患腸炎病海馬的腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)特征分析

閆亞楠 陳美玲 吳銳瓊 吳水清 羅輝玉 陳欣欣 何麗斌 鄭樂云 黃鎮(zhèn)

摘 要：腸炎病是海馬人工養(yǎng)殖過程中常見病害，主要是細(xì)菌感染而引起的，其傳染性強(qiáng)、危害性高。因此，解析患腸炎病海馬腸道中的細(xì)菌菌群組成對于海馬腸炎病的診斷以及防治有著重要意義。采集健康和患腸炎病的膨腹海馬腸道組織，采用細(xì)菌16Sr DNA片段高通量測序和生物信息學(xué)分析手段，探究患腸炎病海馬的腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，健康和腸炎病海馬之間的腸道菌群多樣性和結(jié)構(gòu)均存在顯著差異。從屬水平上來看，患病海馬的腸道優(yōu)勢菌種為弧菌屬Vibrio、漫游球菌屬Vagococcus、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium，健康海馬的腸道優(yōu)勢菌種為玫瑰菌屬Roseibium、擬桿菌目未分類Bacteroidales_unclassified、弧菌屬Vibrio、嗜冷菌屬Psychrobacter，健康海馬和患病海馬中的共有屬包括弧菌屬Vibrio、別弧菌屬Aliivibrio、擬桿菌目未分類Bacteroidetes_unclassified、發(fā)光桿菌屬Photobacterium。與健康海馬腸道菌群相比，患病海馬腸道中的弧菌屬Vibrio、別弧屬菌屬Aliivibrio的含量明顯高于健康海馬。此外，腸炎病海馬腸道中分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium、

β變形菌綱未分類Bacteroidales_unclassified、黃桿菌屬Tenacibaculum和希萬氏菌屬Shewanella為特有的細(xì)菌種屬。研究結(jié)果解析腸炎病海馬腸道可能的致病菌，對于海馬養(yǎng)殖過程中的病害防治有重要的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：海馬;腸炎病;腸道;高通量測序;宏基因組學(xué)

中圖分類號：S947.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：0253-2301（2020）12-0001-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.12.001

Analysis on the Structural Characteristics of Intestinal Bacteria inHippocampus Infected with Gastroenteritis

YAN Yanan1， CHEN Meiling1， WU Ruiqiong1， WU Shuiqing2， LUO Huiyu2，CHEN Xinxin3， HE Libin2， ZHENG Leyun2*， HUANG Zhen1*

（1. Fujian Key Laboratory of Characteristic Marine Bioresources Sustainable Utilization/College of Life Sciences，

Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China; 2. Fujian Fisheries Research Institute， Xiamen， Fujian 361006，

China; 3. Xiamen Xiaodeng Aquatic Products Technology Co.， Ltd.， Xiamen， Fujian 361000， China）

Abstract： Gastroenteritis is a common disease in the artificial breeding process of Hippocampus， which is mainly caused by bacterial infection， and is highly contagious and harmful. Therefore， it is of great significance to analyze the composition of bacterial community in the intestines of Hippocampus infected with gastroenteritis for the diagnosis and prevention of gastroenteritis. The intestinal structure of healthy and diseased Hippocampus abdominalis were collected， and the highthroughput sequencing of bacterial 16Sr DNA fragments and bioinformatics analysis were used to explore the structural characteristics of intestinal bacteria in the hippocampus infected with gastroenteritis. The results showed that there were significant differences in the intestinal bacterial diversity and structure between the healthy and diseased Hippocampus. At the genus level， the dominant intestinal bacteria of diseased Hippocampus were Vibrio， Vagococcus， and Mycobacterium， while the dominant intestinal bacteria of healthy Hippocampus were Roseibium， Bacteroidales_unclassified， Vibrio， and Psychrobacter. The common genera of the healthy and diseased Hippocampus included Vibrio， Aliivibrio， Bacteroidetes_unclassified， and Photobacterium. Compared with the intestinal flora of healthy Hippocampus， the content of Vibrio and Aliivibrio in the intestines of diseased Hippocampus was significantly higher than that of healthy Hippocampus. Besides， there were some unique bacterial genera in the intestines of diseased Hippocampus， such as Mycobacterium， Bacteroidales_unclassified， Tenacibaculum， and Shewanella. The results of the study analyzed the possible pathogenic bacteria in the intestines of Hippocampus infected with gastroenteritis， which would be of important guiding significance for the prevention and control of diseases in the breeding process of Hippocampus.

Key words： Hippocampus; Gastroenteritis; Intestinal; Highthroughput sequencing; Metagenomics

海馬是海馬屬Hippocampus魚類的通稱，屬于脊索動物門硬骨魚綱、刺魚目、海龍科[1]，廣泛分布于暖溫帶、亞熱帶和熱帶沿岸淺水海域[2]。海馬因其經(jīng)濟(jì)和藥用價值成為世界上交易量最高的海洋生物之一[3]。近幾年來，隨著海洋污染加劇、人類對近岸海域過度開發(fā)，以及人類對海馬的過度捕撈，我國沿海的海馬自然資源日益減少，隨著人工養(yǎng)殖海馬技術(shù)的突破，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，人工養(yǎng)殖海馬將成為藥用海馬來源的主要方式。在海馬養(yǎng)殖過程中，由細(xì)菌引起的腸炎病是常見的疾病，該病多發(fā)于海馬的幼年期，其具體表現(xiàn)癥狀為海馬肛門松弛、紅腫并附有白色物。剖開海馬腹部會發(fā)現(xiàn)有大量積液、腸內(nèi)無食物、腸道發(fā)炎充血呈紅色、后腸腫脹明顯、并可能伴有白色結(jié)節(jié)。病海馬行動癡呆、遲緩漂浮于水面。食欲減退魚體消瘦衰弱致死[4]。

迄今為止，對海馬細(xì)菌病的研究大部分采用病原菌分離的研究方法，例如Lin等[5]對患有腸炎的直立海馬進(jìn)行分離病原菌，得到了1株病原菌DS3，經(jīng)鑒定DS3為副溶血性弧菌。Wang等[6]對患病線紋海馬的腸道中進(jìn)行分離病原菌，檢測到1種新型的病原菌強(qiáng)壯弧菌。李營[7]從患表皮潰瘍綜合征線紋海馬的潰爛肌肉及腸道組織中分離病原菌，檢測到副溶血弧菌和哈維氏弧菌。Li等[8]從患病日本海馬的腸道、肝臟和潰爛皮膚中分離出HC2菌株，經(jīng)鑒定HC2為假單胞菌。Jiang等[9]從患爛尾病的庫達(dá)海馬中分離出3種可培養(yǎng)的腸道細(xì)菌菌株，經(jīng)鑒定為假交替單胞菌屬、枯草芽孢桿菌和發(fā)光桿菌。Balcázar等[10]從患病長吻海馬和歐洲海馬的有白斑的皮膚和壞死的尾巴中進(jìn)行病原菌分離，發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌和燦爛弧菌在患病海馬中占主導(dǎo)地位。Balcázar等[11]從患爛尾病長吻海馬的潰爛皮膚中分離出了

BFLP6T菌株，經(jīng)鑒定BFLP6T菌株是1種新型的分枝桿菌——海馬分枝桿菌M.hippocampi sp.Nov。這些研究關(guān)注的主要是患病海馬的病原菌，但是沒有解析患病海馬自身的腸道微生物狀態(tài)。動物腸道中的腸道菌群在宿主中起著“被遺忘”的器官的作用，并為宿主履行其無法自我完成的關(guān)鍵功能[12-13]。許多研究表明，腸道菌群是其宿主代謝、免疫力、能量利用和健康維持的重要組成部分

[14-15]。同樣的，海馬的腸道菌群在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、抵抗疾病和抑制潛在病原體方面起著重要作用。當(dāng)海馬處于健康狀態(tài)時，腸道菌群間處于相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡中，而這種平衡一旦被打破，致病菌異常增殖，正常菌群的生長受到抑制，宿主就會因腸道菌群的紊亂發(fā)生疾病。因此，對養(yǎng)殖過程中腸炎病海馬的腸道菌群進(jìn)行深入研究有助于全面了解海馬腸炎病的發(fā)病機(jī)理。

本研究中通過高通量測序技術(shù)，對人工養(yǎng)殖的健康和患腸炎病海馬的腸道菌群進(jìn)行比較分析，解析出健康和患腸炎病海馬腸道中各自特異性的微生物群落結(jié)構(gòu)，為患腸炎病海馬的治療與預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

健康海馬和患腸道疾病的海馬采集自福建省水產(chǎn)研究所。海馬為膨腹海馬Hippocampus abdominalis，體長10 cm。

1.2 樣品總DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測序

將海馬置于解剖鏡下，用酒精對其體表進(jìn)行消毒，在無菌環(huán)境中解剖將腸道取出，同時用無菌海水沖洗3次后放在滅菌的離心管中。5條海馬的腸道混合成1個樣本。在冰上用組織勻漿機(jī)將海馬腸道樣品勻漿后，根據(jù)說明書用Soil DNA Kit試劑盒（Omega BioTek，USA）提取細(xì)菌總DNA。通過在2%的瓊脂糖凝膠中電泳分析總DNA質(zhì)量和完整性，并使用NanoDrop（ND2000，Thermo Scientific）對DNA濃度進(jìn)行定量分析。用細(xì)菌特異性引物：341F（5′CCTAYGGGRBGCASCAG3′）和806R （5′GGACTACNNGGGTATCTAAT3′） 對16SrDNA基因可變區(qū)（V3～V4區(qū)）進(jìn)PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行基于Illumina HiSeq測序平臺的高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 測序數(shù)據(jù)處理 根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，將Barcode序列和引物序列去除后，利用FLASH v 1.2.7軟件對每個樣品的reads進(jìn)行拼接、過濾以得到高質(zhì)量的tags數(shù)據(jù)， 隨后使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME 1.9.1）軟件與參考數(shù)據(jù)庫（Gold database）比對（UCHIME Algorithm）檢驗(yàn)并去除嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)（effective tags）。

1.3.2 OTU聚類和物種注釋 利用Uparse軟件v 7.0.1001對所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)（effective tags）進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的相似性（identity）將序列聚類成為操作分類單元（OTUs）、依據(jù)其算法原則，篩選 OTUs 中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為 OTUs 的代表序列。用Mothur軟件與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對OTUs 的代表序列進(jìn)行物種注釋分析，每個OTU在結(jié)果分析中視作一種細(xì)菌。使用MUSCLE v.3.8.31軟件進(jìn)行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。為了去除樣品序列差異引起的誤差，對所有樣品進(jìn)行均一化處理（以數(shù)據(jù)量最少的樣品為標(biāo)準(zhǔn)，cutoff=69713），以處理后的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)多樣性分析。

1.3.3 樣品復(fù)雜度分析 使用QIIME 1.9.1軟件包計算了群落豐富度指數(shù)（Chao and Ace）、群落多樣性指數(shù)（Shannon and Simpson）、Observedspecies和Goodscoverage，使用R軟件v 3.5.2繪制稀釋曲線并進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。使用STAMP v.2.1.3進(jìn)行Metastats分析：通過對組間樣本進(jìn)行比較，在各分類水平上找出兩組中具有顯著差異的物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康與患病海馬腸道的細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

對于健康與患病海馬腸道提取總細(xì)菌DNA后，使用細(xì)菌特異性引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。從圖1可見，6個樣品的PCR產(chǎn)物條帶大小正確，并且總量符合測序建庫要求。進(jìn)一步使用illumina Hiseq進(jìn)行上機(jī)測序，6個樣品得到的數(shù)據(jù)統(tǒng)計如表1所示。

對6個樣品的測序數(shù)據(jù)經(jīng)過OTU比對后，繪制了不同樣品的稀釋曲線，從圖2可以看出，6個樣品的稀釋曲線均隨序列數(shù)量的增加而趨于平緩，表明所測的數(shù)據(jù)量已經(jīng)可以反映微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性（圖2A）。進(jìn)一步將6個樣品按照健康與患病海馬分為2組，每組的3個生物學(xué)重復(fù)樣品，合并進(jìn)行分析。以97%的相似性對序列進(jìn)行聚類，相似度大于97%的序列將聚為同一個OTU，健康和患病樣品中有效OTUs數(shù)目分別為547、434個，但是健康海馬腸道微生物的ACE、Chao1指數(shù)低于患病海馬，表明健康海馬的腸道微生物物種數(shù)目低于患病海馬組。健康海馬腸道微生物的Shannon多樣性指數(shù)高于患病海馬組，并且Simpson多樣性指數(shù)低于患病海馬組，表明在微生物多樣性方面，健康海馬的腸道中微生物的菌群多樣性高于患病海馬（表2）。最后，分別對2種樣品繪制等級分布曲線，結(jié)果如圖2B所示，在水平方向上，患病海馬組的曲線在橫軸上的跨度大于健康海馬組，也表明患病海馬組的微生物物種數(shù)目高于健康海馬，同時在垂直方向上患病海馬的曲線比健康海馬陡峭，表明患病海馬樣品中存在相對豐度明顯占優(yōu)的細(xì)菌種類。

2.2 健康與患病海馬腸道的細(xì)菌群落組成及相對豐度

首先從細(xì)菌分類的門水平上通過對健康與患病海馬腸道的細(xì)菌群落組成進(jìn)行比較。本研究確定了4個主要門：變形菌門Proteobacteria（health75.26%、disease 65.6%）、厚壁菌門Firmicutes（health 11.33%、disease 15.98%）、擬桿菌門Bacteroidetes（health 11.05%、disease 9.99%）、放線菌門Actinobacteria（health 11.37%，disease 7.34%）。

其次，在細(xì)菌分類的屬水平上，共鑒定出19個主要屬。其中患病海馬的腸道優(yōu)勢菌種為弧菌屬Vibrio、漫游球菌屬Vagococcus、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium、β變形菌綱未分類Betaproteobacteria_unclassified、黃桿菌屬Tenacibaculum、希萬氏菌屬Shewanella。健康海馬中的優(yōu)勢菌種為玫瑰菌屬Roseibium、擬桿菌目未分類Bacteroidales_unclassified、弧菌屬Vibrio、嗜冷菌屬Psychrobacter、梭菌目未分類Clostridiales_unclassified，紅細(xì)菌科未分類Rhodobacteraceae_unclassified。其中弧菌屬Vibrio、弧菌科未分類Vibrionaceae_unclassified、別弧菌屬Aliivibrio、擬桿菌目未分類Bacteroidetes_unclassified、發(fā)光桿菌屬Photobacterium為健康海馬和患病海馬中的共有屬。具體的各個屬百分?jǐn)?shù)如圖3所示。

2.3 健康與患病海馬腸道的細(xì)菌群落組成差異性分析

為了解析健康與患病海馬腸道的細(xì)菌群落組成的差異性，將所有的6個樣品根據(jù)OTU的類型進(jìn)行了主成分分析，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，所有的6個樣品可以明顯分成2群，一群為健康海馬腸道樣品，另一群為患病海馬腸道樣品，表明2群樣品之間有明顯的差異性。其中健康海馬腸道樣品聚類較為集中，而患病海馬腸道樣品聚類較為分散。

為了進(jìn)一步解析健康與患病海馬在屬水平上的細(xì)菌群落組成的差異性，將兩組樣本利用STAMP進(jìn)行顯著性差異分析。由圖5可以看出，健康海馬與患病海馬存在明顯差異，在患病海馬中，弧菌屬Vibrio、漫游球菌屬Vagococcus、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium、黃桿菌屬Tenacibaculum、希萬氏菌屬Shewanella、β變形菌綱-未分類Betaproteobacteria_unclassified顯著表達(dá)。而在健康海馬中玫瑰菌屬Roseibium、嗜冷菌屬Psychrobacter、梭菌目-未分類Clostridiales_unclassified、弓形桿菌屬Arcobacter顯著表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

由于第二代高通量測序技術(shù)的數(shù)據(jù)流量、測序深度和準(zhǔn)確性都很高，所以目前該技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)的研究應(yīng)用廣泛，其中在魚類腸道菌群的研究應(yīng)用尤為廣泛[16]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物多樣性的變化和腸道菌群失衡對寄主魚類有不同的影響[17-18]。本研究通過基于16Sr DNA的高通量測序技術(shù)分析了健康和患腸炎病海馬腸道菌群結(jié)構(gòu)差異，這將有助于對于腸炎病海馬的治療以及為海馬的健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

在本研究中，海馬腸道菌群中的優(yōu)勢菌群是變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes。另外，在屬水平上，本研究在患病和健康海馬的腸道中均鑒定出嚴(yán)重的一些潛在病原體：弧菌屬、別弧菌屬、發(fā)光桿菌屬，其中弧菌屬在患病的海馬腸道中的含量明顯高于健康海馬?；【鷮偌?xì)菌是海洋環(huán)境中分布最廣泛細(xì)菌類群之一，大部分弧菌屬是海洋環(huán)境及某些海洋動物中正常菌群的組成部分，但也有部分弧菌會對水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大危害[19]。比如Lin等[5]、Sao等[20]和Qin等[21]分別對副溶血弧菌、塔氏弧菌和哈維氏弧菌在海馬腸道中的作用進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明弧菌屬的豐度提高可能會導(dǎo)致海馬消化不良和食欲不振，使其變得瘦弱，容易受到機(jī)會病原體的侵害。此外，在患病海馬中還發(fā)現(xiàn)了機(jī)會致病菌：分枝桿菌屬、黃桿菌屬。分枝桿菌在淡水魚類和海水魚類均存在，魚類感染分枝桿菌后會在內(nèi)臟中形成許多灰白色或淡黃色小結(jié)節(jié)，分枝桿菌病可以分為慢性感染和急性感染，慢性感染會引起魚類零星死亡但急性感染有可能引起魚類大量死亡[22]。黃桿菌對淡水魚類、海洋魚類、兩棲動物、其他水生動物以及海洋微藻都有致病作用，死亡率可高達(dá)100%[17]。因此，弧菌屬、分枝桿菌屬、黃桿菌屬的存在可能會誘發(fā)海馬發(fā)病。進(jìn)一步通過matastats分析，得出健康海馬中存在著幾個差異顯著的菌屬：嗜冷菌屬Psychrobacter、梭菌目-未分類Clostridiales_unclassified、弓形桿菌屬Arcobacter。其中已有報道證明，梭菌和嗜冷菌是健康細(xì)鱗魚和黑斑狗魚中的優(yōu)勢菌群[18]。梭菌也是養(yǎng)殖條件下健康大黃魚腸道中的優(yōu)勢菌群[23]。弓形桿菌存在于海水、沿海沉積物以及海洋無脊椎動物中[24]，Romero等[25]發(fā)現(xiàn)人工養(yǎng)殖的健康智利牡蠣中廣泛存在弓形桿菌，此外，在人工養(yǎng)殖的健康歐洲龍蝦、鮑魚中也發(fā)現(xiàn)了弓形桿菌[26-27]。上述研究結(jié)果與已有報道的結(jié)果一致，比如Ma等[16]研究發(fā)現(xiàn)，患病云龍石斑魚和健康云龍石斑魚之間腸道菌群的豐富度和多樣性沒有顯著差異，但患病魚中主要的菌群（如變形桿菌）的含量上調(diào)。Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，健康和患病養(yǎng)殖大西洋鮭的腸道菌群有所不同，在健康的魚類腸道中觀察到的細(xì)菌多樣性明顯高于發(fā)病魚類，在患病魚類腸道中，一些機(jī)會性病原體明顯豐富，而健康魚類腸道中含有更多的益生菌。

總之，為了解析腸炎病海馬腸道中的細(xì)菌菌群組成，通過高通量測序比較健康和患病海馬之間的腸道細(xì)菌組成。結(jié)果表明，當(dāng)海馬患病時，主要細(xì)菌的豐度發(fā)生了顯著變化，在患病海馬中，擬桿菌和紅細(xì)菌明顯減少，而弧菌則被上調(diào)。在屬水平上，在患病的海馬中一些病原細(xì)菌，如弧菌、別弧菌屬明顯增加;并且僅在患病海馬中檢出了黃桿菌、分枝桿菌和希萬氏菌，這些菌群可能是引起海馬患病的重要潛在病原體。本研究結(jié)果表明，微生物群結(jié)構(gòu)的改變可能與腸道炎癥的發(fā)作同時發(fā)生，這為了解腸道微生物群與疾病的發(fā)生之間的聯(lián)系提供了幫助。同時本研究的結(jié)果對海馬的養(yǎng)殖以及對海馬腸道微生物群生態(tài)學(xué)的理解具有重要意義。

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