環(huán)境胞外胞內DNA的行為歸趨及生態(tài)功能研究進展

張忠云，葉茂，孫明明，黃丹，張勝田，胡鋒，蔣新

1. 中國科學院南京土壤研究所，中國科學院土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，南京 210008 2. 中國科學院大學，北京 100049 3. 南京農業(yè)大學，資源與環(huán)境科學學院土壤生態(tài)實驗室，南京 210095 4. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學研究所，土壤污染防治研究中心，南京 210042

DNA是一種特殊形式的環(huán)境有機質組分，是生命所有分支中遺傳信息的通用存儲材料，存在于細胞內和細胞外。存在于活細胞外的DNA被稱為細胞外DNA(extracellular DNA, extDNA)，是水生和陸生生態(tài)系統(tǒng)中豐富的生物聚合物；存留在代謝正?；罴毎麅鹊腄NA則被稱作細胞內DNA(intracellular DNA, intDNA)。extDNA分子大多與活細胞釋放和死亡細胞有關，存在于土壤、水體、沉積物和沙漠等大部分環(huán)境中，易參與吸附、降解和自然轉化等環(huán)境過程，也可參與微生物基因傳遞；同時，extDNA也是細菌生物膜中一種重要的組成成分，參與生物膜形成初期基質粘附及細菌聚集過程，形成后的生物膜對抗生素、重金屬和有機污染物等化合物毒性具有一定抵御作用。intDNA分子通常存在于活細胞內，參與生物體內細胞自然代謝、水平及垂直基因轉移等過程；同時，微生物細胞釋放intDNA是環(huán)境extDNA的主要來源之一。本文將從ext/intDNA在環(huán)境中的留存及其土壤環(huán)境行為、extDNA在模式菌株生物膜形成中的作用及ext/intDNA在基因信息傳遞過程中的角色等角度，綜述ext/intDNA物理、化學環(huán)境行為及其各自攜帶的生物信息差別。本綜述可為進一步探明環(huán)境中ext/intDNAs生態(tài)功能的交互作用過程與機制提供科學參考。

1 extDNA和intDNA環(huán)境存留及其行為歸趨(Environmental retention and fate of extDNA and intDNA)

1.1 extDNA和intDNA

死亡細胞裂解和活細胞分泌通常會產生extDNA，細胞自溶、病毒侵染和主動轉運等都是extDNA產生的主要途徑[1-6](圖1)。環(huán)境中extDNA包含：游離態(tài)、松散和緊實結合態(tài)extDNA[7-8]。細菌可利用游離態(tài)extDNA作為C、N、P和O等基本元素的能源[2,9-10]，也可整合同源或異源extDNA進入染色體，使其成為自身DNA的一部分或將其作為自身生物膜的一種組分[11-12]。松散及緊實結合態(tài)extDNA通過磷酸基團間的無機陽離子橋或二價陽離子與有機質結合，一般以吸附或結合態(tài)存留于環(huán)境中，不易被核酸酶攻擊，較為穩(wěn)定[13-14]，但隨著環(huán)境pH、溫度和礦物性質等因素的變化，這部分extDNA也可以逐漸參與解吸和降解等物質循環(huán)過程[2,15-16]。extDNA中包含有大量來自細胞死亡后裂解產生的DNA。據(jù)統(tǒng)計，全球海洋沉積物中約有0.3×109～0.45×109t extDNA，是同一環(huán)境下活細胞總DNA的70%以上[17-18]。

intDNA是存留在正常代謝細胞內的DNA(圖1)，活細胞主動分泌、細胞裂解和重金屬/有機污染物脅迫下細胞被動分泌等都是intDNA轉化為extDNA的方式[19]。大多intDNA正常參與生態(tài)系統(tǒng)中元素循環(huán)及生物體代謝，是微生物活細胞間水平及垂直基因轉移的主力軍，且大多intDNA存在于活細胞內，不會被土壤及沉積物顆粒吸附，與extDNA環(huán)境行為及生態(tài)功能作用機制一般不同[20-22]。

傳統(tǒng)過濾及離心方法通常只能提取<10%總extDNA，目前常用的extDNA提取方法，如醇沉法、十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)萃取法、DNA萃取試劑盒等通常適用于沉積物、污泥、生物膜及含有豐富的extDNA的土壤中extDNA提取，對于DNA含量較低的水體環(huán)境卻不太適用[8,13,23-25]。目前對于ext/intDNA的研究大多致力于將extDNA和intDNA精準分離，探討extDNA的環(huán)境行為、extDNA在微生物群落多樣性估算中的比重、extDNA和intDNA分別對物質循環(huán)和基因傳遞各自的貢獻機制等。

圖1 環(huán)境胞內/胞外DNA及其環(huán)境行為Fig. 1 Environmental behaviors of extracellular DNA and intracellular DNA

1.2 extDNA和intDNA的環(huán)境相對豐度

extDNA和intDNA在不同環(huán)境體系中普遍存在。通常條件下，土壤及沉積物環(huán)境中extDNA豐度較intDNA高，水體中intDNA豐度較高；土壤及沉積物中extDNA豐度比水體中extDNA豐度高[26]。據(jù)統(tǒng)計，extDNA在沉積物中的濃度是水體中濃度的3倍～4倍[27]，沉積物中extDNA的半衰期也比在水體系中長，這可能與沉積物的特殊環(huán)境及沉積物對extDNA的吸附等作用有關[28-30]。土壤中也含有豐富的extDNA且多集中在土壤表層[31]。Lennon等[18]使用DNA酶(DNase)去除土壤樣品中的extDNA，發(fā)現(xiàn)extDNA約占據(jù)土壤總DNA的0%～83%；Carini等[32]使用疊氮溴化丙錠去除土壤中的extDNA，發(fā)現(xiàn)這部分DNA約占據(jù)土壤總DNA的40%；不同的比例可能與extDNA去除方法及土壤性質等環(huán)境因素密切相關[33]。去除方法若不足以消除土壤有機質、pH、陽離子類型與濃度等土壤性質對DNA吸附的影響，則去除方法并不能將吸附態(tài)extDNA全部去除，吸附態(tài)extDNA的存在降低了可提取態(tài)extDNA的有效性，從而減少可估計的extDNA比例[32]。目前文獻中已有的不同環(huán)境體系中ext/intDNA的檢出濃度如表1所示。

由表1可知，不同環(huán)境體系中ext/intDNA檢出濃度并不相同，土壤和沉積物是ext/intDNA重要的儲庫；目前能夠得到的土壤中extDNA濃度范圍在0.0047～41.1 μg·g-1，深海沉積物上層達到119.1 μg·g-1；不同的環(huán)境體系中，intDNA檢出范圍在0.8～2 047.4 μg·g-1。

1.3 extDNA和intDNA的環(huán)境歸趨

ext/intDNA在土壤環(huán)境中的歸趨，決定于ext/intDNA和土壤環(huán)境體系的生物和物理特性。目前，關于ext/intDNA在土壤中的環(huán)境行為研究主要集中于ext/intDNA在土壤中的吸附、降解代謝及基因傳遞等。extDNA不被細胞膜保護，在土壤環(huán)境中可游離存在，也可與土壤礦物質及腐殖質相結合。游離態(tài)及結合態(tài)extDNA都可以作為植物與微生物生長的營養(yǎng)來源，同時還能成為細菌生長時的基因組來源。intDNA被細胞膜包被，在土壤中的環(huán)境行為更多依賴于動物、微生物攝食作用及intDNA向extDNA的轉化過程。

1.3.1 吸附

細胞裂解后產生的extDNA易被環(huán)境中大量存在的核酸酶攻擊，破碎成為小分子extDNA，被砂礫、礦物吸附或通過與有機質結合后免受核酸酶攻擊[2,45]；據(jù)統(tǒng)計，>80%的海洋沉積物中DNA為extDNA，且>95% extDNA被沉積物所吸附，只有少于5%為游離態(tài)extDNA[2,17,19]。土壤中extDNA被土壤礦物質、腐殖質及有機質吸附，得以免受微生物DNA酶的快速降解作用[46]。Blum等[47]研究發(fā)現(xiàn)，在砂土及沙壤土中添加300 ng3H標記的外源extDNA，通過探究吸附位點有效性發(fā)現(xiàn)，extDNA進入土壤1 h后即達到吸附最大值，80% extDNA都被吸附；土壤吸附位點保護extDNA免受DNA酶攻擊可能是在土壤顆粒的吸附作用下，削弱了DNA酶與extDNA直接反應的能力和概率[48]。但是，也有相關研究表明，若DNA酶飽和占據(jù)與吸附態(tài)extDNA相鄰的土壤礦物吸附位點，則這部分extDNA依舊會被DNA酶降解[46]。

土壤礦物組成、土壤pH、腐殖質含量和陽離子含量等因素都會交互影響土壤中extDNA的吸附過程。土壤礦物成分和陽離子含量對extDNA的吸附和結合量差異較大[49-50]。Hou等[51]探究游離態(tài)鮭魚精子DNA在3種原始粘土(輝長巖、蒙脫石和絹云母)上的吸附規(guī)律，發(fā)現(xiàn)DNA吸附量大小順序為輝長巖>蒙脫石>絹云母；pH=7.0時向體系中分別加入無機離子Na+、Mg2+和Al3+，發(fā)現(xiàn)Al3+體系中，DNA吸附量增加最明顯，這可能的原因是當pH=7.0時，粘土礦物表面為負電荷表面，高價陽離子更易與負電荷DNA分子和負電荷礦物表面以陽離子橋相結合；Franchi等[52]將吸附體系中的Na+替換成Mg2+和Al3+，發(fā)現(xiàn)蒙脫石、高嶺石和針鐵礦中DNA吸附量明顯上升，這說明粘土礦物中高價陽離子吸附帶負電荷DNA效果更顯著。不同土壤pH也會影響土壤中extDNA吸附量。Cai等[53]使用鮭魚精子DNA探究其在褐土和粘土礦物等4種不同膠體上的吸附和解吸，發(fā)現(xiàn)體系pH由2.0升至5.0時，有機粘土及蒙脫石上吸附extDNA量顯著減少，pH高于5.0時，有機粘土上吸附的extDNA可忽略不計；在無機礦物和高嶺石上，pH由2.0升至9.0時，extDNA吸附量緩慢減少，這說明有機礦物和蒙脫石中靜電相互作用對extDNA吸附影響較大。但是有學者提出，已有的extDNA吸附試驗一般人為控制礦物粒徑大小和粘土顆粒表面電荷，這種處理會使DNA吸附量增加，試驗中的土壤體系與實際環(huán)境并不相同[54]；Gardner和Gunsch[54]使用不經過表面修飾的模式牛胸腺extDNA和轉基因玉米extDNA，探究其在高嶺石、蒙脫石及3種土壤混合物(砂壤土、粘土和粉砂壤土)中的吸附，實驗結果表明，純蒙脫石和高嶺石吸附能力比和Demanèche[46]等和Khanna等[50]報道過的吸附能力低1至2個數(shù)量級，但是吸附量仍然可以達到200 mg·g-1(粘土)DNA；粘土含量較高的土壤往往可以吸附更多量的游離態(tài)extDNA。因而，粘土顆?？赡苁峭庠次⑸镏匾挠坞x態(tài)extDNA來源。

表1 不同環(huán)境體系中細胞外和細胞內DNA(ext/intDNA)相對豐度Table 1 Relative abundances of extracellular and intracellular DNA (ext/intDNA) in different environments

1.3.2 降解

extDNA進入土壤環(huán)境中，DNA自身性質和土壤環(huán)境因素都會對extDNA降解產生影響[28,46]；DNA自身性質包括DNA來源、DNA中G+C堿基含量、分子純度以及分子重量。土壤環(huán)境因素包括土壤礦物組成、有機質含量、溫度、靜電作用和土壤濕度等。Sirois和Buckley[55]將人工合成的變形鏈球菌extDNA施加進入土壤，探究了土壤濕度、溫度、農業(yè)管理措施和棲息地類型等因素對土壤環(huán)境中extDNA降解動力學的影響。研究結果表明，extDNA在土壤中迅速降解，extDNA降解速率與濕度及溫度呈正相關，與土壤有機質含量呈負相關；extDNA在耕種土壤中比在休耕土壤中有更高的降解率和更低的固定率，只有極少部分extDNA能夠在土壤中相對持久存在。

在不同的環(huán)境介質中，extDNA的降解速率并不相同。Dell’Anno和Corinaldesi[26]探究在海洋水體及沉積物中游離態(tài)extDNA的降解及轉化率，發(fā)現(xiàn)沉積物中extDNA降解速率較快，是水體中的7倍～100倍，這與沉積物中含大量DNA酶有關；同時，由于沉積物中extDNA樣品含量較多，約為水體中含量的4.3倍，不平衡的含量供應-降解率使得沉積物中extDNA的轉化率比水體中extDNA的轉化率低得多，因而半衰期更長，沉積物中extDNA半衰期29～93 d不等，而水體中只有10 h左右。

Torti等[23]采集丹麥奧胡斯灣中約海底以下10 m沉積物，分離樣品中的extDNA和intDNA，發(fā)現(xiàn)，近半數(shù)DNA都為extDNA；同時，實驗中還探究了>600堿基對(bp)的高分子量extDNA和<600 bp的低分子量extDNA占據(jù)的比例，發(fā)現(xiàn)隨著沉積物深度增加，小分子量extDNA含量由占總extDNA的15%上升至40%，這說明沉積物深度增加，extDNA降解量增加。這可能因為即使在生物活性較低的深層沉積物中，DNA酶含量依舊很高。同時，Gulden等[56]探究了溫度對DNA降解動力學產生的影響，發(fā)現(xiàn)土壤下滲液中extDNA半衰期隨著溫度上升而縮短，這說明DNA降解也是一個基于反應速率的酶促反應。Henriksen和Breland[57]發(fā)現(xiàn)當環(huán)境溫度低于0 ℃時，依舊可以檢測到顯著的微生物活性，DNA依舊會緩慢降解；這可能是盡管DNA酶促反應減少，但是化學水解、化學氧化和DNA交聯(lián)等作用依舊會降解DNA。

1.3.3 轉化

自然轉化是ext/intDNA環(huán)境行為的重要部分，同時，extDNA自然轉化也是原核生物攝取、整合、使extDNA表達的主要機制。自然轉化，或稱為遺傳轉化，是指能夠從環(huán)境中獲取游離態(tài)DNA分子的感受態(tài)微生物細胞，吸收整合extDNA進入自己基因組的過程。自然轉化過程不需要特殊的蛋白機制，因而在環(huán)境中頻繁發(fā)生，尤其是自然感受態(tài)微生物細胞。自然轉化包括4個關鍵步驟：感受態(tài)細胞表面結合extDNA→細胞壁/細胞膜吸收extDNA→extDNA整合進入細菌基因組→extDNA表達[1](圖2)。extDNA成功整合進入細菌基因組后，會通過細胞間的結合及轉導作用傳播，進而進入基因傳遞網絡[58]。extDNA整合進入細菌基因組并引起表達是extDNA自然轉化的關鍵步驟，細胞質中未被整合的extDNA會很快被降解并進入DNA代謝循環(huán)[1]。

但是，并不是所有的ext/intDNA都能夠成功整合進入細菌基因組，這取決于外源鏈和染色體DNA之間的同源區(qū)域。片段大小在20～200 bp的DNA片段更容易成功整合并引起表達[58]；de Vries等[59]研究發(fā)現(xiàn)，外源DNA分子鏈不符合不動桿菌屬(Acinetobactersp.)菌株BD413目標受體染色體DNA之間的同源區(qū)域時，其整合效率比更適同源區(qū)域DNA外源鏈的整合效率低109數(shù)量級；當其外源片段DNA符合受體染色體DNA同源區(qū)時，其整合效率提高了5個數(shù)量級以上。成功進入細菌基因組并實現(xiàn)表達的ext/intDNA片段則可能進入細菌基因循環(huán)。新霉素磷酸轉移酶Ⅱ基因(nptⅡ)是一類調控植物對卡那霉素產生抗性的基因，但是在土壤非目標細菌中檢測到了這一類基因存在，如感受態(tài)細菌Acinetobactersp. BD413，BD413通過同源重組獲取nptⅡ基因，從而產生對卡那霉素的抗生素抗性[60-61]。盡管土壤中大部分細菌都對卡那霉素產生抗性，但是土壤細菌通過同源重組獲取抗性基因產生新的抗性細菌，尤其是抗性致病細菌的環(huán)境風險值得重視。

圖2 環(huán)境胞外DNA自然轉化過程Fig. 2 Natural transformation of extracellular DNA

土壤中extDNA其他環(huán)境行為也會影響參與自然轉化過程的有效態(tài)extDNA。Khanna和Stotzky[50]探究了吸附于礦物和砂礫等物質表面的extDNA自然轉化效率，發(fā)現(xiàn)extDNA從土壤顆粒中解吸并不能直接引起自然轉化發(fā)生，但是extDNA吸附于土壤顆粒時的確降低了自然轉化發(fā)生的頻次，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)在滅菌土壤體系中的自然轉化頻次比純水體系中降低了一個數(shù)量級。同時，土壤種類也會影響自然轉化頻次。Nielsen等[62]研究發(fā)現(xiàn)，Acinetobactersp. BD413在未添加營養(yǎng)物質的壤土及砂土中自然轉化發(fā)生的頻率并不相同，在砂土中BD413的自然轉化頻率是10-4，壤土中為10-7，砂土中BD413自然轉化發(fā)生的頻率比壤土中的頻次高3個數(shù)量級以上。通常情況下，土壤中熱點區(qū)域如根際、細菌生物膜和營養(yǎng)物質流動區(qū)等，extDNA自然轉化發(fā)生的頻次相對較高[63-64]；自然轉化過程一旦發(fā)生，extDNA的遺傳物質信息即會通過接合和傳導成功進入土壤微生物群落。因而，extDNA作為一種遺傳物質信息，其在物質循環(huán)及生態(tài)功能中的作用更應該受到關注[31]。

2 ext/intDNA在細菌生物膜形成中的作用(The Role of ext/intDNA in biofilms formation)

細菌生物膜是由微生物、有機質和一些非有機固體組成的混合物，有機質組成中包含多糖、脂質、蛋白質和核酸，尤其是extDNA等[5,65]。生物膜在水體環(huán)境中十分豐富，可以保護細菌免受不適環(huán)境的影響，如抗生素、重金屬及農藥污染脅迫；且由于細菌生物膜具有細胞密度較高的內聚三維網絡結構，更容易發(fā)生細胞間的相互作用，促使基因信息在extDNA等移動遺傳元件中積累，并通過群體感應和水平基因交換等過程實現(xiàn)遺傳信息的交流[66-68]。

對基質表面的初始粘附和細菌的聚集是生物膜形成中的重要步驟[69]。Das等[70]發(fā)現(xiàn)，細胞表面存在的extDNA一方面參與酸堿相互作用，另一方面為細菌粘附到疏水表面提供熱力學有利條件，能夠增強細菌生物膜形成時的粘附及細菌表面聚集作用，因而，extDNA是細菌生物膜形成中的重要介質[71]。目前，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PAO1)和葡萄球菌(Staphylococcus)常被用于探究extDNA在細菌生物膜形成中的作用。

2.1 Pseudomonas aeruginosa extDNA與其生物膜形成

PAO1是一種致病力較低，但抗藥性較強的桿菌，屬于革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界及正常人皮膚、腸道和呼吸道，是臨床上較常見的條件致病菌之一。

extDNA是P.aeruginosa生物膜形成中的重要結構前體[72]。前人研究證實，extDNA在P.aeruginosa生物膜中是作為細胞-細胞互連基質的化合物[73]；P.aeruginosa是通過外膜釋放小囊泡的方式形成extDNA，群體感應也在生物膜形成中起重要作用[74-75]。假單胞菌喹諾酮信號傳導分子(Pseudomonasquinolone signaling, PQS)誘導原噬菌體侵染浮游生物釋放extDNA，extDNA與細胞形成冠狀結構后，細胞再通過Ⅳ型菌毛發(fā)生移動，并與extDNA相互作用慢慢聚集到冠狀結構頂部。Whitchurch等[76]發(fā)現(xiàn)在實驗體系中添加DNA酶后，PAO1生物膜形成被抑制，這說明extDNA是生物膜形成中的一種重要結構成分；同時，實驗中還設計在已經形成12、36、60和84 h的生物膜中加入DNA酶，發(fā)現(xiàn)形成84 h后的生物膜受影響程度最低，這說明形成時間較久的生物膜不易被DNA酶影響，可能的原因是extDNA在此過程中被其他物質強化或生物膜產生了局部滅活DNA酶的蛋白外酶。

extDNA也能夠保護PAO1生物膜抵御外部污染物質影響。extDNA可以結合帶正電荷的抗菌劑，如氨基糖苷類和抗微生物肽，使得PAO1生物膜免受氨基糖苷類的影響[77]。有研究表明，extDNA能夠與陽離子結合，創(chuàng)造陽離子限制型環(huán)境，誘導PAO1產生pmr基因，增強其對氨基糖苷類和抗微生物肽抗性[73]；Chiang等[78]設計流動室生物膜實驗證實，外源補充的extDNA能夠整合進入PAO1生物膜，并增加PAO1對氨基糖苷類的耐受性；同時，缺失釋放extDNA能力的PAO1群體，形成的生物膜比野生型生物膜更容易受到氨基糖苷類影響，但是補充外源extDNA后又能使其對氨基糖苷類藥物耐受，這種耐受性可能來自于extDNA的保護作用。

2.2 Staphylococcus extDNA與其生物膜形成

Staphylococcus是一類革蘭氏陽性球菌，需氧或兼性厭氧，少數(shù)專性厭氧，是醫(yī)院交叉感染的重要來源[79]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和腐生葡萄球菌是葡萄球菌的3種主要類別。

S.aureus和S.epidermidis都能夠形成生物膜[79-81]。生物膜會保護細菌細胞免受抗生素侵染及宿主防御機能的殺傷，前人研究證實生物膜形成在金黃色葡萄球菌傷口感染和骨髓炎及表皮葡萄球菌導管感染中發(fā)揮作用。胞外前聚體在S.aureus和S.epidermidis生物膜形成中發(fā)揮了重要作用，如extDNA和聚(1,6)-N-乙?；?D-葡萄糖胺。extDNA是S.aureus和S.epidermidis生物膜形成中的重要胞外前聚體，能夠介導表面附著和細胞間粘附作用。Izano等[80]使用DNase Ⅰ在96孔微量滴定板中抑制S.aureus和S.epidermidis生物膜形成，分離抑制條件下形成生物膜，測定生物膜對陽離子洗滌劑氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride, CPC)的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，DNase Ⅰ會破壞S.aureus生物膜形成使其對CPC敏感，但對S.epidermidis生物膜作用不顯著，這表明extDNA在2種菌株生物膜形成中發(fā)揮著不同的結構作用，extDNA是S.aureus生物膜形成及抵御CPC殺傷主導的結構成分，而在S.epidermidis生物膜中，extDNA可能與其他胞外前聚體協(xié)同影響生物膜形成。S.epidermidis生物膜中extDNA的產生主要由自溶素AtlE控制，自溶素AtlE能夠引起生物膜細胞亞群裂解，導致DNA釋放到基質中[79]。extDNA可在基質中作為結構組分、細胞間聚集的促進因子、表面結構粘附素、N/P營養(yǎng)源，調控微生物群落中的遺傳信息交換。缺乏AtlE基因的S.epidermidis菌株形成的生物膜具有比野生型更低的extDNA豐度，并且能夠引起體內感染的能力顯著降低，表明extDNA在生物膜的致病機制中發(fā)揮重要作用[81]。此外，S.epidermidis生物膜中extDNA對二價陽離子的螯合作用可能導致生物膜抗生素耐受性提高。Doroshenko等[82]探究發(fā)現(xiàn)，在亞抑菌濃度萬古霉素的影響下，S.epidermidis生物膜RP62A中萬古霉菌的遷移被抑制，使用DNase處理生物膜，發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度萬古霉素能夠延長生物膜的持久性；試驗結果表明，在亞抑菌濃度萬古霉素影響下，生物膜中的extDNA的濃度上升，這說明，生物膜中extDNA可能抑制了萬古霉素的活性；同時添加外源extDNA和萬古霉素，S.epidermidis生物膜中浮游生物的半數(shù)致死濃度增加，這驗證了外源DNA保護生物膜中的細胞免受抗生素攻擊。

3 ext/intDNA生物功能信息傳遞(Biological functions and information transmission of ext/intDNA)

3.1 ext/intDNA與營養(yǎng)元素循環(huán)

extDNA在降解后基因信息可能不被保存，但是其降解后的元素，如C、N、P和O等元素依舊存在于環(huán)境體系，可以用于從頭合成DNA，或者可以離開DNA循環(huán)進入它們各自的元素營養(yǎng)循環(huán)，即參與食物鏈中的元素大循環(huán)[1,83]。

DNA是一種重要的P元素來源，DNA分子中10%的質量為P元素，Turner等[84-85]發(fā)現(xiàn)，自然濕地土壤中以DNA形式存在的可提取態(tài)P占22%～53%，苔原土壤中則占9%～13%。Dell’Anno和Danovaro[17]通過比較總DNA及intDNA的方法測量出深海沉積物中90%以上DNA都為extDNA；使用extDNA專性降解酶，發(fā)現(xiàn)60%±4%的DNA均可降解，這說明只有部分extDNA能夠被降解。據(jù)統(tǒng)計，沉積物來自于extDNA中的P源占總有機P的3%，高脫氧核糖核酸酶活性能夠證明extDNA是P循環(huán)的重要推動者，沉積物表層10 cm中extDNA再礦化占總有機P再礦化的17%。同時，Dell’Anno和Danovaro[17]還發(fā)現(xiàn)對浮游生物來說，extDNA降解能夠為其提供4%C源、7%N源和47%P源。其中，已有研究表明，流感嗜血桿菌(Haemophilisinfluenza)和淋病奈瑟菌(Nesseriagonorrhoeae)都能夠通過膜蛋白吸收同源和異源extDNA用于自然轉化，修復自身基因組DNA損傷或將extDNA作為自身營養(yǎng)來源[31]。

3.2 ext/intDNA的基因信息傳遞

Steinberger和Holden[21]使用隨機擴增多態(tài)性DNA分析(RAPD)比較了多物種生物膜中extDNA與intDNA的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)extDNA中的物種信息與總DNA和intDNA中的物種信息并不相同；近年來，隨著高通量測序技術及宏基因組技術的發(fā)展，更多研究使用16S rRNA高通量測序技術比較分析ext/intDNA中物種多樣性信息[20,34,43,86]。結果顯示，環(huán)境中ext/intDNA都來源于多種物種，一方面，extDNA可在環(huán)境中持久存在，其對應物種可以包含歷史變遷物種[35]；另一方面，并不是所有的物種分泌的extDNA都能夠在環(huán)境中保存，因而，intDNA和extDNA分別對應的物種信息并不一一對應，有其相似性，也有不同。

Corinaldesi等[19]使用16S rDNA和18S rDNA技術探究了厭氧深海沉積物中extDNA的來源、保存情況和遺傳印記等信息，發(fā)現(xiàn)盡管在深海沉積物中DNA酶活性非常高，但是依舊檢測到大量extDNA存在，16S rDNA和18S rDNA基因拷貝數(shù)很高，分別為109～1010copies·g-1(沉積物)和109～1011copies·g-1(沉積物)，說明其中extDNA含有大量基因序列。因而，從這些環(huán)境體系分離得到extDNA和intDNA，并對其對應的物種信息和基因信息進行判定是近年來關于ext/intDNA的研究熱點之一。

3.2.1 ext/intDNA與功能基因

功能基因(fuctional genes)是一類能夠調控C、N、P、S和Fe元素循環(huán)、指示環(huán)境微生物功能的基因，廣泛存在于土壤、水體和沉積物等環(huán)境體系中，通常與元素循環(huán)和蛋白調控等功能相關聯(lián)。

常見的功能基因有四大類，一類是生物地球化學循環(huán)基因(biogeochemical cycle genes, BCGs)，通常與C、N、P、S和Fe等元素轉化有關，如N硝化基因amoA、N反硝化基因nosZ、nirK/S等，其與N硝化/反硝化過程緊密結合，通?；蜇S度與反應過程快慢密切相關；第二類是抗生素抗性基因類(antibiotic resistance genes, ARGs)，抗性基因是抗性遺傳信息的載體，通常與抗生素種類有關，如四環(huán)素類抗性基因tetW、tetM和tetQ等，目前關于抗性基因與ext/intDNA相互關系的研究較多；第三類功能基因與系統(tǒng)發(fā)育標記有關(phylogenetic marker genes, PMGs)，代表基因有指示GTP結合蛋白的基因lepA、蛋白質翻譯延伸因子G基因fusA等；第四類功能基因是植株致病基因(plant pathogenicity genes, PPGs)，代表基因有與生物合成和調節(jié)thaxtomin(植物毒素，一種含有4-硝基吲哚的二肽分子)相關的基因txtA、txtB等。這里介紹BCGs與ext/intDNA的相互關系。

目前，關于extDNA和intDNA分離后各自體系中含有的BCGs的研究較少，多數(shù)研究利用熒光定量PCR技術和宏基因組學技術探究總DNA中含有的BCGs[83,87]；Gómez-Brandón等[83]使用熒光定量PCR技術，選擇C-循環(huán)基因引物(cell、xyl、alfagluc和betagluc)、P-循環(huán)基因引物(acP、alkP、bisP、leu和lys)、S-循環(huán)基因引物(aryS)以表征森林不同土壤類型和不同土壤深度下ext/intDNA中含有的基因對應酶活性及其對應細菌-真菌-古菌物種，并使用extDNA與intDNA比值表征生物活性，發(fā)現(xiàn)ext/intDNA中表征的基因類型、對應物種組成均不相同；覆蓋有地被植物的森林土壤比草地和落葉覆蓋的森林土壤具有更高的酶活性；草地覆蓋的深層土壤具有較高的extDNA/intDNA，這表明，隨著土層深度增加土壤生物活性較低且extDNA更容易降解。值得注意的是，沉積物和土壤中的extDNA含量高于intDNA，extDNA含有豐富的C、N、P和O等元素，在16S rDNA和18S rDNA基因拷貝數(shù)中也占據(jù)較高比例，并且微生物釋放的extDNA積極參與吸附、降解和自然轉化等環(huán)境過程，是環(huán)境中不可忽視的營養(yǎng)元素、基因信息來源[88]。因而，上述環(huán)境樣品中分別來源于extDNA和intDNA的BCGs比例、以及這些BCGs是否會通過自然轉化被其他微生物獲取整合、并參與微生物功能注釋直至影響微生物群落物質轉化與能量傳遞，依舊是值得深入探究的問題。

3.2.2 ext/intDNA與抗性基因

中國是世界上最大的抗生素使用國之一。醫(yī)療及畜禽養(yǎng)殖中使用的抗生素通常不會被人體及畜禽完全代謝吸收，超過90%抗生素會通過排泄等進入環(huán)境，進而在長期的自然篩選中，誘發(fā)環(huán)境中抗性細菌的富集，引發(fā)過量抗性基因的表達[89]?？剐曰蚩赡芪挥谌旧w和一些移動遺傳元件上，如質粒、轉座子或整合子，在環(huán)境中作為細胞內抗性基因(intracellular antibiotic resistance genes, iARGs)和細胞外抗性基因(extracellular antibiotic resistance genes, eARGs)存在[13,34]。iARGs可通過自我復制傳遞給后代，也能夠通過水平基因轉移(接合或傳導)等方式傳遞給其他物種；eARGs則可能通過自然轉化被細菌吸收[13,90]。已有的研究表明，緩癥鏈球菌(S.mitis)和口腔鏈球菌(S.oralis)這2種菌株具有盤尼西林抗生素抗性，其抗性基因pbp2x能夠傳遞給肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)菌株，使后者也具有盤尼西林抗性；前者也能從非典型韋榮菌(Veillonelladispar)菌株處獲取四環(huán)素抗性。因而，e/iARGs在環(huán)境中的存留和傳播值得探究，eARGs由于能夠通過轉化進入細菌體內，其對人體健康及生態(tài)系統(tǒng)造成的威脅更應該受到關注[1]。

已有學者研究發(fā)現(xiàn)，在河流、湖泊、沼澤及極少受人為干擾的地下水、冰川和水庫等水體環(huán)境中都分別檢測到了i/eARGs的存在[13,24,90-93]。Zhang等[94]采集渤海海岸附近的水體及沉積物樣品，使用熒光定量PCR檢測樣品中的sul1、sul2、tetM、tetB、blaTEM和qnrS等抗性基因，發(fā)現(xiàn)水體中eARGs相對豐度為(4.30±1.30)×10-1基因拷貝數(shù)，沉積物中則為(2.60±0.30)×10-3基因拷貝數(shù)；同時，樣品中eARGs豐度顯著高于iARGs。Guo等[24]采集了來自長江口的自然水體、沉積物及生物膜樣品，探究5類22種ARGs的檢出率及豐度，大部分基因的檢出率及豐度高低依次是：生物膜>沉積物>水體；這歸因于環(huán)境中高濃度的抗生素，加速了生物膜中ARGs的產生及傳播；同時大多數(shù)來自于生物膜及沉積物中的ARGs為eARGs，eARG占總ARGs 60%以上，且與生物膜及沉積物中總有機碳(TOC)顯著正相關，eARGs在生物膜-水中的分配系數(shù)>沉積物-水中的分配系數(shù)，充分說明生物膜是水體環(huán)境中重要的ARGs來源。Dong等[34]檢測了來自醫(yī)療廢水、制藥業(yè)、污水處理廠和豬糞的污泥樣品，以及城市湖泊沉積物中的10類抗性基因sul1、sul2、tetW、tetX、ermA、ermB、blaTEM、ampC、cat、cmr和一類轉座子(intI1)，發(fā)現(xiàn)eARGs豐度檢測范圍在7.31×103～1.16×1010copies·g-1(干重污泥)，iARGs變化范圍在1.04×105～2.74×1012copies·g-1(干重污泥)；研究使用攜帶β-內酰胺抗性基因(blaSHV)的質粒pMD20-T作為一種eARG，大腸桿菌E.coliDH 5α作為受體，探究eARG在環(huán)境中的轉化能力，發(fā)現(xiàn)沉積物吸附態(tài)eARG和游離態(tài)eARGs的轉化效率分別為每微克質粒DNA中含(1.21±0.19)×103轉化體和(6.67±0.53)×102轉化體，并且與游離態(tài)extDNA相比，吸附態(tài)extDNA更容易與感受態(tài)細胞耦合，這與前人的研究結果[95-96]一致，可能與DNA的構象有關，具體機制還有待探明。

4 研究不足與研究展望(Research disadvantages and prospect)

目前，關于環(huán)境中ext/intDNA較為全面的研究主要集中于ext/intDNA環(huán)境行為、extDNA在不同模式菌株生物膜形成中的表面粘附及聚集細菌等作用、不同環(huán)境體系中e/iARGs的豐度及其與對應微生物的生態(tài)關系等內容。但是，ext/intDNA環(huán)境功能及生態(tài)效應研究依舊是值得關注的問題。

(1)精準分離環(huán)境中不同形態(tài)ext/intDNA及對其精準定量是研究ext/intDNA環(huán)境功能及生態(tài)效應的技術基礎[7-8,13,97]。現(xiàn)行的提取土壤/水體/沉積物等體系中ext/intDNA的方法是使用磷酸鹽緩沖溶液提取，難以區(qū)分游離態(tài)、松散結合態(tài)及緊密結合態(tài)extDNA，提取效率不穩(wěn)定，因而難以區(qū)分不同形態(tài)extDNA的具體環(huán)境效應；同時，環(huán)境中ext/intDNA來源廣泛，包括細菌、真菌、放線菌和噬菌體等，同時0%～83% extDNA來源于死亡微生物，細菌、真菌等微生物對extDNA的貢獻比例及不同環(huán)境體系extDNA來自死亡微生物的比例依舊值得探索。

(2)驗證ext/intDNA中功能基因含量及其是否作為活躍的基因攜帶者積極參與環(huán)境過程是探究ext/intDNA環(huán)境功能及生態(tài)效應的理論基礎。目前常使用熒光定量PCR檢測技術判定ext/intDNA功能基因含量，使用高通量測序技術分析功能基因攜帶者；宏基因組學分析能夠同時測定功能基因含量，鑒定功能基因攜帶者。因而，ext/intDNA-宏基因組學分析可能是同時判定環(huán)境體系ext/intDNA不同微生物群落組成、基因豐度及其功能的更為有效的檢測技術。

(3)探明ext/intDNA對植株-動物-微生物病原體的抵御機制是拓展ext/intDNA環(huán)境功能及生態(tài)效應研究的重要依據(jù)。extDNA是植株根冠粘液基質中的一種重要組分，在植株抵御病原體的過程中發(fā)揮重要作用[98]；但是植株extDNA產生的來源及extDNA在植株體內對病原體的抵御機制尚不明確。植株extDNA的獲取來源、抵御機制以及這種抵御機制與植株體內其他抵御機制的合作關系等，都有待深入探明。

(4)ext/intDNA環(huán)境功能及生態(tài)效應研究最終落腳于探究ext/intDNA在生態(tài)群落多樣性中發(fā)揮的作用。ext/intDNA中包含的功能基因及其指示微生物種群各自參與環(huán)境過程并不相同，對生態(tài)系統(tǒng)的調控作用也有差別；因而，為探明ext/intDNA在生態(tài)功能多樣性中的重要作用，還應理解ext/intDNA營養(yǎng)元素物質循環(huán)、功能微生物種群歷史變遷和功能微生物生態(tài)位等過程。

綜上，ext/intDNA在環(huán)境中參與吸附、降解和自然轉化等環(huán)境過程，extDNA幫助形成細菌生物膜及在細菌生物膜中為微生物緩沖來自抗生素、農藥和重金屬等污染物的環(huán)境壓力，ext/intDNA在物質傳遞、功能基因水平轉移過程中都有其獨特的環(huán)境功能及生態(tài)意義，但環(huán)境中ext/intDNA定量及其生態(tài)功能多樣性依舊值得進一步探索。