患根結(jié)線蟲病番茄根內(nèi)生固氮菌的篩選、鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

金玲月 路晶晶 馮燕輝 張沁怡 吳寒 李容丹 黃薇 藍(lán)燦華 田寶玉

摘 要：植物內(nèi)生固氮菌能通過自身的固氮作用，把空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為植物可利用的氨態(tài)氮，促進(jìn)植物生長以及提高作物產(chǎn)量。以患根結(jié)線蟲病的番茄根組織為材料，采用梯度稀釋和劃線法分離純化番茄根內(nèi)生菌，通過無氮固體培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)篩選固氮菌，并擴(kuò)增固氮細(xì)菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步了解患根結(jié)線蟲病的番茄根內(nèi)菌的種類和分布。結(jié)果表明，在挑選和分離純化得到的33株番茄根內(nèi)生菌中，經(jīng)過在無氮培養(yǎng)基平板上連續(xù)的傳代培養(yǎng)，最終得到3株具有穩(wěn)定固氮能力的內(nèi)生菌株。分子鑒定和序列分析表明篩選出的內(nèi)生固氮菌菌株中包括8株芽孢桿菌、1株黃單胞菌和1株根瘤菌。與先前發(fā)表的番茄根內(nèi)生菌優(yōu)勢OTU的聚類分析結(jié)果表明，根瘤菌是患根結(jié)線蟲病番茄根中優(yōu)勢的內(nèi)生固氮菌種群。

關(guān)鍵詞：根結(jié)線蟲;番茄根;內(nèi)生固氮菌;篩選;分子鑒定

中圖分類號：S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：0253-2301（2020）12-0046-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.12.009

Screening， Identification and Phylogenetic Analysis of Endophytic Nitrogenfixing Bacteriain Tomato Roots Infected with Rootknot Nematode

JIN Lingyue1， LU Jingjing1， FENG Yanhui1， ZHANG Qinyi1， WU Han1，LI Rongdan1， HUANG Wei1，2， LAN Canhua1， TIAN Baoyu1*

（1. College of Life Sciences， Fujian Normal University/Key Laboratory of Fujian University of Cellular Stress

Response and Metabolic Regulation， Fuzhou， Fujian 350108， China; 2. Institute of Agricultural Quality Standards

and Testing Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： The endophytic nitrogenfixing bacteria could transform the nitrogen in the air into ammonia nitrogen available for the plants through their own nitrogen fixation， thus to promote the plant growth and increase the crop yield. By using the tomato root tissue infected with the rootknot nematode as the material， the endophytic bacteria in tomato roots were isolated and purified by the methods of gradient dilution and streaking. The nitrogen fixing bacteria were screened by the continuous culture in the nitrogenfree solid medium. Then， the 16S rRNA gene sequence of nitrogenfixing bacteria was amplified for the identification and phylogenetic analysis， thus to explore the species and distribution of endophytic nitrogenfixing bacteria in tomato roots infected with the rootknot nematode. The results showed that the three endophytic strains with stable nitrogen fixation ability were obtained after continuously subculturing the selected and purified 33 strains of endophytic bacteria in tomato roots in the nitrogenfree culture-medium. The molecular identification and sequence analysis showed that there were 8 strains of Bacillus， 1 strain of Xanthomonas and 1 strain of Rhizobium in the selected strains of endophytic nitrogenfixing bacteria. The cluster analysis of the dominant OTU of endophytic bacteria in tomato roots previously published indicated that Rhizobium was the dominant population of endophytic nitrogenfixing bacteria in tomato roots infected with the rootknot nematode.

Key words： Rootknot nematode; Tomato roots; Endophytic nitrogenfixing bacteria; Screening; Molecular identification

植物內(nèi)生菌是指在植物生活史的某一階段，能在植物組織內(nèi)檢測到但不會引起明顯植物組織病變的一類微生物[1-2]。常見的植物內(nèi)生菌包來源有兩種，一種是植物體內(nèi)固有的，隨著植物有性或無性繁殖方式進(jìn)行傳播。另一種是從植物體表或外界環(huán)境經(jīng)吸附、侵染最終成功定殖于宿主植物體的內(nèi)生菌[3]。植物內(nèi)生菌與宿主在長期共同進(jìn)化過程中，形成了互利和相互依存的關(guān)系，在植物的生長、發(fā)育、健康、產(chǎn)量、養(yǎng)分吸收以及抗病性等方面發(fā)揮著重要的作用[2，4]。植物內(nèi)生菌可用作為生物防治中潛在的微生物殺蟲劑，以及促進(jìn)植物生長的微生物肥料等。

植物內(nèi)生固氮菌是指定殖在植物內(nèi)部與植物宿主聯(lián)合固氮的固氮菌，是植物內(nèi)生菌中最受關(guān)注的類群之一[5-8]。植物內(nèi)生固氮菌占據(jù)著適合植物組織營養(yǎng)供應(yīng)和微環(huán)境的生態(tài)位，可有效拮抗病原微生物的生長，并且相較于根外環(huán)境，更有利于形成高效的固氮系統(tǒng)，能夠促進(jìn)作物生長以及提高產(chǎn)量[8，9-11]。氮素是植物需求量最大的營養(yǎng)元素，是合成蛋白質(zhì)的主要來源，對植物生長發(fā)育至關(guān)重要[12]。固氮菌能通過自身的固氮作用，把空氣未能被植物吸收的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨態(tài)氮，成為植物可以直接利用的氮肥。除固氮之外，固氮菌還能能夠促進(jìn)農(nóng)作物生長發(fā)育，增強(qiáng)其他根際微生物的生命活動，促進(jìn)土壤有機(jī)物質(zhì)的礦化作用，改良土壤結(jié)構(gòu)，改善作物質(zhì)量[13-14]。近年來，已有研究發(fā)現(xiàn)水稻[15]、小麥[16]、甘蔗[17]、大豆[18]、馬鈴薯[19]、玉米[20-21]等作物的內(nèi)生固氮菌在促生、抗病害等方面具一定作用。

先前研究發(fā)現(xiàn)根結(jié)線蟲侵染的植物根結(jié)內(nèi)固氮細(xì)菌高度富集[22]。本課題以被線蟲侵染的番茄根組織材料為研究對象，分離純化獲得根內(nèi)生菌，并從中篩選出具有固氮菌能力的內(nèi)生固氮菌，初步確認(rèn)患根結(jié)線蟲病的番茄根內(nèi)生固氮菌的優(yōu)勢菌株，為挖掘植物內(nèi)生固氮菌菌株資源，深入研究分析內(nèi)生固氮菌與作物共生關(guān)系以及根結(jié)線蟲的相互作用關(guān)系提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

根結(jié)線蟲侵染的番茄植株采集于福建省福州市福建師范大學(xué)校園實(shí)驗(yàn)田。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 固體培養(yǎng)基 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：胰蛋白胨15.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，pH 7.3±0.2，以蒸餾水定容至1 L，121℃高壓滅菌30 min備用。

無氮固體培養(yǎng)基：甘露醇（或葡萄糖）10 g，磷酸二氫鉀0.2 g，七水合硫酸鎂0.2 g，氯化鈉0.2 g，二水合硫酸鈣0.2 g，碳酸鈣5 g，瓊脂粉20 g，pH 7.0±0.2，以蒸餾水定容至1 L，121℃高壓滅菌30 min備用。

1.2.2 液體培養(yǎng)基 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，氯化鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.5 g，葡萄糖2.5 g，pH 7.3±0.2，以蒸餾水定容至1 L，121℃高壓滅菌30 min備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 番茄根根組織樣品處理 收集根結(jié)線蟲侵染的番茄植株根，自來水沖洗后，用無菌水沖洗3次。根表面消毒采用5%次氯酸鈉消毒1 min，無菌水沖洗3次，再用75%酒精消毒1 min，無菌水沖洗3次。將已消毒的根部組織研磨成勻漿并連續(xù)稀釋至10-5，分別吸取100 μL涂布于TSA固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察平板菌落數(shù)以保證菌落大小合適挑選。

1.3.2 番茄根內(nèi)生菌的分離純化 根據(jù)稀釋平板上菌落的形態(tài)、大小和顏色，挑取不同的單菌落并在TSA固體培養(yǎng)基平板上劃線，確保每個菌株得到單一純化的菌落，挑取單菌落進(jìn)行二次劃線分離。將分離的菌株分別接種于2 mL的TSB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)18～24 h，菌液按終濃度20%的比例加入甘油進(jìn)行保種，于-80℃冰箱保存。

1.3.3 番茄根內(nèi)生固氮菌的篩選 挑取少許上述培養(yǎng)好的番茄根內(nèi)生菌菌液，按每個菌株3個平行分別接種于無氮固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24～48 h，定期觀察菌落的生長狀況。在無氮固體培養(yǎng)基平板上上生長的菌株（即子一代）再次接種于無氮固體培養(yǎng)基上，生長的菌株記為子二代，以此類推，繼續(xù)培養(yǎng)到子五代。傳代培養(yǎng)到子二代仍能在無氮固體培養(yǎng)基上生長且生長狀態(tài)良好的菌株可以初步判定具有固氮能力的內(nèi)生菌，傳代五代仍能生長且生長狀況良好的菌株可判定其具有較穩(wěn)定的固氮能力。

1.3.4 番茄根內(nèi)生菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增、鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取番茄根內(nèi)生菌的基因組DNA，并以提取的基因組DNA為模板，以細(xì)菌通用引物27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′和1492R：5′TACGGCTACCTTGTTACGACTT3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，62℃退火45 s，72℃延伸90s，循環(huán)30次;72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用QiagenQiaquick柱試劑盒純化回收，并送至上海生工進(jìn)行雙向測序，獲得的序列用SeqMan查看并進(jìn)行序列拼接，在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析確定其分類地位。

從已發(fā)表番茄根微生物組菌群分析結(jié)果中抽提豐度最高的前50個OTUs序列，并與3株確定的固氮酶菌株的16S rRNA基因序列合并，使用SeaView 5的ClustalX程序按默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比對和對齊[22-23]，在Mega中采用鄰位相連算法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[24]。

2 結(jié)果和分析

2.1 番茄根內(nèi)生菌的分離純化

根據(jù)菌落形態(tài)、大小和顏色差異從TSA固體培養(yǎng)基中分別挑選單菌落進(jìn)行劃線純化，為了保證得到純化的單克隆菌落，再次挑選單菌落進(jìn)行二次劃線，最終得到33株純化的番茄根內(nèi)生菌菌株并保種。

2.2 番茄根內(nèi)生固氮菌的篩選

將分離純化的33株番茄根內(nèi)生菌菌株分別接種于無氮固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生長的菌株（即子一代）再次接種于無氮固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行二次傳代培養(yǎng)。經(jīng)過兩次傳代培養(yǎng)后，有10株番茄根內(nèi)生菌可以在無氮培養(yǎng)基上生長（如表1所示）。將初步判定具有固氮能力的10株番茄內(nèi)生菌繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，最終得到3株具有穩(wěn)定固氮能力的番茄根內(nèi)生菌固氮菌J26、J55和J58（表1）。

2.3 番茄根內(nèi)生固氮菌的分子鑒定

分別提取番茄根內(nèi)生固氮菌株的基因組DNA并擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因，PCR產(chǎn)物純化后送公司測序，測序結(jié)果拼接后遞交EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分子鑒定。從鑒定結(jié)果（表2）可知，在10株初步認(rèn)定具有固氮能力的內(nèi)生菌株中，其中有8株細(xì)菌菌株，包括J15、J18、J20、J26、J33、J34、J56和J58屬于芽孢桿菌類;另外菌株J51屬于黃單胞菌屬，J55屬于根瘤菌屬。經(jīng)過進(jìn)一步的篩選，最終確定Lysinibacillus capsici J26、Rhizobium larrymoorei J55、L. fusiformis J58等3株菌株傳代培養(yǎng)到子五代仍能在無氮培養(yǎng)基平板上正常生長，最終確定這3株菌株為番茄根內(nèi)生固氮菌菌株。

2.4 番茄根內(nèi)生固氮菌菌株的比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

從先前已經(jīng)發(fā)表的健康和患根結(jié)線蟲病番茄根內(nèi)生菌菌群分析結(jié)果中抽提豐度最高的前50個OTUs的序列，并將其與確定為番茄內(nèi)生固氮菌的3株菌L.capsici J26、R.larrymoorei

J55、L.fusiformis J58的16S rRNA基因序列合并，使用SeaView的ClustalX程序?qū)⑺行蛄羞M(jìn)行編輯比對對齊，在Mega進(jìn)行NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。聚類分析結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，菌株

J55與患根結(jié)線蟲病番茄根微生物中的OTU_32 Rhizobium聚在一起，并且與OTU_34 Rhizobium和OTU_18 Rhizobium聚在同一個分枝，這些OTUs在分類上均屬于根瘤菌細(xì)菌，并且在番茄根微生物組中有較高的豐度。結(jié)果表明根瘤菌是患根結(jié)線蟲病番茄根微生物中的優(yōu)勢內(nèi)生固氮菌菌群。在番茄根內(nèi)生微生物中豐度最高的前50個OTUs中與L.capsici J26和L.fusiformis J58 聚在一起的為OTU_47 unclassified，但在聚類關(guān)系上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，序列同源性較低（<97%）。

3 討論

根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）是宿主分布最為廣泛、對植物危害最嚴(yán)重的植物寄生線蟲之一[25]。近些年研究表明，植物內(nèi)生菌在防治植物病害方面有著非常重要的作用[26]。與根際、葉際其他的益生微生物相比，內(nèi)生固氮菌的固氮作用可使宿主植物更為受益，同時也在分泌生長素促進(jìn)植物生長、溶磷和增強(qiáng)植株抗病性、抗逆性等方面的發(fā)揮重要作用，在農(nóng)業(yè)實(shí)踐中作為微生物菌肥應(yīng)用廣泛[27]。番茄根結(jié)線蟲病一般發(fā)生在番茄的須根和側(cè)根上并生成根結(jié)，其與主要與豆科植物共生且產(chǎn)生于主根的根瘤明顯不同[26，28]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)根結(jié)線蟲侵染的番茄根結(jié)內(nèi)固氮細(xì)菌高度富集[22]。目前尚無患根結(jié)線蟲病的植物根組織中固氮菌種類和分布的研究。因此本試驗(yàn)對根結(jié)線蟲侵染的番茄根內(nèi)生固氮菌研究，可以進(jìn)一步為探索內(nèi)生固氮菌與根結(jié)線蟲侵染相互作用奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過兩輪的傳代培養(yǎng)從分離純化的33株番茄根內(nèi)生菌中初步篩選得到10株可以在無氮培養(yǎng)基上生長的內(nèi)生菌。經(jīng)過進(jìn)一步的連續(xù)傳代培養(yǎng)，最后確定了3株具有穩(wěn)定固氮能力的內(nèi)生固氮菌菌株。一些最初被認(rèn)定為具有固氮能力的細(xì)菌菌株在后續(xù)的篩選中無法進(jìn)一步在無氮培養(yǎng)基上生長的主要原因可能是這些細(xì)菌本身并不具有固氮能力，而是利用了起始液體培養(yǎng)基中殘留的氮源物質(zhì)。隨著傳代次數(shù)的增加，殘留的氮源被消耗。所以在固氮菌的篩選中連續(xù)傳代培養(yǎng)是排除假陽性結(jié)果必不可少的環(huán)節(jié)。最終確定的3株內(nèi)生固氮菌，其中2株芽孢桿菌類菌株J26、J58，1株根瘤菌類菌株J55在傳代培養(yǎng)中表現(xiàn)出穩(wěn)定的固氮能力，菌株J55與患根結(jié)線蟲病番茄根微生物中的高豐度OTU_32 Rhizobium聚在一起，進(jìn)而表明根瘤菌是患根結(jié)線蟲病番茄根微生物中的優(yōu)勢內(nèi)生固氮菌菌群。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）