GC-MS比較三種發(fā)酵乳的揮發(fā)性化合物

李安，邢軍，馬龍，張瑞

（1. 新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830054；2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院烏魯木齊，830046）

0 引 言

開菲爾（Kefir）是高加索地區(qū)原產(chǎn)傳統(tǒng)的酒精性發(fā)酵乳飲料，以牛乳為主要原料，添加含有乳酸菌和酵母菌的粒狀發(fā)酵劑（開菲爾粒[1-2]），通過發(fā)酵而生產(chǎn)的具有酸味和氣泡性的酒精性保健飲料[3]。新疆地區(qū)少數(shù)民族自古以來就有制作和食用發(fā)酵乳制品的習(xí)慣，傳統(tǒng)的乳制品制作方法有著明顯的地域性，做成的乳制品有著濃厚的地區(qū)特色和風(fēng)味[3-4]。西藏靈菇酸奶則是通過西藏本地一種特有外形酷似白色的“菇”的復(fù)合菌種——西藏靈菇加入牛乳發(fā)酵制成。二者的制作工藝一般使用皮囊盛裝牛乳或馬乳，皮囊中蘊(yùn)含著豐富的微生物種群，然而，不同地區(qū)的牧民甚至同一地區(qū)不同家庭的牧民在制作發(fā)酵乳制品時(shí)，使用的菌種也會(huì)有所不同，使其在發(fā)酵過程中形成具有濃郁地方特色的制品。經(jīng)過幾千年的馴化，這些傳統(tǒng)乳制品中保留了許多具有傳代性好，抗逆性強(qiáng)，風(fēng)味濃郁獨(dú)特的乳酸菌菌群[5-11]。傳統(tǒng)的乳制品制作方法有著明顯的地域性，濃厚的地區(qū)特色和風(fēng)味，為發(fā)酵乳制品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究開發(fā)提供了寶貴的資源[11]。

在工業(yè)生產(chǎn)中，乳制品的風(fēng)味成分是值得關(guān)注的問題，發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)千差萬別，種類繁多，并不是每種風(fēng)味物質(zhì)都對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味起決定性作用，這是因?yàn)楦鞒煞值暮坎煌?，只有在其濃度超過閾值時(shí)才能被察覺并產(chǎn)生風(fēng)味。因此風(fēng)味物質(zhì)的提取技術(shù)就很重要，靜態(tài)頂空技術(shù)是指容器中一定量的液體或固體樣品在一定的空間頂部，在一定的溫度、壓力、時(shí)間等條件下，收集熱力學(xué)平衡態(tài)的上空氣體的一種氣體成分采集技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快捷，對(duì)氣體成分采集較為全面，適宜于定性分析，進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，還須考慮樣品基體干擾問題[12-14]。

本實(shí)驗(yàn)采用頂空-氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析新疆地方特色發(fā)酵乳制品開菲爾、西藏靈菇發(fā)酵乳和兩種發(fā)酵劑混合發(fā)酵乳的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行定性半定量分析，意在了解三種酸奶中主要風(fēng)味物質(zhì)組成與特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 原料

菌種，新疆瑪納斯縣牧民傳統(tǒng)家庭制作的發(fā)酵乳制品，再由實(shí)驗(yàn)室制備獲得開菲爾粒。

西藏靈菇發(fā)酵劑。

牛奶，西域春牌純牛奶。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A-5975C GC-MS 聯(lián)用儀（USA Ag?ilent 公司），烘干箱，恒溫箱等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備和培養(yǎng)

(1) 牛乳加熱處理

將牛乳作為培養(yǎng)基質(zhì)，采用80 ℃熱處理20 min，備用。

(2) 發(fā)酵劑活化

開菲爾粒固態(tài)發(fā)酵劑→研磨粉碎→溫水30 ℃泡洗3 次→按質(zhì)量比1∶5接種在冷卻至35～40 ℃的牛乳中→37±1 ℃培養(yǎng)24 h→過濾獲得開菲爾?！貜?fù)上述活化培養(yǎng)次數(shù)2-3 次→過濾獲得發(fā)酵用開菲爾粒

將西藏靈菇依上述方法同樣進(jìn)行活化備用。

(3)接種發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)

將活化后獲得的兩種發(fā)酵劑分別接種于已殺菌牛乳的發(fā)酵瓶中，置于27±1 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，取發(fā)酵24 h 樣品待測(cè)，同時(shí)將活化后的開菲爾粒與西藏靈菇1:1 比例混合后依上述培養(yǎng)過程進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵24 h 樣品待測(cè)，每種發(fā)酵乳取三個(gè)平行樣進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 靜態(tài)頂空GC-MS測(cè)定條件

(1) GC條件：HP-INNOWax 毛細(xì)管色譜柱(0 ℃-265±5 ℃)∶(60m × 250 μm × 0.25 μm)；氣化室溫度:250 ℃；輔助加熱器溫度: 280 ℃；升溫程序：起始溫度50 ℃以10 ℃/min 升溫到90 ℃，最后以4 ℃/min 升至240 ℃，保持20 min；載氣：高純He；流速：0.8 mL/min；分流比100∶1。

(2) MS 條件：電離方式：EI；電子能量70 eV；離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z：50～500；全掃描；溶質(zhì)延遲0 min；調(diào)諧文件為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧。

(3) 頂空參數(shù)：7697 A (Agilent)，加熱箱溫度：150 ℃；定量環(huán)溫度：170 ℃；傳輸線溫度：180 ℃；樣品平衡時(shí)間：40 min；進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間：1 min；GC 循環(huán)時(shí)間：65 min；樣品瓶體積：20 mL，樣品量2 mL。

2 結(jié)果與分析

采用靜態(tài)頂空富集3 種發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，經(jīng)GC-MS 分離檢測(cè)。3 種發(fā)酵乳樣品平行取樣測(cè)定，得到色譜圖如圖1、2、3所示。

圖1 新疆特色發(fā)酵乳制品開菲爾風(fēng)味物質(zhì)GC-MS色譜圖

圖2 開菲爾粒與西藏靈菇混合發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)GC-MS色譜圖

圖3 西藏靈菇發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)GC-MS色譜圖

檢索NIST 譜圖庫(kù)及未知物檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，共定性107 種化合物，利用歸一化法計(jì)算出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在各發(fā)酵乳中的相對(duì)含量（見表1）。

2.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)鑒定結(jié)果

由表1 可知3 種發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味成分主要包括酸類、酮醛類、呋喃類、醇類、酯類等6 大類。3 種發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)的含量差距很大，西藏靈菇發(fā)酵乳中環(huán)己烯酮為特有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，開菲爾乳中脂類物質(zhì)種類最多，使得3種酸奶各有各的風(fēng)味特征。

2.2 揮發(fā)性成分種類的分析

2.2.1 醇類物質(zhì)

醇類物質(zhì)是酒精發(fā)酵，氨基酸轉(zhuǎn)化降解的產(chǎn)物[12-16]，是反映發(fā)酵乳制品風(fēng)味質(zhì)量的重要指標(biāo)，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果醇類共13 種，其中新疆特色開菲爾發(fā)酵乳中以麥芽糖醇，1-氯代-3,5-二甲基-1-己烯-4-醇作為主要的醇類風(fēng)味物質(zhì)，相對(duì)峰面積分別為4.55%和2.89%，而開菲爾粒-西藏靈菇發(fā)酵乳中醇類優(yōu)勢(shì)物為苯乙醇，相對(duì)峰面積50.18%，西藏靈菇發(fā)酵乳中1-氯代-3,5-二甲基-1-己烯-4-醇的相對(duì)峰面積達(dá)到31.04%。兩者單獨(dú)發(fā)酵時(shí)1-氯代-3,5-二甲基-1-己烯-4-醇在醇類物質(zhì)中含量較多，二者混合發(fā)酵時(shí)醇類中的優(yōu)勢(shì)物發(fā)生改變。

2.2.2 酮醛類物質(zhì)

表1 3種發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)GC-MS比較結(jié)果

（續(xù)表3）

（續(xù)表3）

醛酮類物質(zhì)的香氣閾值較低，酮類具有甜的焦糖香韻或者谷物香氣，安息香醛具有苦杏仁的香味[12-16]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果醛酮類物質(zhì)共有17 種，其中2(5H)-呋喃酮為三種發(fā)酵乳共有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之一，在新疆特色開菲爾發(fā)酵乳與開菲爾粒-西藏靈菇混合發(fā)酵乳中3-糠醛是優(yōu)勢(shì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之一，相對(duì)峰面積分別為42.76%和74.75%。

2.2.3 有機(jī)酸類物質(zhì)

本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出新疆特色開菲爾發(fā)酵乳有機(jī)酸類物質(zhì)有9 種，己酸，十四酸，正癸酸等作為主要的風(fēng)味物質(zhì)。而混合發(fā)酵乳中苯甲酰亞甲基二乙酸以11.89%的相對(duì)峰面積在11 種有機(jī)酸類物質(zhì)中表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)風(fēng)味物質(zhì)。西藏靈菇發(fā)酵乳中庚酸為主要酸類物質(zhì)，相對(duì)峰面積21.44%。酸類物質(zhì)一般在前發(fā)酵期產(chǎn)生，今后在酸奶的前發(fā)酵階段，應(yīng)加大優(yōu)化調(diào)控力度，降低揮發(fā)酸產(chǎn)生量，將其控制在一個(gè)合理范圍[12-16]。

2.2.4 酯類物質(zhì)

酯類物質(zhì)是一種良好的風(fēng)味成分，是乳制品香氣的重要組成成分之一[12-16]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果共測(cè)得酯類物質(zhì)有22 種，其中環(huán)丁酸,2-二甲基氨基乙基酯和2-丙烯酸,丁酯是西藏靈菇發(fā)酵乳中獨(dú)有的風(fēng)味物質(zhì)，相對(duì)峰面積分別為10.04%和3.98%。新疆特色開菲爾發(fā)酵乳中油酸乙酯為主要的脂類物質(zhì)貢獻(xiàn)風(fēng)味，其相對(duì)峰面積為15.2%。而混合發(fā)酵乳中的酯類物質(zhì)以戊酸,2-羥基乙酯為優(yōu)勢(shì)風(fēng)味物質(zhì)，相對(duì)峰面積為7.58 %。

2.2.5 呋喃類物質(zhì)

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果呋喃類物質(zhì)共有4 種，其中西藏靈菇發(fā)酵乳中未檢測(cè)到呋喃類風(fēng)味物質(zhì)。新疆特色開菲爾發(fā)酵乳與混合發(fā)酵乳中的呋喃類物質(zhì)相對(duì)峰面積同樣未超過1%，2-正丁基呋喃與3-甲基呋喃分別為兩種乳制品中相對(duì)峰面積較大的風(fēng)味物質(zhì)，相對(duì)峰面積分別為0.18%和0.52%。呋喃類化合物是酸奶的重要風(fēng)味物質(zhì)之一，是反映酸奶風(fēng)味質(zhì)量的重要指標(biāo)，牛奶和各種乳制品經(jīng)過加熱和貯藏，可產(chǎn)生各種呋喃類化合物。在加工過程中還原糖與含有游離氨基的化合物接觸會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，其產(chǎn)物經(jīng)過相互作用，會(huì)生成呋喃與吡喃類化合物而產(chǎn)生嗅感[12-16]。

2.2.6 烷烴類物質(zhì)

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果烷烴類物質(zhì)共有15 種，其中西藏靈菇發(fā)酵乳中5 種，混合發(fā)酵乳中6 種，新疆特色開菲爾發(fā)酵乳中6 種。分析認(rèn)為與風(fēng)味物質(zhì)關(guān)系不密切，可能是氣相色譜柱加熱后揮發(fā)成分，不作為特征風(fēng)味成分。

2.2.7 其他類風(fēng)味物質(zhì)

包括1-[(1-氧-2-丙烯基)氧]-2,5-丁二酰亞胺，苯酚，N-(芐氧基)-2,2,2-三氟乙酰胺，4,5-二氫-3-甲基-1-丙基-1H-吡唑，甲基-2-氧-甲基-β-D-木吡喃糖苷，2-(1-甲基乙基)-噻吩，甲基N-(N-芐氧羰基-β-l-天門冬氨酰)-β-d-氨基葡糖苷等共20種。但這類風(fēng)味物質(zhì)均應(yīng)在低濃度才能發(fā)揮其香氣的正面促進(jìn)作用，是異型乳酸發(fā)酵菌發(fā)酵的微量產(chǎn)物[12-16]。

3 結(jié)論及討論

3.1 結(jié)論

通過GC-MS 分析，3 種發(fā)酵乳中主要有6 類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要包括：醇類、酮醛類、有機(jī)酸類、呋喃，酯類和烴類。而新疆特色發(fā)酵乳制品開菲爾中主要包括15 種酯類，11 種醇類，9 種有機(jī)酸類，6 種烴類，3 種呋喃類，10 種酮醛類；西藏靈菇乳中主要包括2 種酯類，2 種醇類，2 種有機(jī)酸類，5 種烴類，4 種酮醛類；開菲爾粒-西藏靈菇混合發(fā)酵乳中主要風(fēng)味物質(zhì)有酯類7 種，醇類5 種，11 種有機(jī)酸類，6 種烴類，2 種呋喃類，9 種酮醛類。其中新疆特色發(fā)酵乳制品開菲爾中以麥芽糖醇、3-糠醛、油酸乙酯、十四酸，己酸，正癸酸等為優(yōu)勢(shì)風(fēng)味物質(zhì)，西藏靈菇發(fā)酵乳中以環(huán)丁酸,2-二甲基氨基乙基酯，1-氯代-3,5-二甲基-1-己烯-4-醇，庚酸，順-5,8,11,14,17-十二碳五烯酸，4,4-二甲基-2-甲基環(huán)戊烯醇酮-1-酮等為主要風(fēng)味物質(zhì)，開菲爾粒-西藏靈菇混合發(fā)酵乳中主要風(fēng)味物質(zhì)為3-糠醛，苯甲酰亞甲基二乙酸，戊酸，庚酸，辛酸，苯乙醇等。為今后研究新疆地方特色發(fā)酵乳制品開菲爾中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜提供參考依據(jù)。

應(yīng)用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)具有地方特色發(fā)酵乳制品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明此方法快速便捷，可以對(duì)具有地方特色發(fā)酵乳制品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的成分含量進(jìn)行有效的分析。

3.2 討論

由表2 可知不同地區(qū)的發(fā)酵乳制品中的揮發(fā)性風(fēng)味成分也存在著一定的區(qū)別。與賽里木原籍菌種發(fā)酵乳[12]和川西牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶[16]中的揮發(fā)性成分相比，新疆地方特色發(fā)酵乳制品開菲爾中的揮發(fā)性成分種類多，其中醇類含量最高，3-糠醛、油酸乙酯、己酸、正癸酸等為優(yōu)勢(shì)風(fēng)味物質(zhì)。在這里產(chǎn)生區(qū)別的主要原因是與發(fā)酵劑菌種的來源，當(dāng)?shù)匚⑸锶郝涮攸c(diǎn)，品種及當(dāng)?shù)氐陌l(fā)酵工藝有關(guān)。

表2 3種發(fā)酵乳制品主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的比較

3 種發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)成分相較下新疆地方特色發(fā)酵乳制品開菲爾中揮發(fā)性成分種類較多，將開菲爾粒與西藏靈菇混合之后，發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)明顯增加，優(yōu)勢(shì)風(fēng)味物質(zhì)也由1-氯代-3,5-二甲基-1-己烯-4-醇變?yōu)?-糠醛。新疆特色發(fā)酵乳制品開菲爾具有更良好的風(fēng)味，而將開菲爾粒作為發(fā)酵劑添加至乳中或與其它發(fā)酵劑混合發(fā)酵，也能在更大程度上改善和提高發(fā)酵乳制品風(fēng)味。