氧氣和一氧化碳在人血紅蛋白遷移過程研究

彭雪，蘆琛璘，盧滇楠

（化學工程聯(lián)合國家重點實驗室，清華大學化學工程系，北京100084）

引 言

氣體分子與生物大分子的結合與解離對于生命活動具有重要的意義。血紅素分子和氧氣（O2）的結合與解離是血紅蛋白發(fā)揮生理功能的物理基礎[1]。一般認為，一氧化碳（CO）和氧氣具有共同的結合位點，從而形成競爭機制。然而，這兩種氣體如何從血液進入血紅蛋白內(nèi)部的血紅素結合位點，又是如何脫離該位點而重新回到血液之中一直存在著比較大的爭論。因此，從原子水平上去理解血紅蛋白的載氧功能及其機制是一個巨大的挑戰(zhàn)[2-5]。

人血紅蛋白是由兩條α 鏈和兩條β 鏈組成的四聚體蛋白。氧合血紅蛋白為R 態(tài)，脫氧血紅蛋白為T 態(tài)[6]。每個亞基上均有一個包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的血紅素分子，可以與O2或者CO 結合。血紅素分子被包埋在蛋白內(nèi)，因此解析氣體分子從溶劑擴散到結合位點的遷移路徑成為理解血紅蛋白功能機制的關鍵[7]，同時也是人工血液替代品理性設計的重點。1966 年，Perute 等[8]依據(jù)人血紅蛋白晶體結構，發(fā)現(xiàn)組氨酸可能是影響氣體分子遷移的關鍵氨基酸（histine gate），提出了一條氣體遷移的組氨酸通道。在高壓Xe 氣氛下，用X 射線晶體衍射確定了可能與Xe 結合的位點。這些位點周圍氨基酸形成的空穴可能組成了氣體分子到達活性位點所經(jīng)歷的遷移途徑[9]。近年來，隨著高分辨瞬時檢測技術的發(fā)展，研究者對于氣體在血紅蛋白內(nèi)部遷移的動力學進行了解析。例如，Lepeshkevich 等采用激光動力學光譜對人體R 態(tài)氧化血紅蛋白α 單鏈進行了分析[10]，進而又采用了納秒激光閃光光解技術研究了O2遷移過程[11]，得出了O2擴散進入以及離開蛋白的完整動力學路徑，并且觀察到了除Xe位點之外的其他O2停留位點。然而目前的實驗研究僅能夠給出人血紅蛋白內(nèi)部空腔中氣體分子的大致分布，無法對擴散通道進行準確辨認。更為重要的是，目前尚無法實驗觀察到氣體遷移過程途徑中因蛋白質(zhì)柔性產(chǎn)生的瞬時通道，更無法對其功能予以描述[10]。人血紅蛋白的瞬時通道主要存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部，是由疏水性氨基酸組成。迄今為止，實驗唯一觀察到的是遠端組氨酸側鏈因運動而打開的組氨酸大門[12-13]，以及由Leu-29、Phe-33、Phe-43、Phe-46、His-64和Val-68組成的通道，研究表明該擴散距離最短的通路可能是氣體分子遷移的主要通道[9-13]。

作為實驗研究的有益補充，分子動力學模擬日益得到研究者的關注。由于人血紅蛋白結構復雜，目前研究主要集中在變構效應[14]。相比而言，肌紅蛋白因其結構簡單，是目前O2和CO 遷移路徑研究的熱點[15-24]。例如，Yu 等[17]在2015 年提出肌紅蛋白內(nèi)完整的CO 遷移動力學示意圖，這與實驗上普遍認為的經(jīng)過血紅素上方組氨酸大門的單一路徑不符。隨著計算能力增強，近年來出現(xiàn)了對人血紅蛋白的分子模擬研究。例如，采用全原子分子動力學模擬對O2離開R 態(tài)人血紅蛋白的α 單鏈進行分析，提出四條沒有受到其他亞基阻擋的通道，但該研究并沒有發(fā)現(xiàn)近端空腔[11]。Lepeshkevich 等[10]采用PELE（protein energy landscape exploration）方法，研究了CO 離開T 態(tài)及R 態(tài)人血紅蛋白的過程，發(fā)現(xiàn)T態(tài)和R 態(tài)的主要區(qū)別是T 態(tài)時E 螺旋的倒塌部分堵住了組氨酸大門，而在肌紅蛋白中發(fā)現(xiàn)的XE1 位點并沒有出現(xiàn)在人血紅蛋白中。接著研究者對T態(tài)人血紅蛋白進行全原子分子動力學模擬，找到了O2離開以及進入α 鏈和β 鏈的多條通路，而不再僅僅是實驗觀察到的以組氨酸為出口的唯一通道[25-26]。除此之外，其他類血紅蛋白也多涉及此過程[27]，如Bustamante 等[28]曾對O2在截斷血紅蛋白的擴散行為進行詳細分析。

馬爾科夫狀態(tài)模型是一種后處理統(tǒng)計學模型，其通過構建平衡概率矩陣和轉(zhuǎn)移概率矩陣，可以從有限的分子動力學模擬數(shù)據(jù)中演化出與蛋白結構變化相關的熱力學和動力學信息，基于大規(guī)模分子動力學模擬構建馬爾科夫狀態(tài)模型已逐漸成為研究生物大分子構象變化的重要工具[17,24,27]?？傮w來看，人體血紅蛋白是最復雜、含量最多、最有研究意義的血紅蛋白[29]，而目前還沒有對O2和CO擴散進入R態(tài)遷移過程的報道。因此本論文的目的是運用分子動力學模擬結合馬爾科夫狀態(tài)模型的方法對該過程進行分析，以加深對人體血紅蛋白生理功能的認識，為后續(xù)人工血液替代品的理性設計提供參考。

1 模型和方法

1.1 模型

血紅蛋白的晶體結構源自PDB 數(shù)據(jù)庫（PDB：1hho），為R 態(tài)人血紅蛋白[30]，去掉結構中的結晶水分子得到獨立的α 鏈和β 鏈。分子動力學模擬在Gromacs5.12 平臺上進行，采用GROMOS96 43a1 力場，體系壓力為0.1 MPa，溫度為293 K。向邊長為6.5 nm 的正方形水盒子中加入溶劑水分子8629 個，水分子采用SPC/E 模型[10]，O2和CO 的力場參數(shù)分別源自文獻[25]和文獻[31]，忽略氣體分子的四極矩運動[21]。為了提高模擬體系取樣精度，模擬盒子中O2和CO 的分子數(shù)分別為10 個和50 個，高于O2和CO在人體內(nèi)的溶解度[32-33]，類似的處理方式在其他分子模擬研究中也經(jīng)常使用[31,34-35]。將人血紅蛋白置于正方形盒子中心，溶劑化后將氣體分子隨機分布在蛋白周圍的溶液中，添加離子使得模擬體系保持電中性。x、y和z方向均采用周期性邊界條件。

1.2 模擬方法

首先使用最陡下降法對系統(tǒng)進行能量優(yōu)化，然后在正則系綜（NVT）下固定蛋白運行模擬1 ns，最后在平衡溫度和壓力下（NPT 系綜）進行多次不同初始構象的分子動力學模擬。分子動力學積分采用跳蛙（leap-frog）積分的方法，積分步長為2 fs，每10 步更新一次鄰里列表（neighbor list）。庫侖和范德華截斷半徑均為1.4 nm。采用PME 方法處理靜電相互作用，采用SHAKE 算法固定鍵長。溫度和壓力分別采用V-rescale 和Parrinello-Rahman 方法來控制。

1.3 馬爾科夫狀態(tài)模型和轉(zhuǎn)移路徑理論

為了構建馬爾科夫狀態(tài)模型，對氣體在α 鏈和β 鏈中的擴散進行多次模擬，累計O2和CO 的模擬時長分別為450 ns 和700 ns。以處理后的分子動力學軌跡作為輸入，蛋白碳骨架扭轉(zhuǎn)運動為特征值，利用PyEMMA 2.5.5 建立馬爾科夫狀態(tài)模型。為了捕捉到過程中最慢的時間尺度，采用時滯獨立成分分析（TICA）方法將輸入數(shù)據(jù)的高維空間線性降維為描述最慢過程的低維空間。在低維空間中，采用K 均值聚類算法獲得不同的微觀狀態(tài)。利用最大似然估計算法，在微觀狀態(tài)下生成過渡矩陣P。用不同滯后時間下的隱含時間尺度和查普曼-科爾莫戈羅（Chapman-Kolmogorow）檢驗對模型進行驗證。在微觀狀態(tài)的弛豫時間尺度中找到跳躍間隙，從而確定不同平衡分布的亞穩(wěn)狀態(tài)，再由主成分聚類分析(perron analysis)方法將微觀狀態(tài)劃分為相對應的亞穩(wěn)狀態(tài)。因為模型本身的復雜性，很難了解不同狀態(tài)之間的平衡和轉(zhuǎn)換，因此對于不同的亞穩(wěn)狀態(tài)采用過渡路徑理論（TPT）來計算初始狀態(tài)到終止狀態(tài)的轉(zhuǎn)移通量，其滿足轉(zhuǎn)移概率矩陣的細致平衡條件（micro-reversibility）和各態(tài)遍歷性（ergodicity）。

1.4 人血紅蛋白結構分析

迴轉(zhuǎn)半徑（radius of gyration,Rg）反映了蛋白質(zhì)分子結構緊密程度，其值越小則蛋白質(zhì)結構越致密[36]，其計算公式為

均方根偏差（root mean square deviation，RMSD)反映了蛋白質(zhì)結構與特定結構（這里選擇晶體結構）的偏離程度，其值越大則蛋白質(zhì)結構變化越顯著[37]，其計算公式為

均 方 根 漲 落（root mean square fluctuation，RMSF）反映了模擬過程中氨基酸殘基的漲落情況，其值越大則蛋白質(zhì)中該氨基酸漲落越明顯，局部結構柔性越強，其計算公式為

2 結果及討論

2.1 遷移路徑分析

圖1～圖4 分別給出了O2和CO 分子從溶液擴散進入人血紅蛋白α 和β 鏈血紅素中心的路徑和停留/結合位點。停留/結合位點的定義是，在氣體擴散過程中氣體分子經(jīng)常出現(xiàn)（長時間停留）的氨基酸位點。目前，通過實驗手段已知的主要有六個Xe位點和一個近端位點（DP）[11]。圖1～圖4 的結果表明，分子動力學模擬研究可以捕獲到全部實驗觀測的氣體結合位點。更為重要的是，通過分子動力學模擬，還捕獲到多個瞬時空穴（Ph 位點），這是實驗無法觀測到的。瞬時空穴是由于氨基酸柔性側鏈發(fā)生瞬時運動而產(chǎn)生，可以充當O2和CO 分子的臨時停留位點[38-39]。這些瞬時空穴主要由亮氨酸、苯丙氨酸及纈氨酸等疏水氨基酸組成。圖1～圖4中同時將肌紅蛋白的Xe 結合位點也標記出來。結果表明，盡管人血紅蛋白和肌紅蛋白功能類似，但是氣體分子停留/結合位點存在顯著差異。

圖1 O2在血紅蛋白α鏈中的結合位點和六條主要遷移路徑(藍色球：O2位點;箭頭連線：O2遷移軌跡;青色帶：血紅蛋白α鏈骨架;深棕色分子：血紅素;Xe1～Xe6：實驗確定Xe結合位點;DP：實驗確定近端位點;Ph1～Ph5：瞬時空穴;MbXe1～MbXe4：實驗確定肌紅蛋白Xe結合位點)Fig.1 O2binding sites and 6 major migration pathways in α chain of human hemoglobin(blue ball：O2 sites;line with arrow：migration trajectories of O2;cyan belt：backbone of α chain of human hemoglobin;brown stick：heme;Xe1—Xe6：Xe binding sites determined by experiments;DP：distal path site determined by experiemnts;Ph1—Ph5：instant cavities;MbXe1—MbXe4：Xe binding sites of myoglobin determined by experiments)

下面將詳細闡述O2和CO 在人血紅蛋白α 和β鏈中的遷移特點。

圖1 給出了O2在血紅蛋白α 鏈中的結合位點和主要遷移路徑。除了實驗觀測的位點之外，模擬還捕獲到5 個瞬時空穴，標記為Ph1～Ph5，這些空穴捕獲遷移路徑中的O2分子。O2擴散的六條路徑及其在分子模擬中出現(xiàn)次數(shù)和對應的概率如表1 所示。表1 結果表明，路徑1（水溶液→Xe6→Ph3→Xe5→DP）為O2分子在人血紅蛋白α 鏈中遷移擴散的主要通道，而Xe1 和Xe5 結合位點是O2遷移路徑中的關鍵位點。值得一提的是，盡管路徑5（水溶液→DP）遷移距離最短，但是其在可能遷移路徑中的比例僅為6.0%。這說明O2遷移并不是想象中的最短遷移途徑，而是經(jīng)歷復雜的動態(tài)遷移網(wǎng)絡。

圖2 給出了CO 在血紅蛋白α 鏈中的結合位點和主要遷移路徑。與O2結果類似，所有實驗觀測得到的Xe 結合位點和近端位點均可以結合CO。此外，還存在6個瞬時空穴，標記為Ph1～Ph6。CO擴散的六條路徑及其在分子模擬中出現(xiàn)的次數(shù)和對應的概率如表2 所示。結果表明，路徑4（水溶液→DP）和路徑5（水溶液→Ph1→Xe3→DP）是CO 在α鏈中較為重要的兩條通道。這說明盡管CO 和O2具有相似的遷移路徑，但是這些路徑的優(yōu)先級是不一樣的。除此之外，與O2不同，Ph1 和Xe3 對于CO 的停留和擴散影響更為顯著，即遷移路徑中的關鍵位點也是不一樣的。CO 和O2遷移路徑選擇概率上的區(qū)別也許是CO失活人血紅蛋白的重要原因之一。

表1 O2在α鏈中遷移路徑的次數(shù)及概率Table 1 Frequency and probability of O2 migration pathways in α chain

圖2 CO在血紅蛋白α鏈中的結合位點和六條主要遷移路徑(紅色球：CO位點;箭頭連線：CO遷移軌跡;青色帶：血紅蛋白α鏈骨架;深棕色分子：血紅素;Xe1～Xe6：實驗確定Xe結合位點;DP：實驗確定近端位點;Ph1～Ph6：瞬時空穴;MbXe1～MbXe4：實驗確定肌紅蛋白Xe結合位點)Fig.2 CO binding sites and 6 major migration pathways in α chain of human hemoglobin(red ball：CO sites;line with arrow：migration trajectories of CO;cyan belt：backbone of α chain of human hemoglobin;brown stick：heme;Xe1—Xe6：Xe binding sites determined by experiments;DP：distal path site determined by experiemnts;Ph1—Ph6：instant cavities;MbXe1—MbXe4：Xe binding sites of myoglobin determined by experiment)

表2 CO在α鏈中遷移路徑的次數(shù)及概率Table 2 Frequency and probability of CO migration pathways in α chain

類似地，可以分析O2和CO 在血紅蛋白β 鏈中的結合位點和主要遷移路徑，以及各個路徑所占比例，結果如圖3 和圖4、表3 和表4 所示。結果表明，β 鏈中存在8 個O2停留位點以及6 條主要通道，由Xe1 作為入口的通道3 是O2的主要通道。CO 的停留位點有10 個，相比O2來說增加了血紅素附近的Ph2 以及Ph3 位點，其遷移通道也存在6 條，主要是直接從水溶液經(jīng)His 殘基和血紅素結合。CO 遷移擴散途徑較短，盡管其結合常數(shù)（熱力學參數(shù)）要低于O2[40]，但從動力學上會造成蛋白β 鏈喪失功能。因此CO 造成人血紅蛋白喪失功能是一個動力學控制過程。在α 鏈以及β 鏈中，O2主要都是由內(nèi)部空腔組成的通道進行遷移，CO則主要經(jīng)由路徑較短的通道進入。而β 鏈相對于α 鏈來說，沒有發(fā)現(xiàn)經(jīng)由Xe3 直接進行遷移的通道存在，而這在α 鏈中卻是較為重要的氣體遷移通道。需要強調(diào)的是，氣體分子在α 鏈和β 鏈中遷移途徑存在差異，表明盡管兩個亞基功能相同，但是發(fā)揮作用的手段卻不同，這可能是生物在進化過程中為了應對環(huán)境復雜性而逐漸形成的。

表3 O2在β鏈中遷移路徑的次數(shù)及概率Table 3 Frequency and probability of O2 migration pathways in β chain

圖3 O2在血紅蛋白β鏈中的結合位點和六條主要遷移路徑(藍色球：O2位點;箭頭連線：O2遷移軌跡;粉色帶：血紅蛋白β鏈骨架;深棕色分子：血紅素;Xe1～Xe6：實驗確定Xe結合位點;DP：實驗確定近端位點;Ph1：瞬時空穴;MbXe1～MbXe4：實驗確定肌紅蛋白Xe結合位點)Fig.3 O2binding sites and 6 major migration pathways in β chain of human hemoglobin(blue ball：O2 sites;line with arrow：migration trajectories of O2;pink belt：backbone of β chain of human hemoglobin;brown stick：heme;Xe1—Xe6：Xe binding sites determined by experiments;DP：distal path site determined by experiemnts;Ph1：instant cavities;MbXe1—MbXe4：Xe binding sites of myoglobin determined by experiments)

表4 CO在β鏈中遷移路徑的次數(shù)及概率Table 4 Frequency and probability of CO migration pathways in β chain

2.2 血紅蛋白結構變化與氣體遷移之間的關系

前述分析可知，氣體分子遷移進入血紅素結合位點時，人血紅蛋白由于柔性會產(chǎn)生瞬時空穴，即人血紅蛋白結構變化與氣體分子遷移存在一定的相關性。因此，在體系達到平衡之后，進一步分析了氣體遷移過程中人血紅蛋白結構的變化，結果如圖5和圖6所示（最后1 ns的統(tǒng)計數(shù)據(jù)）。

圖5(a)和(b)分別給出了氣體分子遷移過程中Rg和RMSD 變化。結果表明，相對于β 鏈，氣體在α 鏈中的擴散行為對蛋白結構的影響較大。圖5(c)和(d)分別給出了O2和CO 擴散過程中，人血紅蛋白α 鏈和β 鏈RMSF 變化。這里以0.3 nm 作為截斷判據(jù)，如果RMSF 值大于0.3 nm，則該氨基酸殘基及其周圍結構柔性較強，在遷移過程中會發(fā)生顯著變化。研究結果表明，氣體分子擴散過程中人血紅蛋白α鏈的波動明顯高于β 鏈，這與圖5(b)所示結果一致。除去蛋白前后端之外，可以看到位于近血紅素的氨基酸45，81，92(95)附近均有較大波動，其分別對應于α 鏈中的Ph1,Xe3,Ph5,Ph6 和β 鏈中的Xe3,Ph2,Ph3 位點，這些關鍵位點恰恰位于前述氣體遷移中的主要通道，即氣體分子遷移過程與人血紅蛋白關鍵氨基酸運動相關聯(lián)。

圖4 CO在血紅蛋白β鏈中的結合位點和六條主要遷移路徑(紅色球：CO位點;箭頭連線：CO遷移軌跡;粉色帶：血紅蛋白β鏈骨架;深棕色分子：血紅素;Xe1～Xe6：實驗確定Xe結合位點;DP：實驗確定近端位點;Ph1～Ph3：瞬時空穴;MbXe1～MbXe4：實驗確定肌紅蛋白Xe結合位點)Fig.4 CO binding sites and 6 major migration pathways in β chain of human hemoglobin(red ball：CO sites;line with arrow：migration trajectories of CO;pink belt：backbone of β chain of human hemoglobin;brown stick：heme;Xe1—Xe6：Xe binding sites determined by experiments;DP：distal path site determined by experiemnts;Ph1—Ph3：instant cavities;MbXe1—MbXe4：Xe binding sites of myoglobin determined by experiments)

圖5 四個模型蛋白迴轉(zhuǎn)半徑以及RMSD/RMSFFig.5 Gyration and RMSD/RMSF in four protein models

除此之外，α 鏈的氨基酸17和72附近的蛋白片段顯現(xiàn)出較為明顯的波動，其分別對應于α 鏈中的Ph3和MbXe3位點。這表明盡管在晶體結構中無法觀測到Ph3 瞬時空穴，但其所在的α 鏈氨基酸17 是氣體分子遷移主通路中的關鍵位點，這是分子動力學模擬的獨特發(fā)現(xiàn)。而MbXe3 位點是肌紅蛋白的O2主要結合位點，其柔性也較強，但是在人血紅蛋白中氣體分子卻很少在此占據(jù)，主要原因在于其并不處于氣體分子的擴散路徑上。值得一提的是，人血紅蛋白β 鏈的氨基酸17 波動非常小，但其處于Ph1 瞬時空穴，這源于β 鏈該氨基酸位點本身具備一定容納O2分子能力[26]，這也充分說明了氣體在人血紅蛋白中遷移的復雜性。

對比CO 和O2遷移過程中，人血紅蛋白α 鏈和β鏈的RMSF 可知，CO 對人血紅蛋白結構影響要高于O2，即CO 遷移過程中會造成人血紅蛋白結構的變化，這可能會進一步影響人血紅蛋白的載氧能力。

進而，分析了氣體遷移過程中人血紅蛋白二級結構的變化，結果如圖6所示。

圖6 蛋白二級結構變化Fig.6 Protein secondary structure changes

天然人血紅蛋白晶體結構由α螺旋和無規(guī)卷曲組成，而氣體遷移過程中則會造成α 螺旋含量的降低，無規(guī)卷曲含量的增加，甚至會出現(xiàn)少量β折疊結構，即遷移過程與人血紅蛋白結構變化相關聯(lián)，這與前面的結論一致?？傮w而言，相對于β鏈，遷移過程中氣體分子對α 鏈影響要更大一些。因此，用馬爾科夫狀態(tài)模型（Markov state model, MSM）進一步研究氣體遷移過程中人血白蛋白α 鏈結構變化，結果如圖7和圖8所示。

首先，利用PyEMMA 2.5.5建立馬爾科夫狀態(tài)模型，通過PCCA 聚類分析得到了不同平衡分布的亞穩(wěn)狀態(tài)。在O2擴散的過程中，血紅蛋白的結構顯現(xiàn)出4 種亞穩(wěn)態(tài)構象，結果如圖7 所示。需要說明的是，這里依據(jù)不同狀態(tài)中氣體分子和血紅素距離的遠近為依據(jù)，氣體和血紅素結合最少且距離最遠的狀態(tài)作為初始狀態(tài)，反之則作為終止狀態(tài)，對分出的亞穩(wěn)狀態(tài)進行路徑遷移理論分析，以95%為截斷，比例太小的路徑忽略不計。

結果表明，由于模擬過程中全部O2分子均進入α 鏈內(nèi)部，因此O2在血紅素附近的結合狀態(tài)占據(jù)的比例最大，其余狀態(tài)平衡時占據(jù)的比例較小。比較O2_MS1 與晶體結構可知，O2_MS1 狀態(tài)結構變化較大的區(qū)域是對應路徑1 的入口氨基酸（黑色虛線圓圈所示），此處α 鏈由α 螺旋變成了無規(guī)卷曲。該結構狀態(tài)直接轉(zhuǎn)換到O2_MS4 狀態(tài)的轉(zhuǎn)移概率最大，而該變化正好對應了路徑1（水溶液→Xe6→Ph3→Xe5→DP），成 為O2遷 移 的 主 要 路 徑。O2_MS1 結構也可轉(zhuǎn)換成O2_MS2 和O2_MS3，分別對應路徑6（水溶液→Ph1→Xe3→DP）中的Ph1 瞬時空穴結構和路徑4（水溶液→Ph5→Xe5→Xe4→DP）中的Ph5 瞬時空穴結構。相對于晶體結構，結合位點之間的縫隙均變窄，和血紅素之間的距離變小（黑色虛線圓圈所示），即O2分子與α 鏈特定氨基酸結合造成蛋白質(zhì)結構的變化，從而形成瞬時空穴以結合氣體分子。此時，在O2_MS2 狀態(tài)下路徑1 的入口氨基酸結構又由無規(guī)卷曲變回α 螺旋結構，說明氣體分子在蛋白質(zhì)內(nèi)部遷移過程中，蛋白質(zhì)結構始終處于動態(tài)變化狀態(tài)以實現(xiàn)氣體分子的定向輸運。相比于CO，O2經(jīng)由蛋白尾部附近Ph5 位點的路徑比例較大，故在O2_MS4 結構中尾部氨基酸波動較劇烈。

類似地，對CO 擴散過程進行分析，結果如圖8所示。由結果可知，血紅蛋白的結構顯現(xiàn)出5 種亞穩(wěn)態(tài)構象。由于模擬過程中CO 擴散到血紅素結合位點的數(shù)量相對O2較少（即血紅素與CO 結合要低于與O2的結合常數(shù)，這與文獻報道一致[40]），因此中間狀態(tài)CO_MS2 所占據(jù)的比例最大。比較CO_MS1與晶體結構可知，CO_MS1 狀態(tài)結構變化較大的區(qū)域是對應比例最大的路徑5 以及路徑1，3，6 的入口氨基酸（黑色虛線圓圈所示）。和O2不同，由于CO分子較多，在未結合狀態(tài)時多條通道被CO 分子占據(jù)，故CO_MS1 結構變化較劇烈。在CO_MS1 結構中，血紅素分子上方空間變窄，該變化正好對應了路徑5（水溶液→Ph1→Xe3→DP），成為CO 遷移的主要路徑。同時Ph5 位點也由α 螺旋變成了無規(guī)卷曲，對應于路徑3（水溶液→Ph5→Ph6→DP）。Ph4和Xe6 處的α 螺旋和鄰近螺旋距離變小，其對應于路徑6（水溶液→Ph4→Xe2→Xe4→DP）和路徑1（水溶液→Xe6→Ph3→Xe4→DP）。CO_MS1 結構也可轉(zhuǎn)換成CO_MS2，在CO_MS2 狀態(tài)處Ph4 位點由α 螺旋變成了無規(guī)卷曲（黑色虛線圓圈所示），其對應于路徑6結構變化的中間狀態(tài)。同時位于背后的兩條α 螺旋形成的空間變小，這在一定程度上可以阻止溶液中的CO 分子進入蛋白，起到關閉通路的作用。而CO_MS3 在CO_MS1 轉(zhuǎn)化到CO_MS4 的過程中起到連接作用，其結構變化基于兩者結構之間。和O2分子不同的是，在這個過程出現(xiàn)了獨立的CO_MS0狀態(tài)。CO_MS0 狀態(tài)的結構變化是對應于路徑最短的通道4，由圖8中CO_MS0結構變化可知，在通道4周圍的蛋白結構變?yōu)榱藷o規(guī)卷曲，這在之前的各種狀態(tài)中沒有出現(xiàn)過，且蛋白空腔變小，柔性增大，均有利于調(diào)節(jié)氣體分子進入蛋白。CO 可以通過該通道直接進入血紅素上方。這個通道對應的蛋白質(zhì)構象占據(jù)很大的比例，因此形成一個獨立的狀態(tài)。由前面的結論可知，CO 相對O2來說更傾向于直接由路程最短的通道和血紅素直接結合，因此形成了其特有的CO_MS0 狀態(tài)結構，進一步說明了不同種類的氣體分子直接影響人血紅蛋白的結構，進而影響其功能。

圖7 O2遷移過程中人血紅蛋白α鏈結構轉(zhuǎn)換路徑(灰色帶狀模型：人血紅蛋白α鏈晶體結構;O2_MS1(紅色)：初始狀態(tài)結構,即O2未結合態(tài);O2_MS2(黃色)和O2_MS3(粉色)：中間狀態(tài)結構,即遷移路徑關鍵結構;O2_MS4(橙色)：最終結合狀態(tài)結構;含箭頭連線：不同狀態(tài)遷移路徑,其粗細表明遷移概率;不同顏色圓：不同狀態(tài),其大小表明狀態(tài)出現(xiàn)概率;不同顏色帶狀模型：對應狀態(tài)人血紅蛋白α鏈結構;綠色球狀模型：血紅素分子)Fig.7 Tructural transition pathways of α chain of human hemoglobin during O2 migration processes(gray ribbon model：crystal structure of α chain of human hemoglobin;O2_MS1 in red：initial structure,i.e.,O2 unbinding state;O2_MS2 in yellow and O2_MS3 in pink：middle states,i.e.,key structures during O2 migration;O2_MS4 in orange：final O2 binding state;lines with arrow：transition pathways among different states,their thickness reflects transition probability;circles with different color：different states,their sizes reflect appearance probability;ribbon model with different color：corresponding structures of α chain of human hemoglobin;green ball model：heme molecule)

圖8 CO遷移過程中人血紅蛋白α鏈結構轉(zhuǎn)換路徑(灰色帶狀模型：人血紅蛋白α鏈晶體結構;CO_MS1(紅色)：初始狀態(tài)結構,即CO未結合態(tài);CO_MS2(黃色)和CO_MS3(粉色)：中間狀態(tài)結構,即遷移路徑關鍵結構;CO_MS0(紫色)：獨立狀態(tài)結構,即不參加轉(zhuǎn)換的結構;CO_MS4(橙色)：最終結合狀態(tài)結構;含箭頭連線：不同狀態(tài)遷移路徑,其粗細表明遷移概率;不同顏色圓：不同狀態(tài),其大小表明狀態(tài)出現(xiàn)概率;不同顏色帶狀模型：對應狀態(tài)人血紅蛋白α鏈結構;綠色球狀模型：血紅素分子)Fig.8 Structural transition pathways of α chain of human hemoglobin during CO migration processes(gray ribbon model：crystal structure of α chain of human hemoglobin;CO_MS1 in red：initial structure,i.e.,CO unbinding state;CO_MS2 in yellow and CO_MS3 in pink：middle states,i.e.,key structures during CO migration;CO_MS0 in purple：independent state,i.e.,a structure not in transition network;CO_MS4 in orange：final CO binding state;lines with arrow：transition pathways among different states,their thickness reflects transition probability;circles with different color：different states,their sizes reflect appearance probability;ribbon model with different color：corresponding structures of α chain of human hemoglobin;green ball model：heme molecule)

綜上可知，CO 在人血紅蛋白遷移過程中，不僅僅選取與O2相同的遷移途徑，而且也有獨特的“便捷通道”，同時造成人血紅蛋白結構的更大變化，這就是CO 造成人血紅蛋白載氧能力喪失的重要原因。

3 結 論

本文采用分子動力學模擬結合馬爾科夫狀態(tài)模型的方法對O2和CO 從溶劑外部進入人血紅蛋白內(nèi)部結合位點的遷移過程進行了研究，分別得出了兩種氣體在人血紅蛋白的α 鏈以及β 鏈中的主要結合/停留位點和主要遷移通道，以及遷移過程中蛋白結構的變化。人血紅蛋白α 鏈中存在12 個O2結合位點以及6 條主要遷移通道，其中由Xe6 作為大門的通道1 是主要的進入通道。而CO 的結合位點有13 個，相比O2來說多了一個Ph6 位點，其主要的遷移通道也有6個，但是路徑較短的通道4和5是其主要的進入通道。β 鏈中存在8 個O2停留位點以及6條主要通道，由Xe5 作為入口的通道3 是O2的主要通道。CO 的停留位點有10 個，相比O2來說增加了血紅素附近的Ph2 以及Ph3 位點，其遷移通道也存在6 條，主要由路徑較短的通道6 進入蛋白內(nèi)部。在α 鏈以及β 鏈中，O2主要都是由內(nèi)部空腔組成的通道進行遷移，CO 則主要經(jīng)由路徑較短的通道進入。而β 鏈相對于α 鏈來說，沒有發(fā)現(xiàn)由Xe3 直接進行遷移的通道存在。除了蛋白前后端，四種蛋白模型在血紅素附近的氨基酸都波動較大，主要是受氣體遷移的影響，特別的對于α 鏈還存在兩個波動大的蛋白區(qū)域。由馬爾科夫狀態(tài)模型分析得出蛋白結構變化的詳細轉(zhuǎn)移圖，可知為了實現(xiàn)氣體分子的定向輸運，蛋白質(zhì)結構始終處于動態(tài)的變化狀態(tài)。本文嘗試對R 態(tài)下O2和CO 進入人血紅蛋白遷移過程的模擬研究，對血液替代品的分子設計有重要的基礎研究價值，在原子水平上加深對氣體分子在人血紅蛋白中遷移動力學過程的理解。在未來工作中，可以更進一步指認各個關鍵蛋白區(qū)域調(diào)控氣體分子遷移的關鍵氨基酸及其結構，通過飽和突變和理性設計等方式篩選和設計載氧能力更強的人工血液替代品。