桂籽提取物對大鼠急性肺損傷的作用及其機制*

呂偉，閔清，王俊杰，劉秀，晏思齊，周凌峰，張雨晨，刁婷婷，白育庭

(湖北科技學院1.藥學院；2.臨床醫(yī)學院，咸寧 437100)

桂花系木犀科木犀屬植物，是我國長江以南地區(qū)特色植物資源。桂花種類豐富多樣，銀桂、金桂、丹桂等都具有較好的開發(fā)價值。桂花的花、枝葉、根莖、果實、籽均具有藥用價值[1]。《本草綱目》記載桂花籽的藥用價值：桂花籽，其性溫其味甘，具有行氣化濕、祛風止痛、溫中散寒之功效；《江蘇藥材志》記載：桂花籽可暖胃、益腎、散寒[2]?，F(xiàn)代研究顯示，桂籽含有較豐富的活性物質，如環(huán)烯醚萜苷類、三萜類、紅景天苷類物質等，環(huán)烯醚萜苷為桂籽中主要的物質。環(huán)烯醚萜苷類物質在植物中分布廣泛，梔子、木瓜等木樨科植物中含量均較高。梔子、木瓜中環(huán)烯醚萜苷已被證實有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，桂籽中環(huán)烯醚萜苷是否具有用抗炎作用，筆者所見文獻報道不多。為更好開發(fā)利用桂花資源，筆者初步完成了桂籽提取物的提取及含量測定。筆者在本實驗進一步探討桂籽提取物環(huán)烯醚萜苷對大鼠急性肺損傷的保護作用，以期為桂籽的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗儀器 arium 611DI型超純水系統(tǒng)(德國Sartorius公司)；AF103AS型制冰機(意大利Scosman公司)；HH.W21.600型電熱恒溫水浴箱(浙江金壇市富華儀器公司)；TGL-20M型低溫高速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司)；Synergy2型多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)；ZT-12M型全自動生物組織脫水機(湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術有限公司)；BX53型光學顯微鏡(日本奧林巴斯)；RE-301型旋轉蒸發(fā)儀(鄭州市亞榮儀器有限公司)；BSA224S型BP211 D分析天平(德國賽多利斯集團，感量：0.01 mg)；RM2235型手動輪轉式切片機(Leica公司)；YT-TFB型生物組織攤片機(湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術有限公司)；YB-6LF型生物組織石蠟包埋機(湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術有限公司)；ChampChemi Basic型自動發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)；1645050型Power/Pac 300電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2試藥 桂籽2017年4月下旬采摘于湖北科技學院校園內(咸寧職業(yè)技術學院王振啟教授鑒定為金陽光品種桂花的籽)，去除果皮、果肉，70 ℃ 烘干桂籽，去除籽皮，剝離籽仁，粉碎，過100目篩(篩孔內徑：0.15 mm)。95%乙醇(批號：20160628)、石油醚(批號：20160311)、乙酸乙酯(批號：20160308)、正丁醇(批號：20160912)均為國藥集團AR級。甲醛組織固定液購于武漢科瑞生物公司(批號：20171120)；髓過氧化物酶(myelo peroxidase，MPO，批號：20180812)、腫瘤壞死因子α(TNF-α，YX-201407R，批號：20180613)試劑盒均購于南京建成生物公司；NF-κBp65(批號：20180124)抗體購于Cell Signaling Technology；IκBα(AF1282)抗體購于碧云天生物技術公司(批號：0706181909)；酵母購于安琪酵母股份有限公司(1552840，批號：CF20180710W2F33)；潑尼松片(批號：170518)購于浙江仙琚制藥股份公司。

1.3實驗動物 無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠，體質量(180±20) g，購于斯貝福北京生物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0002，實驗動物合格證號：SCXK(京)2016-0002。溫度(23±2) ℃，相對濕度45%～60%，大鼠自由飲水，每只大鼠按5 g·(100 g)-1喂食。

1.4實驗方法

1.4.1桂籽粗提物的制備 取粉碎后的桂籽1272.12 g，石油醚(沸程60～90 ℃)12 L冷浸48 h脫脂，抽濾，濾液回收，濾渣陰干。取陰干的濾渣，95%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，收集濾液濃縮得到桂籽粗提物573.80 g。浸膏加雙純水1.5 L制成較濃混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取3次，合并相應萃取液，正丁醇萃取液部分即為下一步研究所用藥物。實驗組前期已經(jīng)鑒定，所提物質為環(huán)烯醚萜總苷，含量79.08%。

1.4.2大鼠的分組、造模與給藥 取健康雄性SD大鼠48只，隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型對照組、潑尼松組和桂籽粗提物大、中、小劑量組，每組8只，適應性喂養(yǎng)1周，按每只20 g·d-1投喂飼料，自由飲水。適應性喂養(yǎng)結束后，桂籽提取物大劑量組給予桂籽提取物(osmanthus fragrous extract n-butanol portion,OFSN)400 mg·kg-1，中劑量組給予OFSN 200 mg·kg-1，小劑量組給予OFSE 100 mg·kg-1，潑尼松組給予潑尼松3 mg·kg-1，空白對照組和模型對照組給予等容量0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)灌胃10 d。模型對照組和給藥組于第10天灌胃結束1 h后腹腔注射20%酵母混懸液，12 h后再次腹腔注射酵母混懸液，并給予相應藥物。24 h后經(jīng)腹主動脈取血，處死大鼠，開胸取肺[3-4]。

1.5檢測指標

1.5.1肺指數(shù)(lung index，LI) 實驗開始前稱量、記錄各組大鼠體質量，開胸放血，取大鼠全肺記錄濕質量，肺濕質量/體質量為肺指數(shù)。

1.5.2肺濕/干比(lung wet/dry ratio，W/D) 取大鼠左肺，濾紙吸干表面血液及水分，稱定質量，記錄濕質量(W)。將稱量后肺組織65 ℃烘箱持續(xù)烘烤72 h，記錄干質量(D)。計算肺W/D。

1.5.3蘇木精-伊紅(HE)染色 取大鼠右肺上葉，于中性甲醛固定液保存24 h，按步驟對組織脫水、石蠟包埋、HE染色、中性樹膠封片，光鏡下觀察肺病理變化。

1.5.4MPO、白細胞介素2(IL-2)、IL-6、TNF-α測定 取大鼠左肺上葉，按照說明書配置MPO試劑作為勻漿介質，按質量體積比1：19加勻漿介質，制備成5%組織勻漿，按照操作表操作。96孔酶標板進行實驗，試劑混勻后，60 ℃ 水浴10 min，取出后在酶標儀上460 nm波長處測定各孔吸光度值，根據(jù)公式：MPO活力值(U/克組織濕質量)=(測定A值-對照A值)/11.3×取樣量(克)，得出各組MPO活力值。

經(jīng)腹主動脈取血，離心，取上清液。實驗操作步驟與測定MPO相同，分別測定血漿IL-2、IL-6、TNF-α含量。

1.5.5Western blotting法檢測NF-κBp65及IκBα蛋白表達水平 取右肺下葉，按照組織與裂解液質量體積比1：9進行組織裂解[裂解液中苯甲基磺酰氟(pheylmethamesulfonyl fluoride，PMSF)、cooktail、釩化鈉均為1%]。低溫高速離心3030×g機4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min后收集上清液。二奎琳甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定組織蛋白濃度，30%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，脫脂牛奶封閉，NF-κBp65、IκBα一抗孵育4 ℃過夜，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的二抗常溫孵育1.5 h后，電化學發(fā)光法(electro-chemiluminescence,ECL)顯色液顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析目的條帶灰度值。

2 結果

2.1W/D、LI、MPO活性測定結果 模型對照組大鼠W/D、LI、MPO活力值較空白對照組顯著增加(P<0.05，F(xiàn)W/D=8.060，F(xiàn)LI=4.771，F(xiàn)MPO=22.83)，說明模型成功；各給藥組W/D(P<0.01)、LI(中劑量組P<0.05，大劑量組P<0.01)、MPO活力值(中劑量組P<0.05，大劑量組P<0.01)較模型對照組下降明顯(FW/D中=27.49，F(xiàn)W/D大=31.51，F(xiàn)LI中=2.485，F(xiàn)LI大=1.703，F(xiàn)MPO中=4.192，F(xiàn)MPO大=4.069)。說明桂籽提取物對急性肺損傷大鼠有一定保護作用，結果見表1。

2.2TNF-α、IL-2、IL-6表達情況 模型對照組大鼠TNF-α、IL-2、IL-6表達較空白對照組明顯升高(P<0.01，F(xiàn)TNF-α=2.743，F(xiàn)IL-2=13.96，F(xiàn)IL-6=210.8)，說明模型成功；各給藥組TNF-α、IL-2、IL-6表達較模型對照組明顯下降(FTNF-α中=30.17，F(xiàn)TNF-α大=6.903，F(xiàn)IL-2中=11.61，F(xiàn)IL-2大=11.99，F(xiàn)IL-6中=3.728，F(xiàn)IL-6大=6.730)，說明桂籽提取物有一定抗炎作用，結果見表2。

2.3NF-κBp65及IκBα蛋白表達情況 與空白對照組比較，模型對照組NF-κBp65表達明顯增強；與模型對照組比較，各給藥組蛋白表達均不同程度減弱；與空白對照組比較，模型對照組IκBα表達明顯減少；與模型對照組比較，各給藥組蛋白表達不同程度增強(P<0.01)。提示酵母所致炎癥與激活NF-κB信號通路有關。結果見圖2，3。

表1 OFSN對SD大鼠W/D值、LI值及肺組織勻漿MPO的影響

組別劑量/(mg·kg-1)W/DLI/[g·(100 g)-1]MPO/(U·g-1)空白對照組-5.541±0.18000.531±0.00813.788±0.3364模型對照組-8.141±0.5111①0.617±0.018①10.620±1.6070①潑尼松組35.910±0.1211②0.549±0.0104②4.724±0.5890②OFSN 小劑量組1007.467±0.2314①0.597±0.0068①6.806±1.1010③ 中劑量組2006.051±0.0975②③0.569±0.0112②④5.426±0.7851④ 大劑量組4005.693±0.0910②0.558±0.0136 ④5.089±0.7969②F值8.0604.77122.830P值<0.05<0.05<0.05

①與空白對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01；③與空白對照組比較，P<0.05；④與模型對照組比較，P<0.05。

①Compared with blank control group，P<0.01；②compared with model control group，，P<0.01；③compared with blank control group，P<0.05；④compared with model control group，P<0.05.

表2 OFSN對SD大鼠血漿TNF-α、IL-2、IL-6的影響

組別劑量/(mg·kg-1)TNF-αIL-2IL-6空白對照組-2.896±0.312923.38±2.100137.4±0.450模型對照組-18.520±0.1890①79.63±7.845①176.6±5.951①潑尼松組33.936±0.6092②27.75±2.795②142.3±2.294②OFSN 小劑量組10017.900±0.4149①③35.88±2.903①②168.3±4.362① 中劑量組2006.021±1.0380②④29.63±2.302②144.2±3.082②④ 大劑量組4003.938±0.4965②27.75±2.266②142.1±2.294②

①與空白對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01；③與模型對照組比較，P<0.05；④與空白對照組比較，P<0.05。

①Compared with blank control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01；③compared with model control group，P<0.05；④compared with blank control group，P<0.05.

2.4形態(tài)學結果 HE染色后光鏡下(×20)觀察，模型對照組肺間大量炎癥細胞浸潤，支氣管壁明顯增厚，各給藥組病變較模型對照組明顯改善，見圖1。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.潑尼松組；D.OFSN小劑量組；E.OFSN中劑量組；F.OFSN大劑量組。

圖1 OFSN對急性肺損傷的影響(HE，×200)

A.blank control group；B.model control group；C.prednisone group；D.OFSN low-dose group；E.OFSN medium-dose group；F.OFSN large-dose group.

Fig.1EffectofOFSNonacutelunginjury(HE，×200)

3 討論

急性肺損傷的發(fā)生原因較復雜，目前認為主要是由于失控的炎癥反應所致，其基本病理變化為肺泡上皮黏膜損傷導致肺部毛細血管通透性改變，從而誘發(fā)組織水腫[5]。當機體產(chǎn)生炎癥細胞時，炎癥細胞浸潤于肺部，導致肺部發(fā)生炎癥反應，甚至炎癥反應失控，進一步加重肺損傷。本實驗中HE染色結果表明，模型對照組肺部有明顯炎性細胞浸潤，提示肺損傷發(fā)生[6-7]。

①與空白對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01。

①Compared with blank control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01.

酵母所致急性肺損傷是一種全身性炎癥反應。大量中性粒細胞在肺內扣押導致肺部損傷，MPO是反映中性粒細胞多少的重要指標。肺組織勻漿中MPO含量可以直接反映中性粒細胞在肺內浸潤情況[8-10]。結果表明模型對照組MPO含量明顯高于空白對照組，各給藥組含量明顯降低。有研究表明，酵母菌進入機體后會被巨噬細胞吞噬，被吞噬后不降解，從而刺激巨噬細胞分泌TNF-α。TNF-α是一種炎性因子，也是促炎因子，是炎癥反應最先應答炎性因子，能促進其他炎性因子釋放，如IL-2、IL-6等[11]，這些炎性因子釋放又能進一步激活更多的免疫細胞，從而形成炎性循環(huán)。另一方面自由基的累積在炎癥發(fā)生過程中也扮演著重要角色[12-14]。巨噬細胞受到刺激后產(chǎn)生大量活性氧，與細胞模上的還原性輔酶Ⅰ結合，從而產(chǎn)生大量自由基，自由基累積加重組織損傷[15]。

NF-κB是炎癥反應中心，是與炎癥相關的重要信號通路[16]。有研究表明，腹腔注射酵母后激活TLR4受體，導致NF-κB特異性抑制蛋白IκB蛋白降解。在IκB的多個亞基中IκBα最重要，本實驗通過檢測IκBα表達量，發(fā)現(xiàn)在炎癥通路激活后IκBα降解增多。NF-κB由亞基蛋白p65、p50組成，炎癥發(fā)生時IκBα降解，從而激活NF-κB p65，調控相關炎癥因子基因表達。本實驗結果顯示，TNF-α表達增強[17]。

①與空白對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01。

①compared with blank control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01.

本實驗結果表明，酵母混懸液所致急性肺損傷模型成功， 模型對照組肺部大量炎癥細胞浸潤。相關炎癥指標在模型對照組含量升高，這一定程度上可能與調控NF-κB信號通路有關。