糖基化終末產物對人牙齦成纖維細胞炎癥因子分泌及P65表達的影響

柴 琳，楊艷玲，劉潤澤，楊曉宇，方卓然，葛非凡，鄧 超

(皖南醫(yī)學院 口腔醫(yī)學院，安徽 蕪湖 241002)

糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)是一類多相化合物，來源于氨基酸中還原糖和游離氨基之間的自發(fā)反應，即經(jīng)典的Maillard反應，AGEs也可以由多種其他反應產生，包括糖、脂類和氨基酸的氧化，以產生與蛋白質共價結合的活性醛[1]。如果組織和循環(huán)系統(tǒng)中積累了過多的AGEs，機體就會出現(xiàn)病理變化，AGEs與氧化應激和炎癥有關，炎癥最終會導致大多數(shù)慢性疾病，包括心血管疾病，糖尿病，慢性腎臟病(CKD)和神經(jīng)退行性疾病等[2]，牙周炎癥是最常見的一種口腔疾病，隨著糖尿病患者體內AGEs的集聚，患者牙周組織周圍炎癥隨之加劇，本實驗探討了AGEs對牙齦成纖維細胞的影響，通過檢測TNF-α、IL-6的表達，明確AGEs可導致牙齦成纖維細胞的炎癥分泌，并通過對NF-кB信號通路p65關鍵分子的檢測，探討NF-кB信號通路在其中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、實驗儀器 PBS(HyCIone；USA)；α-MEM培養(yǎng)基(Gibco；USA)；胎牛血清(四季青；杭州)；雙抗(Gibco；USA)；Ⅰ型膠原酶(Solarbio；USA)；胰蛋白酶(Gibco；USA)；AGE-BSA(BioVision；USA)；TRIzol裂解液(Ambion；USA)；逆轉錄試劑盒(TIANGEN；北京)；RT-PCR試劑盒(TIANGEN；北京)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo；USA)；超凈培養(yǎng)臺(Thermo；USA)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS；Japan)。

1.2 實驗方法

1.2.1 取材 牙齦組織取材于皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科門診因正畸拔除的患者。取材前征得患者及家屬同意。要求患者無全身系統(tǒng)性疾病，牙齦組織健康。患者年齡14～20歲。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 原代培養(yǎng)：酶消化結合組織塊法培養(yǎng)牙齦成纖維細胞：將新鮮取出帶有牙齦組織的牙齒投放在預冷的含有雙抗和PBS比例為1∶100的PBS中，2 h內進行實驗。在超凈工作臺中用含雙抗的PBS溶液反復沖洗干凈后轉移到無菌培養(yǎng)皿中用手術刀輕輕刮取牙頸部的牙齦組織塊。1000 r/min離心5 min。棄上清后，加入含3 mg/mL I型膠原酶1mL，37.5℃每隔5 min振蕩，消化70 min，加入少量胎牛血清終止消化。離心后棄上清，加入2 mL α-MEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將其置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃恒溫)中孵育，每隔一天換液。

傳代培養(yǎng)：待細胞長至瓶底70%～80%時，PBS沖洗1～2遍，加入少量0.25%含EDTA的胰酶置于37℃二氧化碳恒溫箱中消化5 min，終止消化后離心去上清，進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3 實驗分組 牙齦成纖維細胞分為正常組和實驗組于六孔板中培養(yǎng)。正常組用含有5%胎牛血清的2 mL α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，實驗組分別向培養(yǎng)液中加入1、5、10和20 μL/mL的AGEs。

1.4 Real-time PCR檢測炎癥因子IL-6、TNF-α及P65的表達 將正常組和對照組的牙齦成纖維細胞用TRIzol裂解，提取RNA，經(jīng)逆轉錄為cDNA。引物設計有上海生工生物有限公司設計合成(表1)。

表1 引物序列

GeneForward primerReverse primerIL-65'CACTGGTCTTTTGGAGTTTGAG3'5'GGACTTTTGTACTCATCTGCAC3'TNF-α5'AGCTGGTGGTGCCATCAGAGG3'5'TGGTAGGAGACGGCGATGCG3'P655'GGGATGAGATCTTCCTACTGTG3'5'GTGACGATCGTCTGTATCTGG3'β-actin5'GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG3'5'CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG3'

2 結果

2.1 人牙齦成纖維細胞的培養(yǎng) 用酶消化+組織塊法培養(yǎng)的原代細胞與實驗室既往實驗培養(yǎng)的牙齦細胞形態(tài)一致，3 d左右有牙齦細胞貼壁，胞液豐滿(圖1)，待細胞長到90%進行傳代，實驗選用細胞狀態(tài)良好的第三代細胞作為研究對象(圖2)。

2.2 AGEs刺激下人牙齦成纖維細胞IL-6、TNF-α的表達情況 分別用含AGEs終濃度分別為1、5、10、20 μL/mL培養(yǎng)液培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞，Real time PCR檢測IL-6、TNF-α的mRNA表達情況，結果顯示，AGEs各濃度組IL-6的mRNA表達較對照組均增加(P<0.05)，TNF-α的mRNA表達量在5～20 μL/mL濃度組也增加(P<0.05)。見表2、3。

2.3 AGEs刺激下人牙齦成纖維細胞中NF-κB信號通路關鍵分子P65表達情況 分別檢測不同AGEs濃度組中NF-κB信號通路關鍵分子P65表達情況(表4)，Real time PCR結果顯示在5、10、20 μL/mL濃度組，P65表達均上調(P<0.05)；而在1 μL/mL濃度組P65表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 原代培養(yǎng)的牙齦成纖維細胞

圖2 第三代牙齦成纖維細胞

組別AGEs濃度/(μL/mL)IL-6表達情況對照組01.000±0.003 實驗組12.235±0.111*55.400±0.226*105.411±0.161*207.239±0.127*F931.918P0.000

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別AGEs濃度/(μL/mL)TNF-α表達情況對照組01.003±0.051 實驗組11.202±0.120 55.434±0.233*107.660±0.200*207.454±0.190*F1081.368P0.000

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別AGEs濃度/(μL/mL)P65表達情況對照組01.002±0.028 實驗組11.176±0.060 52.464±0.131*103.128±0.157*204.955±0.152*F563.051P0.000

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

近年來有臨床及基礎對照研究表明，糖尿病和牙周炎互相影響[3-4]，在局部刺激因素相似的情況下，有糖尿病者的牙周病發(fā)生率及嚴重程度均大于無糖尿病者；而經(jīng)過完善牙周治療的患者，其血糖水平的控制要優(yōu)于未進行牙周治療組[5]。糖基化終末產物與其細胞受體作用的加強可導致牙齦成纖維細胞的凋亡[6]，糖基化終末產物是單核-巨噬細胞的趨化物質，有研究表明AGEs可激活糖尿病腎病的炎癥途徑[7]。

本實驗中我們分別用不同濃度的AGEs(1、5、10、20 μL/mL)刺激人牙齦成纖維細胞，實驗結果發(fā)現(xiàn)在不同濃度的AGEs刺激下人牙齦成纖維細胞中IL-6的表達水平均上升，在1 μL/mL組TNF-α的表達水平?jīng)]有差異，但隨著濃度的增加，TNF-α的表達水平也上調，實驗結果表明糖基化終末產物刺激了人牙齦成纖維細胞炎癥因子的分泌。本實驗檢測了NF-κB信號通路關鍵分子P65表達情況，NF-кB(nuciear factor-kappaB)是在1986年從B淋巴細胞核的提取物中檢測到的一種核蛋白因子，存在于幾乎所有的細胞液中。大量的研究表明NF-кB信號通路與炎癥密切相關[8-10]，當TNF-α、IL-6、脂多糖等較強的誘導劑存在時，P65起到了轉錄激活的作用，NF-кB激活后，進入細胞核，進而促進相關炎癥因子的轉錄。實驗檢測到在5、10、20 μL/mL濃度的AGEs刺激下，P65的表達水平上調，而在1 μL/mL組P65的表達沒有改變，提示隨著體內AGEs濃度的積累，NF-кB信號通路被激活，從而進一步加劇了炎癥反應。

本研究基于人牙齦成纖維細胞，糖基化終末產物(AGEs)以及牙齦炎的研究背景，探索人牙齦成纖維細胞在AGEs刺激下炎癥因子的分泌情況，并對其中可能的信號通路進行探討，明確了AGEs刺激下人牙齦成纖維細胞釋放大量炎癥因子TNF-α和IL-6，從而激活了NF-кB信號通路，導致牙齦炎癥的易感性增加，從而解釋臨床上糖尿病患者牙齦炎多發(fā)的原因。