SBBR反應(yīng)器中耐冷微生物的馴化與識(shí)別

吳涵，陳瀅，劉敏，王淑瑩，張偉

（1 四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，四川成都610065； 2 北京工業(yè)大學(xué)城鎮(zhèn)污水深度處理與資源化利用技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京100124； 3 四川大學(xué)高分子研究所高分子材料工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610065）

引 言

在我國(guó)，污水處理廠多使用生物法處理污水[1]，該方法在常溫下運(yùn)行效果較好。但是我國(guó)北部地區(qū)及西部高寒地區(qū)常年低溫（例如四川阿壩州高原常年氣溫為3.1～16.3℃[2]），使得微生物活性受到影響，硝化作用急劇下降，影響出水水質(zhì)。有研究表明，溫度對(duì)微生物代謝過(guò)程影響較大，特別是硝化菌容易受到溫度的影響，溫度低于15℃后，細(xì)菌生物活性變差[3]；低于5℃進(jìn)入極端環(huán)境后，污水處理效果大幅下降[4]。改善這一問(wèn)題的傳統(tǒng)方法除調(diào)整傳統(tǒng)的活性污泥法系統(tǒng)的運(yùn)行參數(shù)之外[5]，主要有化學(xué)強(qiáng)化混凝[6]、人工濕地強(qiáng)化[7]、投加高效耐冷菌種技術(shù)[8]等強(qiáng)化低溫污水的處理效果。近年來(lái)，大多數(shù)生物法處理低溫污水的研究多集中在顆粒污泥培養(yǎng)[9]和生物強(qiáng)化技術(shù)[2]上，但其工藝措施仍有不足，甚至可能引起污泥膨脹問(wèn)題[10]。耐冷菌的富集強(qiáng)化技術(shù)成為了解決方案之一。

序批式生物膜反應(yīng)器（sequencing biofilm batch reactor，SBBR）工藝將活性污泥法和生物膜法相結(jié)合[11]，它增加了每單位反應(yīng)器體積的生物量群的大小和微生物多樣性，從而創(chuàng)造了提高污染物生物降解效率的條件，且填料的存在避免了污泥膨脹問(wèn)題。近年來(lái)，隨著微生物分子生態(tài)學(xué)研究的發(fā)展，以Illumina 為代表的高通量測(cè)序技術(shù)[12]因其測(cè)序成本低、信息采集量大、適用性廣的優(yōu)點(diǎn)逐漸被熟識(shí)，將高通量測(cè)序技術(shù)與污水處理菌種篩選相結(jié)合更有利于對(duì)生物膜微生物群落水平的分析和鑒定[13]。

本實(shí)驗(yàn)則旨在對(duì)以SBBR 方式運(yùn)行的反應(yīng)器進(jìn)行逐步降溫，并比較分別使用不同填料的三個(gè)反應(yīng)器在低溫下的出水水質(zhì)差異。進(jìn)一步對(duì)填料上的微生物進(jìn)行16S rRNA 高通量測(cè)序。既利用SBBR工藝的優(yōu)點(diǎn)，又在微生物群落水平上解釋不同反應(yīng)器理化指標(biāo)的差異并識(shí)別出耐低溫的污水處理微生物，同時(shí)對(duì)比選擇出更有利于低溫微生物生長(zhǎng)的填料載體，為進(jìn)一步富集低溫菌，投入低溫污水處理的使用提供依據(jù)和支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置與材料

設(shè)計(jì)了3個(gè)有效容積800 ml的完全相同的反應(yīng)器，放在同一恒溫控制箱內(nèi)，24 h 在線監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示，溫度波動(dòng)在±0.1℃內(nèi)。低溫實(shí)驗(yàn)階段是在冬季進(jìn)行，能夠保證在預(yù)設(shè)溫度內(nèi)開(kāi)展。三個(gè)反應(yīng)器分別按填料比80%放置三種不同的填料，分別命名為A 反應(yīng)器、B 反應(yīng)器、C 反應(yīng)器。三個(gè)反應(yīng)器均以序批式方式運(yùn)行，換水比為50%，每個(gè)溫度下具體曝氣時(shí)間、靜置時(shí)間安排見(jiàn)表1。

A反應(yīng)器使用普通商用聚乙烯懸浮填料作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，形狀規(guī)格為白色柱狀，直徑2.5 cm，厚1 cm；B反應(yīng)器中為自制陽(yáng)離子改性聚乙烯懸浮填料，淡黃色柱狀，直徑2.5 cm，厚1 cm；C 反應(yīng)器為石墨烯改性聚乙烯懸浮填料，黑色柱狀，直徑2.5 cm，厚0.4 cm，具體填料樣式如圖1所示。

1.2 接種污泥及配水

圖1 三種填料Fig.1 Fillers in three reactors

接種污泥為成都市某污水處理廠的回流污泥，其混合液懸浮固體濃度（mixed liquid suspended solids, MLSS）為(5500±50) mg/L。實(shí)驗(yàn)用水為模擬中試現(xiàn)場(chǎng)配制的生活污水，其化學(xué)需氧量(COD)為(300±40)mg/L，氨氮為(30.0±3.00)mg/L，總磷（TP）為(4.00±0.20) mg/L，并加入NaHCO3保證足夠的堿度，使pH=6～8，設(shè)置生物膜培養(yǎng)的初始溫度為25℃，三個(gè)反應(yīng)器曝氣流量一樣，DO＞4.5 mg/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)具體方案如表1 所示，三個(gè)反應(yīng)器除使用填料不同外，進(jìn)水、接種污泥及濃度以及運(yùn)行條件都完全相同。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段：第一階段為常溫下生物膜培養(yǎng)馴化階段：接種污泥后，三個(gè)反應(yīng)器在25℃下運(yùn)行140 個(gè)周期。在運(yùn)行到第20 個(gè)周期時(shí)，COD 去除率達(dá)80%以上時(shí)，抖動(dòng)填料后，排掉所有懸浮和脫落污泥。第二階段為逐步降溫正式運(yùn)行階段：在25、20、15、10、6和5℃下依次降溫運(yùn)行不同周期。每周期對(duì)應(yīng)污染物去除負(fù)荷計(jì)算公式如式（1）所示

式中，LB為去除負(fù)荷，g 污染物/(m3·d)；n為一日之內(nèi)的周期數(shù)，周期/日；Q為一周期內(nèi)的進(jìn)水流量，立方米/周期；C0、Ce分別為進(jìn)水、出水污染物濃度，g/m3；Tc為一個(gè)處理周期的時(shí)間，h；V為反應(yīng)器有效容積，m3；Ta為一個(gè)處理周期內(nèi)反應(yīng)的有效時(shí)間，h。

表1 實(shí)驗(yàn)方案參數(shù)Table 1 Experimental protocol parameters

各反應(yīng)器脫氮表觀活化能Arrhenius 計(jì)算公式如式（2）所示[14]

式中，r為脫氮速率，kg N/(m3·d)；Ea為表觀活化能，J/(mol NH3-N)；R為摩爾氣體常量，8.314 J/(kg·K)；T為熱力學(xué)溫度，K；A為指前因子。

1.4 水質(zhì)檢測(cè)方法

第一階段每2 個(gè)周期，第二階段每個(gè)周期取進(jìn)水、出水水樣進(jìn)行水質(zhì)測(cè)定。每個(gè)溫度條件下最后一個(gè)周期取填料上的生物膜進(jìn)行鏡檢觀察。采用快速消解分光光度法（HJ/T 399—2007）測(cè)定COD，檢測(cè)儀器為5B-2H 便攜多參數(shù)水質(zhì)分析儀；采用納氏試劑分光光度法（HJ 535—2009）測(cè)定氨氮濃度，檢測(cè)儀器為L(zhǎng)5S 紫外分光光度計(jì)；采用電化學(xué)測(cè)量法測(cè)定DO，檢測(cè)儀器為WTW Multi3430便攜式溶氧測(cè)定儀；采用玻璃電極法測(cè)定pH，檢測(cè)儀器為HI98128 pH 測(cè)試儀；采用重量法測(cè)定MLSS，檢測(cè)儀器包括分析天平、101-2 電熱鼓風(fēng)干燥箱；微生物鏡檢儀器為OLYMPUS BX51 系統(tǒng)顯微鏡。

1.5 16S rRNA高通量測(cè)序

取5℃下穩(wěn)定運(yùn)行后的三個(gè)反應(yīng)器填料上的生物膜進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序鑒定工作由羅寧生物公司完成，具體的實(shí)驗(yàn)方法如下：生物膜總RNA 提取使用RNeasy PowerSoil Total RNA Kit（QIAGEN 公 司）完成，隨后使用5X All-In-One RT MasterMix（ABM 公司）逆轉(zhuǎn)得到第一連cDNA 并定量。用KOD-Plus-Neo（TOYOBO）高保真酶對(duì)cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 所用引物已經(jīng)融合了Miseq 測(cè)序平臺(tái)的16S rDNA V4 通 用 引 物 ，515F 引 物 ：5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'；806R 引 物：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，每個(gè)PCR 反應(yīng)終止于線性擴(kuò)增期，PCR 結(jié)束后將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后進(jìn)行電泳檢測(cè)，使用膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA 片段。參照電泳初步檢測(cè)結(jié)果，將PCR 回收產(chǎn)物用Qubit 2.0（ThermoFisher 公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。使用Illumina 公司的TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit (FC-121-3001/3003)建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建。將混合好的文庫(kù)用Illumina MiSeq 測(cè)序儀測(cè)序并分析。

1.6 測(cè)序數(shù)據(jù)分析方法

測(cè)序得到的原始下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)拼接后，再根據(jù)Barcode 區(qū)分樣品，使用UCHIME 算法去除低質(zhì)量序列和嵌合體。利用UPARSE 算法在97%的相似性水平上進(jìn)行OTU（operational taxonomic units）的聚類，篩選OTU 的代表性序列，使用SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類信息的劃分，對(duì)代表性序列進(jìn)行比對(duì)并過(guò)濾，然后重構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，過(guò)濾掉不需要的OTU 并進(jìn)行重抽樣，并計(jì)算各個(gè)分類水平上的豐度信息。統(tǒng)計(jì)和作圖主要使用R、python 和java 等完成，用R分析微生物群落的Alpha多樣性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)器去除污染物效果

經(jīng)過(guò)第一階段長(zhǎng)時(shí)間的生物膜培養(yǎng)，A、B 和C三個(gè)反應(yīng)器COD 出水濃度分別達(dá)到26、37和39 mg/L，氨氮出水濃度分別為0.43、1.07和0.52 mg/L，均降低至《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 18918—2012）的一級(jí)A 類排放標(biāo)準(zhǔn)以下。第二階段正式降溫運(yùn)行過(guò)程中，25℃時(shí)三個(gè)反應(yīng)器出水水質(zhì)相近。隨著溫度的降低，污染物的去除效果在不同溫度以及不同反應(yīng)器下產(chǎn)生了差異，A 反應(yīng)器填料上的生物膜有部分脫落，B、C反應(yīng)器生物膜生長(zhǎng)情況較好。由于每次溫度降低后微生物的活性都會(huì)受到影響，處理效果有所波動(dòng)，所以取每個(gè)溫度下運(yùn)行最穩(wěn)定的最后6 個(gè)周期的去除負(fù)荷、出水濃度和污染物去除率的平均值進(jìn)行分析比較。

2.1.1 COD 去除效果 隨著溫度的降低，微生物的活性逐漸降低，如果不改變曝氣時(shí)長(zhǎng)，COD 去除效果會(huì)變差，為了達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)對(duì)水質(zhì)的要求，實(shí)驗(yàn)在第二階段降溫過(guò)程中延長(zhǎng)了每周期的曝氣時(shí)間，導(dǎo)致圖2 中去除負(fù)荷隨溫度的降低而降低。25℃的平均去除負(fù)荷是5℃的近三倍，15℃與20℃相比去除負(fù)荷下降最快，三個(gè)反應(yīng)的平均去除負(fù)荷由300 g COD/(m3·d)下降到100 g COD/(m3·d)，5℃和6℃的有機(jī)物去除效果相近。雖然總體的去除負(fù)荷有明顯的降低，但使用三種不同填料的SBBR 在相同溫度下的去除負(fù)荷相近，對(duì)有機(jī)物的去除效果差異不大。

溫度下降的過(guò)程中，為了保證出水水質(zhì)達(dá)標(biāo)延長(zhǎng)了曝氣時(shí)間，由圖3可知，在選取了合適的去除負(fù)荷后，三個(gè)反應(yīng)器COD 去除率均達(dá)到80%以上，其出水濃度都穩(wěn)定在50 mg/L 以下，且沒(méi)有明顯隨溫度降低而變化的趨勢(shì)。這說(shuō)明不同溫度下，選取了合適的去除負(fù)荷，填料的類型對(duì)COD 的去除不會(huì)有太大影響。

圖2 不同溫度下COD的去除負(fù)荷箱式圖Fig.2 COD removal load at different temperatures

圖3 不同溫度下COD出水情況統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 COD effluent at different temperatures

2.1.2 氨氮去除效果 在污水處理中，氨氮是監(jiān)測(cè)出水水質(zhì)的重要指標(biāo)之一，較高的氨氮濃度易造成水體富營(yíng)養(yǎng)化等水質(zhì)問(wèn)題。

溫度降低影響了硝化菌的活性，使出水氨氮濃度難以達(dá)標(biāo)。采取延長(zhǎng)曝氣時(shí)間來(lái)降低去除負(fù)荷保證至少一個(gè)反應(yīng)器出水濃度達(dá)標(biāo)。由圖4 可知，25℃時(shí)，三個(gè)反應(yīng)器的氨氮去除負(fù)荷并無(wú)太大差別。與COD 去除情況不同的是，隨著溫度的降低，三個(gè)反應(yīng)器對(duì)氨氮的去除情況產(chǎn)生了差異，使用自制填料的B反應(yīng)器的氨氮去除負(fù)荷在各個(gè)溫度下均高于其他反應(yīng)器。箱式圖的垂直延伸線代表了所有數(shù)值在四分位數(shù)以外的可變性，由圖對(duì)比可知隨著溫度的降低，B 反應(yīng)器的氨氮去除效果可變性較小，尤其是在6℃和5℃時(shí)，B 反應(yīng)器去除負(fù)荷數(shù)值較集中且極端值偏差不大，穩(wěn)定性高于A、C 反應(yīng)器。這說(shuō)明B反應(yīng)器中的自制填料更有利于微生物的穩(wěn)定生長(zhǎng)，其中的微生物在低溫下對(duì)氨氮的去除能力更強(qiáng)，效率更高，且去除效果更加穩(wěn)定，出現(xiàn)極端情況的可能性小。

由圖5可得，經(jīng)過(guò)第一階段的長(zhǎng)期馴化，三個(gè)反應(yīng)器氨氮去除率均穩(wěn)定在90%以上。在25℃時(shí)出水情況基本相同，降溫到20℃時(shí)出現(xiàn)差異，A反應(yīng)器氨氮出水濃度為13.7 mg/L，B 反應(yīng)器為4.36 mg/L，C反應(yīng)器為14.1 mg/L，B 反應(yīng)器遠(yuǎn)好于A、C 反應(yīng)器的出水效果。隨著溫度的繼續(xù)降低，每個(gè)溫度下B 反應(yīng)器的去除率始終較高。在5℃時(shí)，三個(gè)反應(yīng)器中氨氮的出水濃度分別為14.1、3.79 和14.1 mg/L，B 反應(yīng)器出水濃度始終達(dá)標(biāo)。另外，圖6 為A、B、C 三個(gè)反應(yīng)器脫氮速率與熱力學(xué)溫度的關(guān)系圖，由Arrhenius 計(jì)算公式得到A、B 和C 三個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)的表 觀 活 化 能 分 別 為68.96、57.48 和62.98 kJ/mol。Arrhenius 公式可用來(lái)量化生物反應(yīng)對(duì)溫度的依賴性[14]，表觀活化能越高，對(duì)溫度的變化越敏感。由此可知，接種原始污泥后，三個(gè)反應(yīng)器的生物系統(tǒng)隨著溫度的改變發(fā)生了不同的變化，A、C 反應(yīng)系統(tǒng)更易受到溫度變化的影響，脫氮效果因低溫變差，而B(niǎo)反應(yīng)器的生物系統(tǒng)進(jìn)化得更加穩(wěn)定，抵抗低溫能力較強(qiáng)，保證了出水水質(zhì)達(dá)標(biāo)。由以上可說(shuō)明，以商用填料作為對(duì)照，B 反應(yīng)器中的自制填料更有利于微生物在常溫和低溫下的附著和生長(zhǎng)，適合進(jìn)行深入研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

圖4 不同溫度下氨氮去除負(fù)荷箱式圖Fig.4 NH3-N removal load at different temperatures

圖5 不同溫度下氨氮出水情況統(tǒng)計(jì)圖Fig.5 NH3-N effluent at different temperatures

圖6 三個(gè)反應(yīng)器的脫氮速率與熱力學(xué)溫度的關(guān)系Fig.6 Relationship between nitrogen removal rate and thermodynamic temperature

表2 所示為本研究與近年其他文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)低溫條件下氨氮去除的研究。艾勝書(shū)等[15]利用多段多級(jí)AO 生物膜工藝在10℃條件下去除氨氮，降低溫度后出水效果無(wú)法保證；張斌等[16]在四川高寒地區(qū)運(yùn)用改良型A2/O工藝在低溫下進(jìn)行脫氮，其技術(shù)先進(jìn)可靠，運(yùn)行成本低，但10℃以下難以保證出水效果；Feng 等[17]利用沸石的離子交換作用和細(xì)菌的硝化作用在低溫下同時(shí)吸收氨氮等污染物，在6℃低溫下可達(dá)到較好的氨氮去除效果，但沸石的重復(fù)利用還需要人工投藥進(jìn)行解吸，操作煩瑣；伍海全等[2]則利用生物強(qiáng)化技術(shù)對(duì)照投加經(jīng)低溫馴化后的耐冷菌和未經(jīng)馴化的硝化菌觀測(cè)出水中氨氮濃度，其菌種由LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)得到，進(jìn)水氨氮濃度較低，且實(shí)驗(yàn)運(yùn)行周期較短，無(wú)法保證在有大量復(fù)雜污染物的生活污水中長(zhǎng)期投用。本研究中以自制填料B 為載體培養(yǎng)的生物膜在低溫5℃時(shí)，進(jìn)水氨氮濃度為30 mg/L，去除負(fù)荷達(dá)到10.88 g 氨氮/(m3·d)時(shí)，出水氨氮濃度為3.79 mg/L，達(dá)到一級(jí)A 類標(biāo)準(zhǔn)的要求。可應(yīng)用于北方冬季或高寒地區(qū)的污水處理廠。為探究與這些理化指標(biāo)相關(guān)的微生物生長(zhǎng)情況，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了反應(yīng)器內(nèi)的微生物生長(zhǎng)情況與其群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

表2 近年來(lái)其他組對(duì)低溫條件下氨氮去除的研究Table 2 Comparison of other groups in recent years on NH3-N removal under low temperature conditions

2.2 生物膜鏡檢結(jié)果

微型動(dòng)物數(shù)量是表示污泥性質(zhì)、運(yùn)行環(huán)境和出水水質(zhì)的指標(biāo)[18]，但對(duì)其在不同溫度下分布情況的研究較少。因本研究中B反應(yīng)器出水效果遠(yuǎn)好于其他反應(yīng)器，所以重點(diǎn)觀察了B 反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中微型動(dòng)物中鐘蟲(chóng)[19]、輪蟲(chóng)[20]和線蟲(chóng)[21]的情況。如表3 所示，在25℃時(shí)，鐘蟲(chóng)、輪蟲(chóng)與線蟲(chóng)均數(shù)量較多且活性較高。20℃時(shí)鐘蟲(chóng)、輪蟲(chóng)減少，線蟲(chóng)數(shù)量變化不大，在6℃時(shí)鐘蟲(chóng)和輪蟲(chóng)基本消失，只剩下少量線蟲(chóng)?？梢?jiàn)隨著溫度的降低，鐘蟲(chóng)、輪蟲(chóng)都因不適應(yīng)環(huán)境逐漸消失死亡，而線蟲(chóng)對(duì)其環(huán)境的改變?nèi)杂幸欢ㄟm應(yīng)能力。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

本研究采用16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)探究活性污泥中微生物的種類，從微生物群落結(jié)構(gòu)水平解釋理化指標(biāo)上的差異性。

表3 不同溫度下微生物鏡檢結(jié)果Table 3 Microbiological examination results at different temperatures

2.3.1 COD 去除相關(guān)菌屬的分析 為了方便研究樣本的物種組成及多樣性信息，通常在97%的相似水平下進(jìn)行OTU（operational taxonomic units）聚類分析。每個(gè)OTU 代表的是一類相似序列的集合，基于OTU 豐度表和注釋后的分類信息表，可得到在屬水平對(duì)各個(gè)樣本的相對(duì)豐度表。而相對(duì)豐度較大的優(yōu)勢(shì)菌屬則在反應(yīng)體系中主導(dǎo)污染物的去除。

低溫情況下，三個(gè)反應(yīng)器對(duì)COD 的去除情況差別不大，且出水濃度都在50 mg/L 以下，高通量測(cè)序結(jié)果顯示，在豐度前五十的OTU 中，與去除COD相關(guān)的OTU 種類多達(dá)14 種,豐度占全部菌屬的53.73%（圖7），而去除氨氮的相關(guān)菌屬豐度低，種類少，由此可說(shuō)明與COD 去除相關(guān)的菌屬為反應(yīng)體系中的優(yōu)勢(shì)菌，在低溫下對(duì)污水的有機(jī)物處理效果較好。

為進(jìn)一步解釋三個(gè)反應(yīng)器出水效果差異較小的原因，對(duì)去除COD 相關(guān)微生物中豐度最高的四種菌屬的屬水平豐度進(jìn)行進(jìn)一步的分析討論，如表4所示。其中Saprospiracea為腐螺旋菌，在低溫下易大量增殖且生長(zhǎng)穩(wěn)定[26]；Sphingomonas為鞘氨醇單胞菌，可分解有機(jī)物，且對(duì)環(huán)境變化具有極強(qiáng)適應(yīng)能力，曾被發(fā)現(xiàn)于南極海冰中，對(duì)低溫適應(yīng)性強(qiáng)[27]。各反應(yīng)器中四種菌屬的豐度總和差別不大，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果中三個(gè)反應(yīng)器出水COD 濃度全部達(dá)標(biāo)且相差不大的結(jié)論相吻合。

表4 豐度最高的前四種去除COD微生物屬水平豐度Table 4 Abundance of the top four depleted COD microbes

2.3.2 氨氮去除相關(guān)菌屬的分析與篩選 前期的實(shí)驗(yàn)中，污泥中細(xì)菌即使死亡，由于DNA 沒(méi)有及時(shí)降解，提取DNA 測(cè)定細(xì)菌種類時(shí)會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果，本研究在高通量測(cè)序時(shí)，提取的是RNA 而不是DNA。主要是因?yàn)榧?xì)菌的RNA 在細(xì)胞中的半衰期很短，降解快速，可以保證是活細(xì)菌中的RNA。采用提取總RNA 分析細(xì)菌組成的方法可以最大程度保證測(cè)序結(jié)果分析的是活菌。

圖7 5℃時(shí)OTU豐度前五十菌屬分布餅狀圖Fig.7 Distribution of the top 50 genus of OTU abundance at 5℃

與消耗COD 的菌屬相比，與去除氨氮相關(guān)的菌屬種類較少，豐度也很低，在高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到的245 種菌屬中，僅有10 種菌屬是已有文獻(xiàn)報(bào)道的與污水中氨氮的去除有關(guān)，這說(shuō)明硝化系統(tǒng)的菌種對(duì)溫度變化非常敏感，在5℃的低溫下，大多數(shù)普通硝化菌進(jìn)入休眠狀態(tài)。如表5 所示，在這10 種菌屬中，Ellin6067[29]、Cm1-21、MND1、Nitrosomonas和966-1均屬于Nitrosomonadaceae（亞硝化單胞菌科），是城市污水處理廠活性污泥中氨氧化菌的優(yōu)勢(shì)菌[33]，該菌科在三個(gè)反應(yīng)器中豐度分別為1.91%、5.10%和3.24%。Rhodocyclaceaesp.為常見(jiàn)的反硝化聚磷菌[30]，在三個(gè)反應(yīng)器中豐度為1.02%、5.01%和0.68%，都是在B中豐度較高，利于去除氨氮。

表5 氨氮去除相關(guān)微生物屬水平豐度Table 5 NH3-N removal related microbial abundance

Elstera屬 于 α 變 形 菌 門（Alphaproteobacteriales）[28]，該菌屬在A、C 反應(yīng)器中豐度遠(yuǎn)高于B 反應(yīng)器，與硝化菌在三個(gè)反應(yīng)器中的分布情況相反，其具體功能目前沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。但是該菌屬的16S rRNA 序列與巴西固氮螺菌（Azospirillum）的序列具有91%的相似性[34]。而巴西固氮螺菌具有將空氣中的分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化成氨的固氮能力，由此推斷Elstera菌屬也可能有相似的作用，對(duì)氨氮的去除不利。

Nitrospira為常見(jiàn)的硝化螺旋菌，是硝化廢水處理廠中的主要亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）[35]，直到2007 年，Alawi 等[31]在多年凍土中才發(fā)現(xiàn)了新的NOB——CandidatusNitrotoga，并且從活性污泥中富集了近親。Candidatus Nitrotoga為 一 種 新 型 的 β 變 形 菌（Betaproteobacteriales），可在低溫下功能性地代替Nitrospira進(jìn)行硝化作用[36]，該菌屬在三個(gè)反應(yīng)器中豐度分別為0、1.05%和0.01%，同時(shí)Nitrospira在三個(gè)反應(yīng)器中豐度分別為0、0.02%和0.01%，這可以說(shuō)明B反應(yīng)器中氨氮的去除與這兩類硝化菌屬在低溫下良好的硝化作用有關(guān)。

另外，在接種原污泥的微生物種群分析中未發(fā)現(xiàn)CandidatusNitrotoga的存在，說(shuō)明該菌種只能在低溫下生存，是由實(shí)驗(yàn)在低溫下馴化培養(yǎng)出來(lái)的，與韓梅等[36]的研究結(jié)果吻合。

以某一菌屬在三個(gè)反應(yīng)器中豐度總和為底數(shù)，計(jì)算其在各反應(yīng)器中分布百分比，并以此作圖8 可以將豐度較小的菌種在反應(yīng)器中的分布差異放大，便于分析篩選雖然豐度小但造成了組間差異關(guān)鍵菌種。由圖8 可見(jiàn)，大多數(shù)與氨氮去除相關(guān)的菌屬在B 反應(yīng)器中豐度較高，尤其是Candidatus Nitrotoga在A、C 反應(yīng)器中分布幾乎為零；Elstera在A、C 反應(yīng)器中分布較多，在B 中分布較少。以上結(jié)果與前文中氨氮在不同反應(yīng)器中去除效果不同的理化數(shù)據(jù)一致。

圖8 與氨氮去除相關(guān)菌種在各反應(yīng)器中所占百分比堆積條形圖Fig.8 Percentage of strains associated with NH3-N removal in each reactor

圖9 Alpha多樣性指標(biāo)箱式圖Fig.9 Alpha diversity indicator

2.3.3 群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與多樣性分析 在群落生態(tài)研究中，Alpha 多樣性指數(shù)可以反映微生物群落的豐度（richness）、均勻性（evenness）及多樣性等,在實(shí)際應(yīng)用中微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性直接影響到出水水質(zhì)與處理效率。因此，選取Alpha 多樣性指數(shù)的四個(gè)指標(biāo)Chao1、Simpson、Shannon 和Faith’s PD來(lái)計(jì)算物種豐度與多樣性。

如圖9 所示，Alpha 多樣性的四個(gè)指標(biāo)在B 反應(yīng)器中數(shù)值均大于A、C 反應(yīng)器。Chao1 常用來(lái)估算物種總數(shù)，Simpson 則既考慮了物種的豐度也考慮了均勻性，Shannon 可估算物種多樣性，F(xiàn)aith’s PD 用來(lái)表示系統(tǒng)發(fā)育的多樣性[37]。由此結(jié)果可知，B 反應(yīng)器中菌群豐度與多樣性都較高，且數(shù)量分布均勻，發(fā)育可變性較大，其系統(tǒng)穩(wěn)定性高，抵抗外界不利條件能力強(qiáng)，與B 反應(yīng)器對(duì)污染物去除效果較好的理化結(jié)果相吻合。

3 結(jié) 論

（1）在低溫環(huán)境下，各反應(yīng)器COD 出水濃度均達(dá)到50 mg/L 以下，高通量測(cè)序結(jié)果顯示，在5℃時(shí)與去除COD 相關(guān)的菌種豐度高，種類多，屬于優(yōu)勢(shì)菌。其中Saprospiracea與Sphingomonas可適應(yīng)低溫環(huán)境正常代謝，且相關(guān)菌種總量在三個(gè)反應(yīng)器中差異不大。

（2）經(jīng)過(guò)逐步降溫過(guò)程的馴化后，裝有自制填料的B反應(yīng)器在低溫下對(duì)氨氮的去除效果優(yōu)于A和C 反應(yīng)器，5℃時(shí)，B 反應(yīng)器出水氨氮濃度為3.79 mg/L，A、C 反應(yīng)器的出水氨氮平均濃度均為14.1 mg/L。說(shuō)明該填料優(yōu)于普通商用填料和另一自制填料。對(duì)于污水處理廠使用填料的改善和優(yōu)化具有較大意義。

（3）B 反應(yīng)器的填料在低溫條件下馴化富集了低溫硝化菌CandidatusNitrotoga，其他常見(jiàn)硝化菌豐度也高于A 和C 反應(yīng)器，且不利于氨氮去除的類固氮菌Elstera在B 反應(yīng)器中豐度最低，微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)于A 和C 反應(yīng)器，高通量測(cè)序結(jié)果與理化指標(biāo)相吻合。

（4）在溫度降低的過(guò)程中，污水處理中常見(jiàn)的微型動(dòng)物隨著溫度的降低逐漸減少，10℃時(shí)幾乎消失，線蟲(chóng)的數(shù)量相比下降緩慢，5℃時(shí)仍有少量存活。