn金屬陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成及其DNA相互作用研究

阿地力江·阿不力米提，易文婧，趙志剛

(西南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境保護(hù)工程學(xué)院，四川 成都 610041)

基因治療為癌癥等重大疾病的治療提供了一條富有潛力的新途徑。發(fā)展安全和高效的基因傳遞載體是基因治療的關(guān)鍵所在[1]。陽(yáng)離子脂質(zhì)是一類重要的非病毒基因載體[2]，其結(jié)構(gòu)主要由陽(yáng)離子極性頭部，疏水尾部以及這兩個(gè)部分之間的連接鍵三部分組成。陽(yáng)離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)可通過(guò)靜電作用與核酸中帶負(fù)電荷的磷酸骨架結(jié)合，包裹縮合DNA[3]。近年來(lái)，金屬?gòu)?fù)合物作為一種新型的DNA縮合劑和傳遞載體受到了研究者們的關(guān)注[4-5]。金屬?gòu)?fù)合物具有豐富的結(jié)構(gòu)和合理的正電荷密度，能通過(guò)多種相互作用(如靜電結(jié)合，π-π作用等)與聚陰離子核酸結(jié)合[4-5]。Kawakami[6-7]和Yu等[8]分別將Zn(II)引入含咪唑基的聚合物和大環(huán)多胺聚陽(yáng)離子體系，發(fā)現(xiàn)Zn(II)可以極大地提高基因傳遞效率。Guo[9-11]和Chen[12]等將具有刺激響應(yīng)特性的Zn-DPA化合物修飾低分子量的聚乙烯亞胺(PEI)構(gòu)建的基因載體，實(shí)現(xiàn)了基因的低毒和高效傳遞。Liu等將Zn-DPA復(fù)合物用于共載熒光染料ICG和治療基因siRNA，協(xié)同實(shí)現(xiàn)光/基因組合治療[13]。

目前，通過(guò)組合和利用陽(yáng)離子脂質(zhì)和金屬絡(luò)合物各自優(yōu)勢(shì)構(gòu)建的金屬-脂質(zhì)基因載體的研究還較少。Yu等[14]，合成了系列Zn(II)-Cyclen頭部的金屬-脂質(zhì)基因載體具有較低的細(xì)胞毒性和較高的轉(zhuǎn)染效率。最近，我們也制備了一系列Zn-DPA頭部的新型金屬陽(yáng)離子脂質(zhì)[15-16]。在前期的研究基礎(chǔ)上，為了增加基因在細(xì)胞內(nèi)的釋放，進(jìn)一步提高基因轉(zhuǎn)染效率，本研究基于Zn-DPA親水頭部，膽固醇和皂素疏水尾部，設(shè)計(jì)合成了生物可降解二硫鍵橋連的金屬脂質(zhì)，并通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)手段考察其與DNA的相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

儀器：瓊脂糖凝膠水平電泳儀，全自動(dòng)凝膠成像分析儀：美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；熒光光譜：Fluoromax-4 (JOBIN-YYON,HORIBA) 型熒光分光光度計(jì)；恒溫?fù)u床：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司生產(chǎn)；納米粒度及電位分析儀(ZEN 3600)：英國(guó)Malvern公司生產(chǎn)；質(zhì)譜：HR-MS：Bruker Daltonics Bio TOF 型質(zhì)譜儀；核磁：Varian INOVA-400MHz 核磁共振儀(1H：400 MHz，13C：100 MHz，0.5% TMS 為內(nèi)標(biāo))。

試劑：瓊脂糖購(gòu)自Invitrogen公司；0.22 μm無(wú)菌濾器購(gòu)自Millipore公司。溶劑使用前都經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行純化和干燥。

1.2 金屬脂質(zhì)的制備

1.2.1 化合物1～3,4a,4b的合成

中間體1～3[17],4a[18],4b[19]參照文獻(xiàn)方法合成。目標(biāo)金屬脂質(zhì)的合成路線如Scheme 1所示。

路線1 目標(biāo)金屬脂質(zhì)的合成示意圖

Scheme 1 The synthetic route for target metallo-lipids

1.2.2 化合物5的合成

將化合物3 (0.78 mmol)溶于10 mL 二氯甲烷中,冰浴下，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI,0.93 mmol)，1-羥基苯并三唑(HOBt,0.93 mmol)和N,N-二異丙基乙胺(DIEA,1.6 mmol)。攪拌30 min后，緩慢滴加化合物4(0.78 mmol)的二氯甲烷溶液(10 mL)。室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。依次用飽和碳酸氫鈉，1%檸檬酸，飽和食鹽水洗滌，堿性三氧化二鋁柱分離，產(chǎn)物為黃色固體。

5a，產(chǎn)率：49%。1H NMR (400 MHz，CDCl3) δ: 8.55 (d，J = 4.7 Hz，2H，H-6(Py))，7.58～7.63 (m，2H，H-4(Py))，7.25～7.27 (m，2H，H-3(Py))，7.14～7.17 (m，2H，H-5(Py))，5.32～5.34 (m，1H，H-(Chol))，4.43～4.48 (m，1H，H-(Chol))，3.83 (s，4H，-CH2NCH2-)，3.61 (q，J = 6.2 Hz，2H，-CH2NH)，3.45 (q，J = 5.9 Hz，2H，-CH2NH)，3.30 (s，2H，-CH2N)，2.92～2.74 (m，4H,-CH2S)，2.21～2.35 (m，2H，H-(Chol))，1.72～2.02 (m，6H，H-(Chol))，0.82～1.57 (m，33H，H-(Chol))，0.65 (s，3H，H-(Chol))。13C NMR (101 MHz，CDCl3) δ: 171.52，158.08，149.31，136.64，123.31，122.45，60.41，58.00，56.64，56.08，49.96，42.27，39.69，39.47，38.51，38.32，37.80，37.74，36.94，36.52，36.14，35.76，31.87，31.83，31.40，30.15，29.66，28.20，28.12，27.98，24.25，23.79，22.79，22.66，22.53，21.00，19.30，18.68，11.82.HR-MS (ESI)：C46H69N5NaO3S2+(M+Na)+：826.4734，found：826.4714。

5b，產(chǎn)率：51%。1H NMR (400 MHz，CDCl3) δ: 8.55 (d，J = 4.3 Hz，2H，H-6(Py))，7.59～7.63 (m，2H，H-4(Py))，7.27～7.28 (m，2H，H-3(Py))，7.10～7.18 (m，2H，H-5(Py))，5.35 (s，1H，H-diosgenin)，4.36～4.42 (m，1H，H-diosgenin)，3.85 (s，4H，NCH2Py)，3.59～3.64 (m，2H，-CH2NH)，3.43～3.47(m，2H，-CH2NH)，3.31 (s，2H，N-CH2CO)，2.78～2.85 (m，4H,-CH2S)，2.22～2.36 (M，2H，H-diosgenin)，0.94-2.03 (m，31H，H-diosgenin)，0.75～0.78 (m，6H，H-diosgenin)。13C NMR (101 MHz，CDCl3) δ: 171.50，158.07，149.28，136.66，123.30，122.45，109.23，80.77，66.79，62.02，60.36，57.99，56.38，49.87，41.56，40.21，39.68，38.48，37.72，36.91，36.65，32.00，31.80，31.36，30.25，29.66，28.76，28.08，20.78，19.32，17.11，16.25，14.50。HR-MS (ESI)：C46H65N5NaO5S2+(M+Na)+:854.4319，found：854.4303。

1.2.3 化合物6的合成

將1 mL Zn(NO3)2·6H2O (0.0250 mmol)的水溶液加入到1 mL化合物5(0.025 mmol)的甲醇溶液中。室溫?cái)嚢? h。減壓蒸餾除去溶劑，真空干燥后得到金屬-脂質(zhì)復(fù)合物。

6a: HR-MS：C46H68N5O3S2Zn+(M+Zn-H)+：866.4050，found：866.4040。

6b: HR-MS：C46H64N5O5S2Zn+(M+Zn-H)+：894.3635，found：894.3629。

1.3 陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備

室溫下，將陽(yáng)離子脂質(zhì)(0.0025 mmol)與等物質(zhì)的量比的輔助脂質(zhì)(二油酰磷脂酰乙醇胺，DOPE)加入到已滅菌的10 mL圓底玻璃管中，用2.5 mL的無(wú)水氯仿溶解。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀緩慢蒸除溶劑，得到脂質(zhì)體膜，真空干燥8 h。將脂質(zhì)體膜用2.5 mL滅菌二次蒸餾水溶解，并將混合物置于4℃冰箱中溶脹過(guò)夜。渦旋1～2 min以溶解粘附于玻璃管壁的脂質(zhì)體膜，室溫下超聲5 min生成多層囊泡。進(jìn)一步使用探頭超聲制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體溶液(1 mmol/L)。用220 μm濾膜過(guò)濾后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹16]。

1.4 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

根據(jù)不同的電荷比，取適當(dāng)體積的陽(yáng)離子脂質(zhì)體溶液與pUC19質(zhì)粒DNA(0.125 μg)的混合，于37℃水浴孵化30 min后，進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。

1.5 粒徑、電位測(cè)定

根據(jù)不同的電荷比，取適當(dāng)體積的陽(yáng)離子脂質(zhì)體溶液與1 μg的pUC19質(zhì)粒DNA混合，25℃條件下測(cè)定其粒徑和zeta電位(總體積為1 mL水溶液)。

1.6 溴乙錠(EB)置換實(shí)驗(yàn)

將EB(5 μL，1.0 mg/mL)放入含有2.5 mL 10 mmol/L 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液(pH值7.4)的石英比色杯中。攪拌均勻后，測(cè)量EB的熒光強(qiáng)度(FEB)。然后，將CT DNA(10 μL，1.0 mg/mL)加入到上述EB溶液中，混合均勻后，測(cè)定DNA-EB復(fù)合物的熒光強(qiáng)度(F0)。隨后進(jìn)一步測(cè)量將脂質(zhì)6的溶液(1.0 mmol/L，每次添加7.5 μL)加入上述混合溶液的熒光強(qiáng)度(F)。所有樣品在520 nm激發(fā)，并在600 nm測(cè)量發(fā)射光譜。純EB溶液和不含陽(yáng)離子脂質(zhì)體的DNA-EB溶液分別用作陰性和陽(yáng)性對(duì)照。使用公式%F = (F-FEB)/(F0-FEB)測(cè)定相對(duì)熒光百分比(%F)，其中FEB和F0分別表示純EB溶液和DNA-EB溶液的熒光強(qiáng)度[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)金屬脂質(zhì)的合成

金屬脂質(zhì)的合成路線如Scheme 1所示?；衔?可通過(guò)甾醇羰基酰氯與胱胺反應(yīng)合成。將化合物3用 EDCI活化，與4反應(yīng)得到化合物5。5進(jìn)一步與等當(dāng)量的Zn(NO3)2反應(yīng)，得到目標(biāo)金屬脂質(zhì)6?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)通過(guò)核磁和質(zhì)譜鑒定。

2.2 金屬陽(yáng)離子脂質(zhì)體與DNA的相互作用研究

2.2.1 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

金屬陽(yáng)離子脂質(zhì)體由金屬脂質(zhì)和DOPE按物質(zhì)的量比1∶1制備。通過(guò)凝膠電泳考察了金屬脂質(zhì)體對(duì)DNA的包裹縮合能力。圖1顯示，含皂素的脂質(zhì)體6b可在電荷比為4時(shí)，完全包裹DNA，阻滯DNA的遷移，而膽固醇脂質(zhì)體6a需要電荷比為6時(shí)才能完全包裹縮合DNA。說(shuō)明皂素脂質(zhì)6b具有比膽固醇脂質(zhì)6a更強(qiáng)的DNA結(jié)合能力。

圖1 不同電荷比條件下脂質(zhì)6a-b的凝膠電泳

2.2.2 溴乙錠(EB)置換實(shí)驗(yàn)

通過(guò)溴乙錠置換實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步考察了脂質(zhì)體6a-b與DNA的結(jié)合能力。圖2顯示，隨著電荷比的增加(從0到4)，EB/DNA復(fù)合物的原始熒光強(qiáng)度顯著降低。當(dāng)EB/DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度淬滅為原始強(qiáng)度的50%時(shí)，6b的所需的電荷比小于6a (6a=2.3，6b=1.4)，表明皂素金屬脂質(zhì)6b的結(jié)合能力強(qiáng)于膽固醇金屬脂質(zhì)6a。凝膠電泳和溴乙錠置換實(shí)驗(yàn)均證明金屬脂質(zhì)6a-b對(duì)DNA有很好的結(jié)合能力，且6b強(qiáng)于6a。

圖2 不同電荷比條件下脂質(zhì)6a-b的溴乙錠置換

2.2.3 金屬脂質(zhì)體與DNA形成復(fù)合物的粒徑電位表征

金屬脂質(zhì)體6a-b與DNA形成復(fù)合物的粒徑和zeta電位結(jié)果如圖3所示。圖3A顯示，脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的粒徑分布具有類似的趨勢(shì)。復(fù)合物的粒徑隨著電荷比的增加，先逐漸增加，達(dá)到最大值后，逐漸減小。脂質(zhì)6a，6b的粒徑分別在電荷比為6和4 時(shí)粒徑達(dá)到最大值。在完全能包裹DNA的情況下，皂素脂質(zhì)6b與DNA形成復(fù)合物的粒徑，明顯小于6a/DNA復(fù)合物。結(jié)果表明，6b對(duì)DNA有更強(qiáng)的縮合能力。這個(gè)結(jié)果與凝膠電泳和溴乙錠置換實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(圖1和2)。由圖3B可知，脂質(zhì)體6a-b /DNA復(fù)合物的電位均隨著電荷比的增加而增加。6a/DNA復(fù)合物的電位在電荷比為8時(shí)變?yōu)檎?，?b/DNA復(fù)合物的電位在電荷比為6時(shí)變?yōu)檎?。結(jié)果同樣表明，脂質(zhì)6b 比6a有更強(qiáng)的DNA結(jié)合能力。這個(gè)結(jié)果與凝膠電泳結(jié)果一致。

圖3 不同電荷比條件下脂質(zhì)6a-b/DNA復(fù)合物的粒徑(A)和電位(B)

Fig.3 Mean particle sizes (A) and surface charge (B) of the lipoplex 6a-b under various charge ratios (2,4,6,8 and 10).

3 結(jié)論

本文基于DPA-Zn金屬陽(yáng)離子頭部，以膽固醇和皂素為疏水尾部、二硫鍵為連接鍵，制備了金屬陽(yáng)離子脂質(zhì)6a-b。通過(guò)凝膠電泳、溴乙錠置換和粒徑電位等實(shí)驗(yàn)方法考察了其與DNA的相互作用。結(jié)果表明，皂素金屬脂質(zhì)具有比膽固醇脂質(zhì)更強(qiáng)的DNA相互作用能力。后續(xù)研究，將進(jìn)一步考察其DNA釋放性能和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染活性，開(kāi)發(fā)新型的具有刺激響應(yīng)特性的"智能型"金屬脂質(zhì)基因載體。