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    熊蜂SMRTER蛋白多克隆抗體的制備

    2020-04-07 09:15:08徐偉林孫成
    中國蜂業(yè) 2020年2期
    關鍵詞:復性熊蜂抗原

    徐偉林 孫成

    (中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所,北京 100093)

    熊蜂是重要的傳粉昆蟲,在促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及維護生態(tài)系統(tǒng)平衡等發(fā)面發(fā)揮重要作用[1,2]。熊蜂的地理分布范圍非常廣泛,從格林蘭島到亞馬遜平原;它們的棲息地種類多樣,從高山草甸到熱帶雨林[3]。到目前為止,人們不清楚是什么分子機制導致了熊蜂具有如此廣泛的分布能力。對于這一問題的了解有助于更好地利用熊蜂進行授粉服務,也有利于采取恰當?shù)拇胧π芊溥M行保護。串聯(lián)重復序列(tandem repeat)是基因組中高度變異的遺傳元件。我們通過對兩種基因組已經(jīng)測序的熊蜂進行比較發(fā)現(xiàn),串聯(lián)重復序列的變異很可能為熊蜂的環(huán)境適應提供了良好的遺傳變異素材[4]。我們的研究也鑒定出101個編碼區(qū)含有串聯(lián)重復序列的熊蜂基因,基因中串聯(lián)重復序列的變異引起它們所編碼蛋白質(zhì)序列長度的變化。Smr基因就是這些基因之一。

    Smr基因編碼一個異常大的、由3604個氨基酸組成的SMRTER(SMRT-related and ecdysone receptor interacting factor)蛋白,是一種在真核細胞中表達并且在進化上高度保守的轉錄因子[5]。SMRTER[6]不僅對ecdysone通路有抑制作用,而且對卵泡細胞和翅膀的Notch通路也有抑制作用。Smr基因的突變會導致果蠅存在以下缺陷:翅膀和腿變形、產(chǎn)卵形態(tài)缺陷、生殖力下降[5]。

    本研究旨在利用基因合成技術獲得熊蜂Smr基因的編碼區(qū),并把其克隆進大腸桿菌表達載體。在IPTG的誘導下表達SMRTER重組蛋白,并對表達出的可溶性蛋白進行純化。制備兔抗SMRTER多克隆抗體,并檢驗所制備的多克隆抗體的特異性。該研究為進一步研究Smr基因在熊蜂中的生物學功能奠定基礎,也有利于研究該基因中串聯(lián)重復序列所導致的蛋白質(zhì)長度變化是否會影響該蛋白的生物學功能。

    1 材料與方法

    1.1 主要實驗試劑

    Ezfusion同源重組酶購自上海捷瑞生物工程有限公司,DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司,質(zhì)粒提取試劑盒品牌為Axygen,感受態(tài)細胞類型為TOP10,親和層析柱料購自武漢匯研生物科技有限公司,酶標二抗品牌為Jackson,TMB購自北京索萊寶科技有限公司。

    1.2 基因合成

    通過基因合成的方式合成Smr基因的編碼區(qū),由多條引物序列合成,擴增引物序列信息見表1(由武漢金開瑞生物科技有限公司合成)。

    1.3 基因擴增

    PCR擴增反應體系為正反引物各1μl(10pmol),模板1μl(20~50ng),5μl 10* pfu buffer,pfu DNA聚合酶1μl(5U),補去離子水至50μl,PCR擴增反應條件見表2。

    2 載體與目的基因的連接與轉化

    取Pet-b2m載體(該載體為武漢金開瑞生物科技有限公司改造)50ng,目的基因150ng,Ezfusion同源重組酶2μl,T4 DNA Ligase 1μl,補去離子水至20μl,在16℃條件下孵育1h進行連接。

    表1 引物序列信息

    表2 基因擴增PCR反應條件

    將載體與目的基因連接的產(chǎn)物加入到裝有TOP10感受態(tài)細胞的管中(50μl感受態(tài)細胞需要25ng DNA),輕輕旋轉幾次混勻內(nèi)容物,冰浴30min;將離心管混合物放入加溫至42℃的循環(huán)水中,熱激90s;快速將管轉移到冰浴中,使細胞冷卻1~2min;每管加入200μl SOC液體培養(yǎng)基,用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃,然后將管轉移到設置為37℃的搖床上,220rpm培養(yǎng)45min,使細胞復蘇并表達質(zhì)粒編碼的抗性標記基因;將適當體積(每個90mm平板達200μl)已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基上;倒置平板,于37℃培養(yǎng),12~16h后可出現(xiàn)菌斑。

    2.1 菌落PCR驗證

    待平板上長出菌落,隨機挑取若干個,進行菌落PCR驗證,檢測轉化。

    2.2 測序驗證

    陽性克隆由武漢金開瑞生物工程有限公司測序平臺測序驗證。

    3 SMRTER蛋白的誘導表達及純化

    3.1 陽性克隆小量表達與鑒定

    挑選含重組質(zhì)粒的單菌落至3ml LB液體培養(yǎng)基(卡那抗性)中,37℃培養(yǎng)過夜后-20℃保種;分別挑選含重組質(zhì)粒的單菌落至3ml LB液體培養(yǎng)基(卡那抗性)中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600約0.6;取部分菌液作為對照組,余下菌液加入IPTG誘導劑(終濃度1mM),37℃震蕩培養(yǎng)3h;分別取兩組菌液0.15ml,12000×g離心2min,菌體沉淀以40μl 1×loading buffer重懸裂解,SDS-PAGE檢測。

    3.2 蛋白大量表達及破菌檢測

    取保存于-20℃的菌種100μl接種于100ml LB液體培養(yǎng)基(卡那抗性)中震蕩培養(yǎng)過夜;取100ml菌液接種于2000ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃擴大培養(yǎng)至OD600約0.6,降低培養(yǎng)溫度到30℃;加入IPTG誘導劑至終濃度0.5mM,30℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)8h;8000rpm離心3min收集菌體,重懸于50ml預冷NTA-0緩沖液中,冰浴30min;超聲破碎菌體,參數(shù)設置為功率200W、工作3s、暫停4s、時間25~30min;16000rpm 4℃離心50min,收集上清以及沉淀;取少量上清及沉淀進行SDS-PAGE檢測,剩余上清及沉淀置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

    3.3 包涵體蛋白純化

    沉淀以50ml NTA-0緩沖液重懸,加入DTT至終濃度1mM;超聲促進雜蛋白溶解,參數(shù)設置為功率200W、工作3s、暫停3s、時間10min;10000rpm 4℃離心10min,去上清;重復以上三步至上清透明;沉淀以PBS重懸,超聲,參數(shù)設置為功率200W、工作3s、暫停3s、時間5min;16000rpm 4℃離心10min,去上清;以3ml 6M鹽酸胍重懸包涵體,加DTT至終濃度5mM;220rpm 37℃震蕩3h至包涵體全部溶解;10000rpm 4℃離心10min,取上清。取蛋白溶液進行SDS-PAGE檢測。

    3.4 包涵體蛋白復性

    以2倍體積的3M鹽酸胍稀釋蛋白溶液,在4℃環(huán)境下以注射器逐滴加入到200ml復性液(pH 8.0)中,轉速調(diào)節(jié)至最大,攪拌24h;降低轉速,攪拌24h;取蛋白溶液于透析袋中,以PEG20000濃縮體積至50~100ml;4℃ TE緩沖液透析過夜;取蛋白溶液,以PEG20000濃縮體積至2~4ml;4℃ TE緩沖液透析過夜。

    3.5 復性蛋白純化

    上清蛋白溶液用0.22μm過濾器過濾備用;準備Ni-NTA柱;以1ml/min的流速上樣上清蛋白溶液;以NTA-0緩沖液(pH 8.0)洗柱至流出液不含蛋白(G250檢測液不變色);分別以20mM、60mM、200mM和500mM咪唑洗脫,分段收集洗脫液至G250檢測液不變色;以3倍柱體積去離子水洗滌柱料,以20%乙醇封柱;對收集的洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測。

    4 SMRTER多克隆抗體的制備與純化

    將純化的SMRTER蛋白混入弗氏佐劑免疫健康狀態(tài)良好的實驗兔,免疫程序:一免,抗原+完全弗佐+PBS,皮下注射,400ug(抗原)/只,反應時間2周;二免,抗原+完全弗佐+PBS,皮下注射,400ug(抗原)/只,反應時間2周;三免,抗原+完全弗佐+PBS,皮下注射,400ug(抗原)/只,反應時間2周(效價檢測,見ELISA效價檢測操作記錄);四免,抗原+不完全弗佐+PBS,皮下,400ug(抗原)/只,反應時間1周(效價檢測,見ELISA效價檢測操作記錄)。共免疫2只日本大耳白兔子:兔子編號分別為G872、G873;G872、G873兔子免疫原都為SMRTER重組蛋白,免疫次數(shù)共4次。

    純化:層析柱預處理,10倍柱床體積的去離子水沖洗3~5遍,流速1ml/min,10倍柱體積的0.02M PB+0.3M NaCl 沖洗3~5遍,流速1ml/min;樣品上樣,10ml抗血清/腹水,用0.02M PB稀釋后,0.22um濾器過濾后上柱,調(diào)整流速為5~7s/滴;洗雜,0.02M PB沖洗至檢測(G250不變藍)無蛋白流出為止,流速2s/滴;抗體洗脫,0.1M PH=3.0甘氨酸以3~5s/滴過柱洗脫,收集洗脫物并用G250檢測洗脫產(chǎn)物至不變藍為止;PH值調(diào)節(jié),飽和碳酸鈉調(diào)節(jié)洗脫產(chǎn)物PH至中性;超濾濃縮,10kDa超濾管,超濾濃縮至1~3ml左右;透析,5L,0.01M PH=7.4 PBS透析過夜,第二天換液1次后再透析4~6h左右后跑SDS膠并測定抗體濃度后裝入標記好EP管,可暫存于4℃?zhèn)溆没蛑苯颖4嬗?20℃;層析柱洗滌與貯存,去離子水沖洗層析柱,5倍柱床體積20%乙醇沖洗層析柱后,4℃封存。

    5 多克隆抗體特異性檢測

    間接ELISA法,通過對抗體的梯度稀釋,直觀反映了抗體的效價和靈敏度??乖唬河冒灰合♂尶乖?μg/ml,100μl/孔加入96孔酶標反應板中,4℃過夜包被;洗滌:次日棄掉孔內(nèi)的液體,洗滌液洗3次;封閉:加200μl/孔封閉液,37℃溫育2h;洗滌:用洗滌液洗 3 次;加待測樣品(一抗):加入抗血清(取血4℃ 4000rmp 離心10min取上清),用稀釋液將血清按1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000......進行倍比稀釋(空白血清同比稀釋做陰性對照),每孔100μl,37℃孵育1h;洗滌:用洗滌液洗3次;加酶標抗抗體:加入HRP標記IgG二抗,100μl/孔,37℃孵育40min(羊抗小鼠-HRP 1:10000~1:5000,羊抗兔-HRP 1:10000~1:5000)。洗滌:用洗滌液洗5次后拍干;顯色:加新鮮配制的底物溶液100μl/孔,37℃遮光放置5~20min;終止反應、比色:加50μl/孔終止液,顏色變黃;用酶標儀測定450nm處各孔的吸光值。

    6 結果

    6.1 表達載體的構建

    將Smr基因的編碼序列插入表達載體、轉化細菌后,挑選具有抗生素抗性的陽性菌株進行質(zhì)粒提取,并對質(zhì)粒上目的基因插入?yún)^(qū)域進行了測序。測序結果表明:目的基因已經(jīng)正確地插入到表達載體之中。測序結果如下:

    agcaatagcggtggtaatagcggcaccgttggtggtgcacctggtggttatg ttgcagttccgatgcctggtagcctgcgttatattcatccgtatccgagcacaccgac cagcgcaagcgttccggcagttgccaccatggttaccagcgccagcagcgcacc gacaccgattccggttccggcaccggcagcagcaccggttaatccgcctaccgtta gccagacaccgcctccgagcctgagcggcacctatgcaacccgtgatggtggcta tcgtggcaccaccaccaatgttaatgaacgtattgcaattagcgttagcagcagtcc gctgagccagattggtgttggtgtgggtgttgttgcagcagaatatgcagcaaatagc ggtattggtagcggtatggcaggcggtcgtggtgatcgtccgcgtattagcctgctgc ctccggcaagcgttaccccgacaccgtcaccgaccgcaccggattatcagcatgtt agcagtgcacgtaatagccgtattgcactgatgccggttcagccggatcagtattgta atcgtaccgcagttgaaatggcaaatctgcaagaagcaccgccttttaagaaaattc gtctgagccagccgacacagattcagctgcagagccagagccagtcacgttgtca tagcctgagtccggcagatccgtgtgttaaacaagaacatgttgtacagctgcagca accgctgcgtattgatacccgtcagcctgcaaccgaagcatatacaccgcagacc gaagcaattagcccgacactgcctgaaccgaatacacaagaagatgcacagtttc gtagcaccaaagatgatttactgcagcagattagcaaagtggatcgtgaaattgcaa aacgtgaaagccagattaacaaactgcgcaaaaaactgaaagagctggaagaaa ccgcaaataaaccgctggaagcaagcggtctgaaacgtcaggttgaagaacagag tcagcagccgaaacatcagagcctggcacagaaaatctatgcagaaaatcgtcgta aagcagaagaagcacatcgtctgctggaacgtctgggtccgaaagttgaactgccg ctgtataatcagccgagcgataccagcgtttatcaagaaaatcgcaccaaacacca gacctgtatgcgtgcacgtctgattgcccgtctgcgtcgttaa

    圖1 目的基因小量表達后的SDS-PAGE電泳檢測

    6.2 Smr基因的小量表達

    我們使用IPTG進行誘導,對Smr基因進行小量表達實驗,以查看目的基因是否能夠成功表達。結果顯示:與沒有加IPTG誘導劑的全細菌蛋白相比,加誘導劑的全菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測后,在目的大?。?2kDa)處出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶(圖1)。因此,我們所構建的表達載體能夠使Smr基因成功表達。

    6.3 Smr基因的大量表達

    對大腸桿菌進行大量培養(yǎng)并加入IPTG誘導劑誘導表達。超聲破碎菌體并離心后,分別取少量上清及沉淀進行SDS-PAGE檢測。結果顯示,該基因大量表達后,產(chǎn)生的目的蛋白(即SMRTER)主要以包涵體的形式存在(圖2)。

    圖2 目的基因大量表達后的SDS-PAGE電泳圖

    6.4 SMRTER包涵體蛋白的復性與純化

    我們對包涵體蛋白進行了復性,并使用Ni-NTA柱對復性的蛋白進行了純化。取少量純化后的蛋白洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測,結果顯示:通過對包涵體進行復性、純化,我們得到了高質(zhì)量的目的蛋白(圖3)。

    6.5 SMRTER蛋白多克隆抗體的制備及特異性檢測

    通過4次免疫家兔,我們獲得了SMRTER蛋白的多克隆抗體;我們對抗體進行了收集與純化,并使用如下兩種方法對獲得的多克隆抗體進行檢測:

    圖3 目的蛋白復性純化后的SDS-PAGE電泳檢測

    檢測方法1:間接ELISA法。通過對抗體進行梯度稀釋,直觀反映了抗體的效價和靈敏度。當稀釋比例為9.8ng/ml,酶標儀測定450nm處的吸光值檢測為0.1915,結果符合預期(圖4)。

    圖4 SMRTER蛋白的多克隆抗體的效價檢測結果

    檢測方法2:Western blotting(WB)雜交印記法。重組抗原的WB檢測中,在約62kDa處有特異性識別,條帶相對單一,這表明我們得到了特異性的抗體(圖5)。

    7 討論

    本研究利用基因合成技術獲得熊蜂Smr基因的編碼序列,并將其克隆進細菌表達載體;在0.5mmol/l IPTG誘導下表達了SMRTER重組蛋白,并對表達出的蛋白進行了純化;成功制備了兔抗SMRTER多克隆抗體,并且制備的SMRTER多克隆抗體具有很好的效價和特異性。

    圖5 SMRTER蛋白的多克隆抗體的WB雜交檢測結果

    本研究所制備的SMRTER多克隆抗體為研究Smr基因在熊蜂中的生物學功能奠定了基礎。另外,由于該基因中串聯(lián)重復序列的變異導致熊蜂種間該基因所編碼蛋白質(zhì)序列的長度發(fā)生變異,因而本研究所制備的抗體也有利于研究串聯(lián)重復序列所產(chǎn)生的突變對蛋白質(zhì)功能的影響。

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