皮膚中原代黑色素細胞和角質(zhì)形成細胞同時分離法及其在超細顆粒物毒性效應評價中的應用

程戰(zhàn)文，殷諾雅，鄭衛(wèi)，F(xiàn)rancesco Faiola,*

1. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學與生態(tài)毒理學國家重點實驗室，北京 100085 2. 中國科學院大學資源與環(huán)境學院，北京 100049 3. 重慶醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院泌尿外科，重慶 401120

近年來，隨著工業(yè)技術的逐漸發(fā)展，大氣污染日益嚴重，越來越多的國家和地區(qū)開始關注大氣污染問題。已有流行病學研究表明，大氣污染物的暴露會導致人群中呼吸系統(tǒng)[1]和心血管系統(tǒng)[2-3]疾病發(fā)病率的增加，以及人群中死亡率的上升[4-5]，存在一定的健康風險。除此之外，皮膚作為人體最大的器官，流行病學研究同樣證實大氣污染會引起內(nèi)源性的皮膚老化[6-7]、過敏性皮炎[8-9]及濕疹[10]等皮膚疾病發(fā)病率的增加，同時還伴隨著黑色素在皮膚中的累積和老年雀斑比例的上升[7,11]，對人體皮膚具有潛在的毒性效應?？紤]到皮膚是保護人體免受外界污染物危害的第一道防線，且目前關于污染物是如何影響人體皮膚的病因，也并未闡明。因此，從皮膚細胞角度出發(fā)衡量大氣污染物潛在的危害效應，將有助于大氣污染毒性的評估以及污染物排放標準的制定。

大氣中的各種顆粒物成分，組成了大氣氣溶膠的懸浮體系。而粒徑<100 nm的超細顆粒物，雖然在質(zhì)量上只占大氣總顆粒物的很少一部分，但卻是大氣中數(shù)量最多的顆粒物[12]。與PM2.5以及PM10相比，超細顆粒物具有更小的粒徑，不僅能透過呼吸系統(tǒng)的各種屏障，還能直接透過肺泡細胞，進入人體血液循環(huán)，在人體內(nèi)造成嚴重的炎癥反應并伴隨氧化應激的產(chǎn)生[13-14]。事實上，超細顆粒物已被證實是霧霾期間兒童若干疾病如收縮壓升高[15]、哮喘發(fā)病率上升[16]的元兇。雖然，超細顆粒物對人體存在著潛在的健康風險，但目前對超細顆粒物的風險評估還處于較早的階段，美國環(huán)境保護局(US EPA)以及歐盟(EU)對超細碳顆粒物的排放還未制定規(guī)范標準。因此，從超細顆粒物角度解釋大氣污染潛在毒性效應特別是皮膚毒性效應，將有助于大氣污染風險的評估。

目前，已有許多實驗數(shù)據(jù)，從納米毒理學角度出發(fā)，探討了納米尺度顆粒物的潛在皮膚暴露風險。作為常見的碳納米材料的代表，單壁碳納米管能導致皮膚中的角質(zhì)形成細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的活性氧(reactive oxygen species, ROS)蓄積[17]，誘導細胞內(nèi)脅迫相關基因的過量表達。除此之外，納米顆粒物的暴露，還會導致細胞內(nèi)炎癥因子的高表達。例如24 h內(nèi)20、50和80 nm納米銀暴露會導致角質(zhì)形成細胞分泌的IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α的濃度顯著升高，并伴隨著納米銀作用位點出現(xiàn)明顯的局灶性炎癥現(xiàn)象[18]。Li和Monteiro-Riviere[19]使用硫辛酸、聚乙二醇以及聚乙烯亞胺修飾過的納米金顆粒，研究了人表皮角質(zhì)形成細胞對不同粒徑納米金顆粒的攝取和內(nèi)吞效應，研究發(fā)現(xiàn)不同材料修飾的納米金顆粒均會促進促炎癥因子IL-1α、IL-1β和趨化因子IL-8的表達和分泌。相同的炎癥效應，同時也出現(xiàn)于納米碳管[20]、納米鋅[21]以及納米二氧化鈦[22]暴露后的角質(zhì)形成細胞中。

值得注意的是，以上研究大多基于人體角質(zhì)形成細胞。雖然，角質(zhì)形成細胞占表皮細胞的90%，但對于表皮中具有黑色素分泌功能，同時能調(diào)節(jié)皮膚顏色并保護皮膚免受紫外線干擾的黑色素細胞而言，研究還較少。只有少量研究表明，大氣污染中的某些持久性有機污染物如二噁英會通過AhR受體介導的形式，上調(diào)黑色素細胞內(nèi)與黑色素產(chǎn)生相關的TYR、TYRP1以及TYRP2基因的表達，促進黑色素產(chǎn)生[23-24]。此外，目前的研究多是從氧化應激和炎癥反應2個方面揭示納米顆粒物的毒性，從細胞功能角度闡明納米尺度顆粒物毒性效應的研究還較少。鑒于以上原因，使用原代細胞分離的方法，從人體皮膚中同時分離了角質(zhì)形成細胞和黑色素細胞，用商業(yè)化的超細碳顆粒物模擬了大氣中的超細顆粒物，探究了大氣顆粒物的潛在皮膚毒性。考慮到目前已有若干基于原代角質(zhì)形成細胞的研究，此處重點探討了超細碳顆粒物對黑色素功能基因表達的影響。以上研究將有助于大氣顆粒物風險評價，解釋超細顆粒物的皮膚致毒機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗室中分離的黑色素細胞和角質(zhì)形成細胞來源于醫(yī)院健康男性包皮環(huán)切術(已告知樣品用途并獲得口頭許可)。手術結束后的皮膚樣品迅速保存至含有5 mg·L-1慶大霉素(Gibco，R01510)的D-KSFM培養(yǎng)基(Gibco，10744019)中，并置于冰中轉移至實驗室進行細胞分離。

實驗使用的超細碳顆粒物為商業(yè)化的碳顆粒物(Sigma，633100)，使用二甲基亞砜(DMSO)(Amresco，0231)為分散劑并置于37 ℃恒溫水浴鍋(Elma，P60H)中超聲30 min，獲得濃度為10 g·L-1的超細碳顆粒物母液，再次梯度稀釋為1 mg·L-1～10 g·L-1儲備液。

1.2 原代細胞的分離

使用含有20 mg·L-1慶大霉素的杜氏磷酸緩沖液(DPBS)(Gibco，14190250)清洗包皮樣品5次，每次5 min，并將包皮樣品剪成2 cm3左右的片狀，充分清洗去除其中的血漬。將清洗過后的包皮樣品轉移至含有25 000 units·L-1蛋白酶(Gibco，17105041)和5 mg·L-1慶大霉素的DPBS溶液中，4 ℃條件下消化24 h。消化完成后，使用鑷子將表皮從樣品中剝離出來，并使用0.05% Trypsin-EDTA(Gibco，12605010)在37 ℃條件下消化15 min，消化過程中使用巴氏吸管吹打樣品使表皮更加充分的消化。消化完成后，使用10倍體積的DPBS溶液稀釋消化液終止消化，并使用40 μm細胞過濾器(Corning，431750)去除未消化的殘渣，最后在200 g離心5 min。離心完成之后，使用D-KSFM培養(yǎng)基重新懸浮，并按照1×108cells·L-1濃度將細胞接種于膠原蛋白(Gibco，R011K)修飾過的培養(yǎng)皿中，用于角質(zhì)形成細胞的培養(yǎng)。使用含有HMGS-2(Gibco，S0165)的m254培養(yǎng)基(Gibco，M254500)(黑色素細胞培養(yǎng)基)重懸細胞并將其接種于纖連蛋白(Corning，354008)修飾過的培養(yǎng)皿中，用于黑色素細胞的培養(yǎng)。分離的原代細胞在一周后能逐漸長滿整個培養(yǎng)皿，在2～3次傳代后能逐漸被分離純化(圖1)。

圖1 表皮分離過程Fig. 1 The procedure of epidermis isolation

1.3 超細碳顆粒物表征

將納米碳顆粒粉末均勻分布在樣品臺的導電膠上，使用洗耳球從不同角度吹拂樣品臺上的納米碳顆粒樣品，使粉末牢固、均勻地粘在導電膠上。使用場發(fā)射高分辨率掃描電鏡(field-emission scanning electron microscopy, FE-SEM)(Hitachi，SU-8020)拍攝超細碳顆粒物照片，并使用其元素分析模塊(energy dispersive X-ray spectroscopy, EDS)分析其元素組成和含量。

將1 g·L-1碳顆粒物儲備液用DMEM/F12(Gibco，11320082)稀釋至1 mg·L-1，用以模擬其在培養(yǎng)基中的條件，并將其滴加至碳膜覆蓋的銅網(wǎng)(Electron Microscopy China，BZ11032a)上，使用紅外燈烘干1 h，使銅網(wǎng)完全干燥后，即可置于透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)(Hitachi，H7500)中在80 kV下拍攝TEM照片。

1.4 細胞活性檢測

將傳代3代之后原代黑色素細胞使用TrypLE消化液(Gibco，12604013)消化并重懸浮，并按1×108cell·L-1接種于纖連蛋白修飾后的96孔板中。將1 mg·L-1～10 g·L-1超細碳顆粒儲備液用黑色素細胞培養(yǎng)基稀釋1 000倍(DMSO濃度為0.1%)，使超細碳顆粒物暴露濃度分別為1、10、100、1 000和10 000 μg·L-1，陰性對照為0.1% DMSO處理組，每孔100 μL，共持續(xù)暴露72 h。暴露過程中每天更換培養(yǎng)基。暴露結束使用AlamarBlue(Thermo，DAL1025)試劑，在酶標儀(Thermo，Varioskan LUX)上檢測(激發(fā)波長530 nm，發(fā)射波長590 nm)細胞存活率。細胞存活率計算方法如下：

1.5 超細碳顆粒物對黑色素基因表達分析

將黑色素細胞按照相同濃度接種于纖連蛋白修飾后的培養(yǎng)皿中并暴露于含有1～10 000 μg·L-1超細碳顆粒的黑色素細胞培養(yǎng)基中。待細胞長滿整個培養(yǎng)皿時，加入1 mL Trizol試劑(Invitrogen，15596018)按照其說明提取樣品中的RNA，并使用NanoDrop紫外可見分光光度計(Thermo，NanoDrop 2000)測量RNA溶液濃度和260、280及230 nm的吸光值，進行RNA定量。使用FastKing RT Kit試劑(TIANGEN，KR116)將RNA逆轉錄成cDNA，加入SYBR Green試劑(Takara，RR420L)后按照以下步驟測量基因表達水平：預變性(95 ℃，30 s)，PCR(95 ℃，3 s；60 ℃，30 s；40個循環(huán))?；虮磉_以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物以及其序列如表1所示。

1.6 免疫熒光染色

將樣品使用DPBS清洗3次，加入4%福爾馬林試劑在室溫條件下固定20 min后再次使用DPBS清洗。加入含有0.1% Triton X-100(Amresco，0694)和5%山羊血清(Solarbio，SL038)的DPBS試劑作為封閉液室溫條件下孵育1 h。加入一抗4 ℃過夜孵育，使用DPBS清洗后加入二抗4 ℃孵育2 h即可。本部分抗體使用信息如表2所示。

2 結果(Results)

2.1 原代黑色素細胞和角質(zhì)形成細胞分離

原代細胞分離過程如圖1所示，由于表皮中大多數(shù)細胞為角質(zhì)形成細胞，黑色素細胞只占很少一部分，因此，在細胞分離過程中使用黑色素細胞培養(yǎng)基(在m254培養(yǎng)基中添加HMGS-2)以及以纖連蛋白為基質(zhì)，對黑色素細胞進行分離和篩選。結果表明，經(jīng)過2～3次傳代后，黑色素細胞能逐漸被純化并表現(xiàn)出較高的純度。在體外分離出來的黑色素細胞胞質(zhì)透明可見，細胞核較小，每個細胞具有多個樹突狀結構。同時，分離出的黑色素細胞能在離體條件下進行傳代和擴增，并維持均一的細胞形態(tài)(圖2)。通過將黑色素細胞消化收集并離心，能在試管底部發(fā)現(xiàn)明顯的黑色素沉淀，這說明分離的原代黑色素細胞在體外具有合成黑色素的能力(圖2)，驗證細胞分離實驗的成功。

表1 qRT-PCR引物及其序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

除了黑色素細胞，還獲得了皮膚中的角質(zhì)形成細胞，并在幾次傳代后實現(xiàn)了細胞分離純化(圖2)。顯微鏡下角質(zhì)形成細胞呈不規(guī)則鱗片形，細胞邊緣較為明亮，且相互之間緊密相連。通過熒光免疫染色，發(fā)現(xiàn)所有的細胞都能表達角質(zhì)形成細胞特異的骨架蛋白KRT14。以上結果說明，我們的原代細胞分離方法不僅能分離黑色素細胞，也能用于提取皮膚中的角質(zhì)形成細胞，實現(xiàn)了同時分離皮膚中兩大類細胞。

2.2 超細碳顆粒物表征

如圖3(a)所示，超細碳顆粒粉末呈聚集的團狀，聚集體之間存在較大范圍的間隙，同時顆粒與顆粒之間存在明顯的團聚。因此，下述準備超細碳顆粒懸浮液時，均使用超聲水浴使碳顆粒盡量分散。SEM結果顯示，粉末狀碳顆粒粒徑約50 nm。EDS元素分析結果顯示，除去光譜中存在的元素氧信號外，粉末主要成分都為元素碳，這說明粉末狀樣品主要組成元素為碳，樣品具有較高的純度。

超細碳顆粒的TEM表征結果如圖3(c)所示，將1 g·L-1分散于DMSO的超細碳顆粒物懸液用DMEM/F12稀釋至1 mg·L-1，超聲分散后，超細碳顆粒物能在培養(yǎng)基中被分散成單個球形的顆粒物，且能在DMEM/F12中均勻分散，此濃度下未見明顯的碳顆粒聚集體。TEM表征結果顯示，單個碳顆粒在DMEM/F12中粒徑<100 nm，為納米尺度顆粒物，這與SEM結果相符。

圖3 超細碳顆粒物的掃描電鏡(SEM)、X射線能譜分析(EDS)和透射電鏡(TEM)表征注：(a) SEM表征超細碳顆粒粉末形態(tài)；(b) 超細碳顆粒粉末的EDS元素分析；(c) TEM表征超細碳顆粒形態(tài)(1 μm)。Fig. 3 Characterization of ultrafine carbon particles by scanning electron microscopy (SEM), energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS) and transmission electron microscopy (TEM)Note: (a) morphology of ultrafine carbon powder under SEM; (b) EDS results for ultrafine carbon particles; (c) ultrafine carbon particles under TEM (scale bar, 1 μm).

2.3 超細碳顆粒物暴露對黑色素細胞的急性毒性

考慮到目前已有許多基于角質(zhì)形成細胞的實驗數(shù)據(jù)，此處重點關注了黑色素細胞的毒性效應。為了探究超細碳顆粒物暴露對黑色素細胞急性毒性的影響，使用AlamarBlue測量72 h碳顆粒暴露之后黑色素細胞的細胞活性。由于氧化型AlamarBlue能被活細胞攝取進入細胞并被活細胞中的線粒體酶還原成具有熒光效應的還原態(tài)，故可通過其特定波段的熒光值來測定細胞活性。如圖4所示，相比于DMSO對照組，72 h超細碳顆粒暴露并不會對黑色素細胞造成明顯的急性細胞毒性。這說明，超細碳顆粒物在1～10 000 μg·L-1濃度范圍內(nèi)，不具有顯著的細胞毒性效應。

圖4 超細碳顆粒物72 h暴露對黑色素細胞急性毒性的影響注：DMSO表示0.1%二甲基亞砜溶劑對照組。Fig. 4 72 h acute toxicity of ultrafine carbon particles on melanocytesNote: DMSO represents 0.1% dimethyl sulfoxide solvent control.

2.4 超細碳顆粒物暴露對黑色素細胞功能基因表達的影響

為了進一步探究超細碳顆粒物對黑色素細胞功能基因表達的影響，使用qRT-PCR測量了若干黑色素細胞功能基因的表達。如圖5所示，對于黑色素細胞的標志基因MITF、MITF-M以及c-KIT，當超細碳顆粒物濃度>1 000 g·L-1時，基因表達水平會顯著上升。同時，其上游調(diào)控基因PAX3和SLUG的表達，也能被超細碳顆粒物所促進。對于黑色素形成過程中的關鍵酶TYRP1和TYR以及黑色素小體特異型跨膜糖蛋白SILV而言，超細碳顆粒物暴露也會使其基因表達出現(xiàn)相同的趨勢。以上結果說明，超細碳顆粒物暴露會顯著促進黑色素細胞的活動，特別是當超細碳顆粒物濃度>1 000 g·L-1時。

圖5 超細碳顆粒物暴露對黑色素細胞基因表達的影響注：(a)黑色素細胞標志基因MITF、MITF-M和c-KIT表達水平；(b)黑色素細胞標志基因上游調(diào)控基因PAX3和SLUG表達水平；(c)與黑色素產(chǎn)生有關基因TYR、TYRP1和SILV表達水平。Fig. 5 The effect of carbon exposure on melanocyte gene expressionNote: (a) the expression of melanocyte marker genes MITF, MITF-M and c-KIT; (b) the upstream gene expression of melanocyte markers PAX3 and SLUG; (c) the gene expression related to melanin production TYR, TYRP1 and SILV.

3 討論(Discussion)

本文使用一種商業(yè)化的超細碳顆粒物模擬了大氣中的超細顆粒物，研究了其潛在的皮膚毒性。在日常生活中，該超細碳顆粒物也常被用作輪胎和其他橡膠制品中的增強劑，以及各種油漆、油墨等染色材料[25]。根據(jù)國際癌癥研究機構(IARC)發(fā)布的研究報告，超細碳顆粒物被列為2B類致癌物，對人體可能具有潛在的致癌風險[26]。雖然，目前關于超細碳顆粒物的研究還不是很多，但已有流行病學研究表明，超細碳顆粒物暴露會影響人體健康。例如，通過調(diào)查報紙印刷行業(yè)工作人員的健康狀況，發(fā)現(xiàn)此類人群中肺癌風險與在打印板房工作時間正相關[27]，同時總就業(yè)時間越長腎癌發(fā)病風險也越高[28]，并且橡膠行業(yè)從業(yè)人員有更高的心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病以及高血壓發(fā)病率[29]。與其他納米材料相同，超細碳顆粒物暴露同樣也會導致細胞內(nèi)出現(xiàn)ROS，同時高表達某些炎癥相關因子，最終導致機體呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)受損[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，超細碳顆粒物的暴露會對促進人體黑色素細胞相關功能基因的表達，這說明超細碳顆粒物以及大氣細顆粒物可能具有潛在的皮膚毒性。

表皮作為皮膚的最外層，構成了人體的外部屏障，能保護人體不受外界的危害[30]。角質(zhì)形成細胞是構成表皮的主要細胞，占表皮細胞的90%以上；黑色素細胞雖然只占表皮細胞的6%，但是能分泌黑色素，保護人體免受紫外線的影響。因此，以角質(zhì)形成細胞和黑色素細胞為基礎的皮膚模型，能在一定程度上反映外界污染物對皮膚的毒性效應。本課題組前期實驗已經(jīng)證實，超細碳顆粒物的暴露會導致角質(zhì)形成細胞發(fā)育異常，并伴隨著發(fā)育分化過程中炎癥反應的出現(xiàn)。同時，考慮目前已有若干基于原代角質(zhì)形成細胞的毒性數(shù)據(jù)，所以此實驗中重點關注了超細顆粒物對黑色素細胞的影響。但是，基于人體皮膚同時分離原代角質(zhì)形成細胞和黑色素細胞的實驗方法，在未來能為污染物皮膚毒性評價，提供新的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)超細碳顆粒物的暴露會促進黑色素功能基因MITF、MITF-M、TYR、TYRP1、SILV、SLUG、PAX3以及c-KIT的高表達。MITF和MITF-M作為黑色素細胞最重要的轉錄因子，調(diào)節(jié)著黑色素細胞的發(fā)育和黑色素生成酶基因的表達[31-32]。作為TYR、TYRP1和SILV的上游調(diào)控基因，MITF能通過與DNA上的特異性啟動子結合，控制黑色素形成過程中酪氨酸酶(TYR)和酪氨酸酶相關蛋白1(TYRP1)的轉錄，從而影響著黑色素的生成[33-34]，而SILV與黑色素細胞中黑色素小體上的跨膜蛋白形成有關[35]。此外，MITF的表達會受到其上游調(diào)控基因PAX3[36]和SLUG[37]的影響，如PAX3和SOX10通過協(xié)同作用以反式作用元件的方式激活MITF啟動子，進一步促進MITF的表達[36]。在此實驗中，我們證實超細碳顆粒物暴露會通過高表達以MITF為核心的功能性基因網(wǎng)絡，促進黑色素細胞的功能。目前已有研究表明，PM2.5濃度的上升以及碳黑顆粒物的暴露會導致皮膚中黑色素的過量產(chǎn)生以及累積，并伴隨著人群中皮膚色素沉積增多和患老年雀斑比例的增加[6-7,11]甚至是黑色素瘤的出現(xiàn)[38]，這與我們通過原代黑色素細胞暴露所獲得的結果是相吻合的。因此，我們的研究結果及模型對于評價大氣污染的潛在皮膚毒性，特別是顆粒物對皮膚色素產(chǎn)生的影響，具有十分重要的借鑒意義。