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    微生物糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成槲皮素糖苷及其抗炎活性評(píng)價(jià)

    2020-04-06 07:59:30王程竇文芳何麗麗
    生物技術(shù)進(jìn)展 2020年2期
    關(guān)鍵詞:糖苷基轉(zhuǎn)移酶糖基化

    王程, 竇文芳, 何麗麗

    江南大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 無錫 214122

    槲皮素(3,3′,4′,5,7五羥基黃酮)是一種以C6-C3-C6為基本碳架的黃酮類化合物,廣泛分布在植物中的花、葉、果實(shí)中,多以糖苷的形式存在[1]。目前國內(nèi)外有許多關(guān)于槲皮素藥理活性的研究,發(fā)現(xiàn)其具有豐富的藥理活性,包括抗氧化及清除氧自由基[2]、抗炎[3]、抗癌[4]、降低血糖和保肝[5-7]等作用。但槲皮素的水溶性很差,幾乎不溶于水,在小腸吸收表面不易被主動(dòng)吸收,生物利用度低[8];Stahlhut等[9]發(fā)現(xiàn)體外槲皮素不穩(wěn)定,易降解,在培養(yǎng)基中所加入的槲皮素24 h內(nèi)完全降解。為解決這一問題,目前主要利用糖基化、甲基化和羥基化反應(yīng)來提高槲皮素分子的穩(wěn)定性和水溶性,進(jìn)而提高其生物利用度[10]。其中糖基化反應(yīng)是應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)反應(yīng)。目前,槲皮素的糖苷化合物主要通過三種方式獲得:從天然植物中提取、化學(xué)合成和酶法合成[11-12]。其中酶法合成因其具有催化效率高、專一性強(qiáng)、 副產(chǎn)物少且對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)逐漸受到關(guān)注,而酶法合成主要利用糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行催化。

    糖基轉(zhuǎn)移酶是一類能夠催化單糖、雙糖和糖復(fù)合物中糖鏈合成的一類酶。該類酶主要負(fù)責(zé)將活性供體(通常為NDP-糖)的單糖轉(zhuǎn)移到糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及各種雜環(huán)化合物上,從而形成特異的糖苷鍵[13]。由于多數(shù)糖苷類化合物存在于植物中,植物來源的糖基轉(zhuǎn)移酶研究較多。隨著對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的研究不斷深入,近年來也發(fā)現(xiàn)很多來源于微生物的糖基轉(zhuǎn)移酶能夠催化合成多種糖苷類化合物。Liang等[14]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌中的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT109A1可以催化人參皂苷的C3-OH、C12-OH和C20-OH糖基化產(chǎn)生非天然人參皂苷。Pandey等[15]發(fā)現(xiàn)來自地衣芽孢桿菌DSM13的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶 YjiC可在體外作用于23種類黃酮。

    本文主要研究來源于大腸桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶GT-1、GT-2以及蘇云金芽孢桿菌BTGT-1 3種糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)槲皮素的糖基化修飾,進(jìn)而又對(duì)槲皮素及其糖苷的水溶性進(jìn)行測定,并采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞作為體外炎癥模型[16-18]研究槲皮素及其糖苷產(chǎn)物的體外抗炎活性作用,以期為以后槲皮素糖基化工業(yè)化制備提供新的思路,為槲皮素的深入研究以及新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1菌株與質(zhì)粒EscherichiacoliBL21,重組表達(dá)載體pGEX4T-1/GT-1、pGEX4T-1/GT-2、pGEX4T-1/BTGT-1由實(shí)驗(yàn)研究前期構(gòu)建完成。糖基轉(zhuǎn)移酶GT-1、GT-2基因來源于大腸桿菌埃希菌,BTGT-1基因來源于蘇云金芽孢桿菌。3種糖基轉(zhuǎn)移酶的基因組數(shù)據(jù)來源于NCBI數(shù)據(jù)庫(https.//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7由無錫懷信生物科技有限公司饋贈(zèng)。

    1.1.2試劑與儀器 槲皮素購自成都德銳可生物科技有限公司;其他實(shí)驗(yàn)試劑購自上海國藥集團(tuán);UDP-葡萄糖、槲皮素-N-乙酰-氨基葡萄糖、UDP-N-乙酰-氨基葡萄糖均由實(shí)驗(yàn)室合成;異槲皮苷對(duì)照品、胎牛血清、高糖培養(yǎng)基DMEM、脂多糖LPS、CCK-8、NO試劑盒購自Sigma-Aldrich(中國)公司;IL-6、IL-1β 試劑盒購自杭州聯(lián)科生物科技股份有限公司;高效液相色譜儀(安捷倫公司,規(guī)格:1260);超高相液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(型號(hào):MALDI SYNAPT MS,生產(chǎn)廠家:美國沃特世公司)。

    1.2 方法

    1.2.1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 分別挑取實(shí)驗(yàn)研究前期構(gòu)建的重組菌BL21/pGEX4T-1-GT-1、BL21/pGEX4T-1-GT-2、 BL21/pGEX4T-1-BTGT-1單菌落接種至50 mL 液體LB培養(yǎng)基中(氨芐終濃度100 μg·mL-1),37 ℃培養(yǎng)過夜。按1% 接種至500 mL 液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8,加入終濃度為0.2 mmol·L-1的IPTG,25 ℃誘導(dǎo)過夜。離心收集菌體(8 000 r·min-1, 10 min,4 ℃),-80 ℃保存菌體備用。稱取10 g菌體,加入Binding buffer(PBS:140 mmol·L-1NaCl,2.7 mmol·L-1KCl,10 mmol·L-1Na2HPO4,8 mmol·L-1KH2PO4)。采用超聲波破碎后,離心收集上清,通過 GST標(biāo)簽柱,Elution buffer (50 mmol·L-1Tris-HCl,10 mmol·L-1還原型谷胱甘肽,pH 8.0)洗脫目的蛋白,蛋白純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析。

    1.2.2酶法催化槲皮素的糖基化 以槲皮素為糖基受體,UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖為糖基供體。25 mL 反應(yīng)體系包括:槲皮素0.5 mmol·L-1,糖基供體 1 mmol·L-1,MgCl2100 mmol·L-1,Tris-HCl 10 mmol·L-1,糖基轉(zhuǎn)移酶0.13 mg·mL-1,DTT 15 mmol·L-1。30 ℃水浴6 h,槲皮素含量經(jīng)HPLC檢測,并且以異槲皮苷為對(duì)照品,對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

    1.2.3槲皮素糖苷產(chǎn)物液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS) 對(duì)純化的槲皮素糖苷產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測分析。采用負(fù)離子化方式,毛細(xì)管電壓3.5 kV,加熱溫度100 ℃,檢測槲皮素糖苷分子量。

    1.2.4槲皮素和槲皮素糖苷產(chǎn)物的水溶性比較 分別稱取槲皮素和槲皮素糖苷凍干粉各10 mg,加入50% DMSO溶液10 mL,配置成濃度1 mg·mL-1母液,按照濃度1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、50.00 μg·mL-1濃度梯度稀釋,通過HPLC檢測,以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制槲皮素和槲皮素糖苷的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取過量槲皮素和槲皮素糖苷,加入蒸餾水,超聲30 min,室溫放置72 h,離心,取飽和溶液上清,HPLC檢測上清槲皮素和槲皮素糖苷含量,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線,計(jì)算其水溶液溶解度。

    1.2.5槲皮素和槲皮素糖苷產(chǎn)物體外細(xì)胞抗炎活性研究 探究槲皮素和槲皮素糖苷對(duì)脂多糖LPS 誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞瘤細(xì)胞系 RAW264.7 分泌炎癥因子NO、 IL-1β和IL-6的影響,評(píng)價(jià)其抗炎效果。

    ①CCK法[19]檢測槲皮素和槲皮素糖苷產(chǎn)物對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性作用。細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)后,將對(duì)數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中,密度為0.8×104個(gè)·孔-1,每孔100 μL,不接種細(xì)胞組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔作為空白對(duì)照。過夜培養(yǎng)待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定貼壁后去上清,分別加入100 μL終濃度為10、20、30、40、50 μmol·L-1的槲皮素和槲皮素糖苷樣品(溶于細(xì)胞培養(yǎng)基),每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔;不加藥組和空白組各3個(gè)復(fù)孔,分別加新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基,每孔100 μL,孵育24 h。每孔加入10 μL CCK-8,37 ℃,5% CO2孵育1~2 h。酶標(biāo)儀450 nm測得吸光度(OD值)。并計(jì)算細(xì)胞存活率,計(jì)算公式為:

    細(xì)胞存活率=(A加藥-A空白)/(A不加藥- A空白)×100%

    ②槲皮素和槲皮素糖苷產(chǎn)物對(duì)RAW264.7 分泌NO、IL-1β和IL-6的影響。取對(duì)數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞接種于24孔板中,密度為5×105個(gè)·孔-1,每孔0.5 mL。過夜培養(yǎng)待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定貼壁后去上清,分別加入0.5 mL終濃度為10、20、30 μmol·L-1的槲皮素和槲皮素糖苷樣品(溶于細(xì)胞培養(yǎng)基),10 μmol·L-1地塞米松作為陽性對(duì)照(溶于細(xì)胞培養(yǎng)基),每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔,不加藥組3個(gè)復(fù)孔作為空白對(duì)照,孵育4 h,棄上清,每孔加入0.5 mL終濃度為1 μg·mL-1的LPS(溶于不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基),37 ℃,5% CO2孵育15 h。離心收集上清備用。分別用NO試劑盒和IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒檢測NO、IL-1β和IL-6含量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

    已知GST標(biāo)簽大小為26 kD, GT-1、GT-2、 BTGT-1 3種目的蛋白與GST標(biāo)簽的融合蛋白大小分別為54.8、60.5、56.4 kD。純化產(chǎn)物通過SDS-PAGE電泳分析,3種純化蛋白條帶大小與預(yù)期一致;GT-1酶濃度較低,僅為0.32 mg·mL-1,GT-2和BTGT-1濃度分別為1.71、1.22 mg·mL-1。

    圖1 3種糖基轉(zhuǎn)移酶的純化SDS-PAGE 結(jié)果Fig.1 Purification SDS-PAGE results of three glycosyltransferases

    A:槲皮素與UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖反應(yīng)圖譜;B:異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品;C:GT-1催化槲皮素和UDP-葡萄糖反應(yīng)圖譜;D為:GT-2催化槲皮素和UDP-葡萄糖反應(yīng)圖譜;E:BTGT-1催化槲皮素和UDP-葡萄糖反應(yīng)圖譜。

    2.2 槲皮素糖基化反應(yīng)

    HPLC檢測結(jié)果顯示,由圖2 C、D、E可以看出,當(dāng)以UDP-葡萄糖為糖基供體時(shí),反應(yīng)6 h,HPLC圖譜顯示在10.2 min左右為槲皮素,3.7 min左右出現(xiàn)新的吸收峰,表明酶促反應(yīng)生成了新的物質(zhì)。且3種糖基轉(zhuǎn)移酶催化生成的產(chǎn)物吸收峰位置相同,表明生成同一物質(zhì)。圖2A顯示當(dāng)以UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖為糖基供體時(shí),沒有新的物質(zhì)生成。以上表明3種糖基轉(zhuǎn)移酶僅能催化槲皮素和UDP-葡萄糖發(fā)生糖基化反應(yīng),表明3種酶的催化底物選擇專一性強(qiáng)。經(jīng)計(jì)算得出GT-1、GT-2和BTGT-1催化反應(yīng)的產(chǎn)物生成率分別為5.33%、 15.18%和63.82%。整個(gè)反應(yīng)過程中副產(chǎn)物少,且生成單一產(chǎn)物。另通過對(duì)比槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(異槲皮苷)對(duì)照品 (圖2B),二者在370 nm下吸收峰的保留時(shí)間分別為3.66和3.68 min,可以判斷反應(yīng)生成的槲皮素糖苷為異槲皮苷。

    2.3 槲皮素糖苷的質(zhì)譜分析

    為進(jìn)一步確定酶催化槲皮素和UDP-葡萄糖發(fā)生糖基化反應(yīng),對(duì)酶促反應(yīng)液做液相-質(zhì)譜(LC-MS)檢測分析。結(jié)果如圖3所示,已知槲皮素分子量為302,葡萄糖分子量為180,當(dāng)以UDP-葡萄糖為糖基供體時(shí),槲皮素與葡萄糖結(jié)合形成糖苷鍵,生成1分子水(H2O),因此槲皮素糖苷的分子量為464。因檢測使用負(fù)離子源會(huì)失去氫,分子量減1,而反應(yīng)液中有槲皮素殘留,故圖譜上在463.2出現(xiàn)特異峰,為槲皮素-葡萄糖苷。檢測結(jié)果證明酶催化槲皮素和UDP-葡萄糖生成槲皮素-葡萄糖苷。

    圖3 槲皮素糖苷產(chǎn)物的LC-MS檢測Fig.3 Determination of quercetin glycoside by LC-MS

    2.4 槲皮素和槲皮素糖苷產(chǎn)物的水溶性測定

    水溶性檢測結(jié)果如表1所示。在異槲皮苷和槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖水溶性相對(duì)于槲皮素分別提高了13.8倍和15.4倍。由此可以得出槲皮素經(jīng)糖基化后,其水溶性得到較大提高。

    表1 3種化合物的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線Table 1 Standard concentration curves for three compounds

    2.5 CCK法檢測槲皮素和槲皮素糖苷產(chǎn)物對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性作用

    如表2所示,3種化合物濃度低于30 μmol·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞毒性作用與不加藥組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。當(dāng)濃度大于30 μmol·L-1時(shí),3組的細(xì)胞存活率極顯著低于不加藥組(P<0.01),同等濃度下2種槲皮素糖苷組細(xì)胞生存率高于槲皮素。表明在一定濃度范圍內(nèi),槲皮素經(jīng)糖基化后對(duì)細(xì)胞毒性具有一定的減弱作用。

    表2 3種化合物對(duì)RAW264.7的毒性作用Table 2 The toxic of three compounds on RAW264.7

    注:*和**表示與不加藥組相比差異在P<0.05和P<0.01水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.6 3種化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO、IL-1β、IL-6 的影響

    細(xì)胞經(jīng)致炎藥物L(fēng)PS刺激15 h 后,NO、IL-1β、IL-6(表3)分泌量均極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)。3種化合物組細(xì)胞經(jīng)4 h 不同濃度的保護(hù)后再經(jīng)LPS刺激15 h 后,當(dāng)濃度為10、20、30 μmol·L-1時(shí),NO、IL-1β、IL-6分泌量顯著低于LPS組(P<0.01),但顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01),且呈劑量依賴性。表明在一定濃度范圍內(nèi),3種化合均具有一定的抗炎作用。

    3 討論

    利用微生物來源的3種糖基轉(zhuǎn)移酶GT-1、GT-2和BTGT-1對(duì)槲皮素進(jìn)行糖基化修飾,發(fā)現(xiàn)3種酶僅能催化槲皮素和UDP-葡萄糖為底物生成槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(異槲皮苷),GT-1、GT-2和BTGT-1催化反應(yīng)的產(chǎn)物生成率分別為5.33%、15.18%和63.82%。同時(shí)也對(duì)槲皮素、異槲皮苷和實(shí)驗(yàn)室保存的槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖進(jìn)行水溶性以及體外細(xì)胞抗炎活性評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)槲皮素經(jīng)糖基化后其水溶性得到較大提高,異槲皮苷和槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖水溶性分別是槲皮素的13.8倍和15.4倍。同等濃度下槲皮素糖苷對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的毒性作用低于槲皮素。且3種化合物在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO、IL-1β、IL-6 都有顯著的抑制作用,且呈劑量依賴性。表明3種化合物都具有一定的抗炎作用,該研究為槲皮素糖基化制備提供了新的思路,為槲皮素的新藥研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

    表3 3種化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO、IL-1β、IL-6 的影響Table 3 Effects of the three compounds on release of NO、IL-1β、IL-6 in LPS-reduced RAW264.7 cells

    注:同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

    槲皮素作為黃酮類化合物中的代表化合物,廣泛存在于紅洋蔥、茶和蕓苔屬蔬菜以及許多種子、棉花和葉子中,具有豐富的藥理活性[1],包括抗氧化、抗癌、抗炎、抗腫瘤、降低血壓等作用[2-5]。然而槲皮素的水溶性極差,幾乎不溶于水,生物利用度差[6]。可以考慮對(duì)槲皮素進(jìn)行糖基化修飾提高其水溶性,進(jìn)而提高槲皮素的生物利用度。而酶法合成槲皮素糖苷是一種高效的方法。RAW264.7是小鼠巨噬細(xì)胞,經(jīng)LPS刺激可以產(chǎn)生多種炎癥因子如NO、IL-1β、IL-6等[20],通過探究槲皮素及其糖苷對(duì)炎癥因子的影響評(píng)價(jià)其抗炎活性。

    本研究利用基因來源于大腸桿菌的GT-1、GT-2以及蘇云金芽孢桿菌的BTGT-1 3種糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成槲皮素糖苷,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和純化獲得3種糖基轉(zhuǎn)移酶。研究發(fā)現(xiàn)3種糖基轉(zhuǎn)移酶都能夠催化以槲皮素和UDP-葡萄糖為底物生成槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(異槲皮苷),但不能催化槲皮素和UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖發(fā)生反應(yīng),結(jié)果表明3種酶的底物選擇專一性強(qiáng)。另通過對(duì)槲皮素及槲皮素糖苷水溶性和體外抗炎活性評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)槲皮素經(jīng)糖基化后其水溶性得到較大提高。而體外細(xì)胞抗炎活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素具有一定的抗炎活性,且經(jīng)糖基化修飾后仍能保持其抗炎活性。

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