高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練通過(guò)支配內(nèi)臟脂肪的交感神經(jīng)活動(dòng)促進(jìn)白色脂肪組織棕色化

劉 陽(yáng) ，張 賽 ，董高芳 ，趙曉博 ，何玉秀 ，張海峰 *

肥胖是現(xiàn)代人健康的主要威脅之一。體內(nèi)約80%的甘油三酯儲(chǔ)存于皮下脂肪組織，僅有約20%儲(chǔ)存于內(nèi)臟脂肪組織，但內(nèi)臟脂肪堆積是心血管及代謝類疾病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（Shafqat et al.，2018）。運(yùn)動(dòng)是減肥的有效方法之一，高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（high intensity interval training，HIIT）與傳統(tǒng)的中等強(qiáng)度持續(xù)訓(xùn)練（moderate intensity continuous training，MICT）相比，減體重效果相同，但能明顯節(jié)省時(shí)間（Zhang et al.，2017）。HIIT的另一優(yōu)勢(shì)是可減少更多內(nèi)臟脂肪（Maillard et al.，2018）。HIIT減少內(nèi)臟脂肪的機(jī)制與內(nèi)臟脂肪對(duì)促脂解類激素的敏感性更高有關(guān)（Maillard et al.，2016）。前期研究發(fā)現(xiàn)，HIIT可通過(guò)激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）的激活，促進(jìn)更多內(nèi)臟脂肪甘油三酯水解（劉陽(yáng)等，2018）。但甘油三酯被HSL水解后產(chǎn)生的游離脂肪酸（free fat acid，F(xiàn)FA）如何進(jìn)一步分解氧化，即HIIT較MICT是否能消耗更多內(nèi)臟脂肪水解釋放的FFA，尚待深入研究。

脂肪組織包括白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）與棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）兩類。WAT的主要功能是儲(chǔ)存甘油三酯，BAT則是機(jī)體重要的非顫栗產(chǎn)熱器官，其線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白1（Uncoupling Protein-1，UCP-1）可抑制ATP的合成，使FFA以熱能的形式消耗來(lái)調(diào)節(jié)體溫。普通情況下，WAT的線粒體濃度和 UCP-1表達(dá)遠(yuǎn)低于 BAT（Orava et al.，2011），但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)WAT中會(huì)分化出一些UCP-1高表達(dá)的脂肪細(xì)胞，被認(rèn)為是WAT“棕色化”（Browning）后向BAT過(guò)渡的中間型（Wu et al.，2012），將命名為米色脂肪細(xì)胞（Beige Adipocyte）。WAT在寒冷、饑餓或運(yùn)動(dòng)刺激后，會(huì)出現(xiàn)UCP-1表達(dá)增加的棕色化現(xiàn)象，可脂肪細(xì)胞內(nèi)部直接消耗FFA，所以WAT棕色化被認(rèn)為是一條較有潛力的減肥途徑（Jeremic et al.，2016）。

WAT棕色化的標(biāo)志是UCP-1表達(dá)升高，細(xì)胞內(nèi)外的多個(gè)復(fù)雜信號(hào)共同調(diào)控了此過(guò)程（Jeremic et al.，2016）。有研究認(rèn)為，支配脂肪組織的交感神經(jīng)纖維，通過(guò)突觸向脂肪細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素，是刺激WAT棕色化的主要途徑（Nedergaard et al.，2014）。但 Bostr?m 等2012年發(fā)表在Nature的研究顯示，運(yùn)動(dòng)激活骨骼肌過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α）后，可誘導(dǎo)肌細(xì)胞合成纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域蛋 白 5（fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，F(xiàn)NDC5），F(xiàn)NDC5經(jīng)剪切生成鳶尾素（irisin）并分泌入血，運(yùn)輸至WAT后可顯著提高UCP-1表達(dá)（Bostr?m et al.，2013）。由于骨骼肌與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系極為密切，肌肉因子Irisin因促進(jìn)WAT棕色化成為近年來(lái)運(yùn)動(dòng)減肥的研究熱點(diǎn)。

研究顯示，急性HIIT訓(xùn)練比MICT更顯著激活骨骼肌FNDC5/Irisin（Archundia et al.，2017），說(shuō)明 HIIT 有通過(guò)肌肉因子分泌途徑促進(jìn)更多WAT棕色化的潛力。然而，在HIIT促進(jìn)WAT棕色化的過(guò)程中，交感神經(jīng)活動(dòng)與肌肉Irisin分泌這2條途徑的作用重要性，尚未有研究進(jìn)行比較。本研究的第一部分，對(duì)高糖高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖C57BL/6小鼠進(jìn)行12周的HIIT與MICT訓(xùn)練，比較兩者對(duì)體重、內(nèi)臟與皮下脂肪墊重量、脂肪細(xì)胞形態(tài)及WAT棕色化的影響，從脂肪細(xì)胞自身產(chǎn)熱消耗FFA的角度，研究HIIT減少更多內(nèi)臟脂肪的機(jī)制。同時(shí)觀察了促進(jìn)UCP-1表達(dá)的2條上游信號(hào)：代表交感神經(jīng)活動(dòng)的下丘腦阿片促黑素皮質(zhì)素原（proopiomelanocortin，POMC）與脂肪交感神經(jīng)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH），以及代表Irisin分泌的骨骼肌PGC-1α與FNDC5，對(duì)比HIIT是否通過(guò)交感神經(jīng)活動(dòng)亦或肌肉因子分泌途徑促進(jìn)了WAT棕色化。分析研究一的數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，TH與內(nèi)臟WAT的UCP-1表達(dá)呈顯著相關(guān)，故研究通過(guò)特異性的拮抗劑SR59230a，抑制內(nèi)臟WAT接受交感神經(jīng)調(diào)控的β3腎上腺素能，驗(yàn)證并確定HIIT可通過(guò)支配內(nèi)臟脂肪的交感神經(jīng)促進(jìn)WAT棕色化。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究一：MICT與HIIT促進(jìn)不同部位脂肪棕色化的效果及上游調(diào)控通路的對(duì)比

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與肥胖模型建立

由于本團(tuán)隊(duì)以往關(guān)于HIIT減肥效果的研究均選取肥胖女性青年群體作為研究對(duì)象，同時(shí)根據(jù)Maillard等（2018）的研究，性別差異不會(huì)對(duì)HIIT減肥效果造成影響，為與人體研究保持一致，本實(shí)驗(yàn)采用雌性c57bl/6小鼠作為研究對(duì)象。首先對(duì)小鼠進(jìn)行高糖高脂膳食飼養(yǎng)，建立肥胖動(dòng)物模型：3周齡小鼠（體重9.67±1.12g，北京維通利華）隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)膳食對(duì)照組C（n=6只）和高糖高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖建模組（高糖高脂飼料包含60%標(biāo)準(zhǔn)飼料＋16%白砂糖＋5%豬油＋18%蛋黃粉＋1%膽酸鈉）。飼養(yǎng)15周后，選取肥胖建模組（體重超過(guò)C組10%以上）小鼠18只，進(jìn)一步隨機(jī)分為高糖高脂膳食肥胖對(duì)照組（HFD）、中等強(qiáng)度持續(xù)訓(xùn)練組（MICT）以及高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練組（HIIT），每組各6只。在飼養(yǎng)與訓(xùn)練過(guò)程中，室溫始終保持20℃～22℃。

1.1.2 訓(xùn)練方案

肥胖動(dòng)物模型建立后，給予MICT與HIIT組小鼠12周25°上坡跑訓(xùn)練，HFD作為對(duì)照組不進(jìn)行訓(xùn)練，3組在訓(xùn)練期間均保持高糖高脂飼養(yǎng)。MICT組單次運(yùn)動(dòng)的跑速恒定，第1周跑速13 m/min，并在5周后逐步增加至17 m/min。HIIT組進(jìn)行“高強(qiáng)度1 min，低強(qiáng)度2 min”為一循環(huán)的間歇訓(xùn)練，間歇期的中強(qiáng)度跑速與MICT相同，高強(qiáng)度跑速由第1周的23 m/min逐步遞增至12周的30 m/min。以上運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度參考了H?ydal等（2007）的研究確定：MICT組強(qiáng)度始終保持在50%～70%最大攝氧量，HIIT組高強(qiáng)度約90%～110%最大攝氧量。MICT組一次訓(xùn)練時(shí)間45 min，HIIT組小鼠在奔跑距離達(dá)到MICT組水平后，停止該次訓(xùn)練。由于跑速更高，HIIT組完成一次訓(xùn)練的時(shí)間在25 min左右，遠(yuǎn)低于MICT組（劉陽(yáng) 等，2018）。

1.1.3 動(dòng)物取材

12周訓(xùn)練結(jié)束48 h后取材，取材前禁食12 h。腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉，生理鹽水動(dòng)脈灌流后，剝離完整的子宮周圍脂肪墊（代表內(nèi)臟脂肪）和腹股溝皮下脂肪墊（代表皮下脂肪）稱重，剝離腓腸肌并剔除結(jié)締組織后取肌腹部分。Western blot測(cè)試所需組織在-80℃凍存，H.E.染色所需組織以4%多聚甲醛固定。

1.1.4 脂肪組織H.E.染色

組織從固定液取出，修平，梯度酒精脫水，二甲苯透明處理，浸石蠟包埋。5 μm切片，修整后38℃鋪片機(jī)展片，60℃烘箱烤片。切片梯度酒精復(fù)水后，蘇木精染色5 min，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，伊紅染色2 min，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

1.1.5 骨骼肌PGC-1α、FNDC5、脂肪TH、UCP1蛋白表達(dá)

使用Western blot法對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)試。樣品使用RIPA裂解30 min（骨骼肌與裂解液1：10，脂肪與裂解液1：5），離心取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度后煮沸5 min。加入Sample buffer后以每孔20 μl上樣。采用4%濃縮膠，10%分離膠電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜（一抗?jié)舛萈GC-1α與FNDC5為1：2 000，UCP-1為1：1 000，TH為1：10 000，一抗均購(gòu)于Abcam）。TBST洗5次后二抗孵育2 h，TBST洗3次后發(fā)光。骨骼肌內(nèi)參選用Tubulin，脂肪選用β-actin。Image J 1.51計(jì)算灰度值，用“目的蛋白/內(nèi)參”計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.2 研究二：HIIT通過(guò)交感神經(jīng)途徑促進(jìn)內(nèi)臟脂肪棕色化的機(jī)制驗(yàn)證

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與干預(yù)

經(jīng)研究一的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪FNDC5與交感神經(jīng)活動(dòng)標(biāo)志物TH存在顯著相關(guān)性，故通過(guò)對(duì)脂肪交感神經(jīng)受體的特異性抑制，來(lái)驗(yàn)證交感神經(jīng)活動(dòng)促進(jìn)內(nèi)臟脂肪棕色化的效果。12只雌性c57bl/6小鼠隨機(jī)分為安慰劑組（Saline組，n=6）與脂肪交感神經(jīng)受體抑制組（SR組，n=6）。兩組均進(jìn)行10天HIIT訓(xùn)練，訓(xùn)練方法同研究一。在每次訓(xùn)練前2 h，SR組腹腔注射β3腎上腺素能受體拮抗劑 SR59230a（ 購(gòu)于Sigma，劑量為1 mg/kg，Sipe et al.，2017）。由于交感神經(jīng)對(duì)脂肪組織的調(diào)控主要是通過(guò)軸突末梢分泌的去甲腎上腺素作用于脂肪細(xì)胞的β3腎上腺素能受體實(shí)現(xiàn)的（Bartness et al.，2014），故SR組在進(jìn)行HIIT訓(xùn)練時(shí)，內(nèi)臟脂肪的交感神經(jīng)調(diào)控已經(jīng)被阻斷。10天HIIT訓(xùn)練結(jié)束后，取Saline組與SR組小鼠內(nèi)臟脂肪，測(cè)試UCP-1表達(dá)水平。需指出的是，研究一的數(shù)據(jù)顯示，僅有內(nèi)臟脂肪UCP-1表達(dá)與TH呈顯著相關(guān)，同時(shí)無(wú)法確定本研究二中所采用的化學(xué)抑制方法是否能對(duì)腹股溝皮下WAT的交感神經(jīng)作用產(chǎn)生抑制［腹股溝皮下脂肪交感神經(jīng)的抑制，應(yīng)采用腹股溝皮下注射抑制來(lái)實(shí)現(xiàn)（Dodd et al.，2015）］，故研究二僅對(duì)內(nèi)臟脂肪UCP-1表達(dá)進(jìn)行測(cè)試。由于c57bl/6小鼠的動(dòng)情周期僅4～5天（Byers et al.，2012），10天內(nèi)雌性小鼠經(jīng)歷2個(gè)完整周期，同時(shí)性激素的變化不會(huì)對(duì)白色脂肪棕色化產(chǎn)生明顯影響（Dixen et al.，2013），所以小鼠動(dòng)情周期的個(gè)體差異不會(huì)對(duì)研究二的結(jié)果產(chǎn)生明顯影響。

1.2.2 內(nèi)臟脂肪UCP-1表達(dá)

采用Western blot法測(cè)試小鼠子宮周圍內(nèi)臟UCP-1表達(dá)，具體方法同研究一。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究一在建模階段使用單因素方差分析計(jì)算對(duì)照組C與肥胖建模組的體重差異。在訓(xùn)練干預(yù)階段，將攝食量作為協(xié)變量使用協(xié)方差分析比較小鼠體重及脂肪重量差異，以消除攝食量對(duì)以上指標(biāo)的影響。使用單因素方差分析比較蛋白表達(dá)差異。Pearson法分析UCP-1與TH、FNDC5的相關(guān)性，雙尾檢測(cè)顯著性，R≥0.8為高度相關(guān)，0.8＞R＞0.3為中度相關(guān)，R≤0.3為低度相關(guān)。研究二使用單因素方法分析比較體重、脂肪重量與蛋白表達(dá)的差異。以上顯著性均取P＜0.05為顯著，P＜0.01為非常顯著。數(shù)據(jù)使用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 研究一：MICT與HIIT促進(jìn)不同部位脂肪棕色化的效果及上游調(diào)控通路的對(duì)比

2.1.1 HIIT與MICT對(duì)體重、子宮周圍與腹股溝皮下脂肪重量的影響

在建模階段的第4～15周，肥胖建模組小鼠的體重顯著高于C組（P＜0.05或P＜0.01）。運(yùn)動(dòng)干預(yù)期間，HIIT組與MICT組小鼠體重均顯著低于HFD組（P＜0.05或P＜0.01），HIIT組與MICT組無(wú)顯著差異。在12周干預(yù)結(jié)束后，代表內(nèi)臟脂肪的子宮周圍脂肪墊重量，HIIT組非常顯著低于MICT組和HFD組（P＜0.01），代表皮下脂肪的腹股溝脂肪墊重量，HIIT組非常顯著低于HFD組（P＜0.01），但HIIT組與MICT組間無(wú)顯著差異（圖1）。

圖1 研究一中各組小鼠體重變化及運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后不同部位脂肪重量Figure 1. Body Mass of Mice during Exercise Intervention and Fat Weight at the End of Exercise Intervention

2.1.2 HIIT組與MICT組對(duì)脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響

MICT組、HIIT組經(jīng)12周訓(xùn)練，脂肪細(xì)胞的體積較HFD組均明顯縮?。▓D2），切片單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量（由細(xì)胞核數(shù)量代表）較HFD組明顯增加。同時(shí)可見，HIIT組內(nèi)臟脂肪細(xì)胞體積小于MICT組，單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量高于MICT組（圖2B、2C）。

2.1.3 HIIT與MICT對(duì)脂肪組織棕色化標(biāo)志物UCP1表達(dá)的影響

HIIT組子宮周圍內(nèi)臟脂肪UCP-1顯著高于MICT組及HFD組（P＜0.05）；MICT組與HIIT組的腹股溝皮下脂肪UCP-1表達(dá)較HFD組有升高的趨勢(shì)但無(wú)顯著性（圖3）。

2.1.4 HIIT與MICT對(duì)腓腸肌PGC-1α、FNDC5蛋白表達(dá)的影響

HIIT組PGC-1α顯著高于HFD組（P＜0.05），與MICT組無(wú)差異；MICT組FNDC5表達(dá)有高于HIIT組與HFD組的趨勢(shì)，但由于標(biāo)準(zhǔn)差較大，無(wú)顯著差異（圖4）。

2.1.5 HIIT與MICT對(duì)脂肪組織交感神經(jīng)標(biāo)志物TH表達(dá)的影響

圖2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)后子宮周圍與腹股溝脂肪細(xì)胞H.E.染色Figure 2. H.E.Staining of Peri-uterine and InguinalAdipocytes after Exercise Intervention

HFD組與HIIT組子宮周圍內(nèi)臟脂肪顯著高于MICT組（P＜0.05與P＜0.01），HIIT組腹股溝皮下脂肪顯著高于HFD組與MICT組（P＜0.05與P＜0.01）（圖5）。

圖3 子宮周圍與腹股溝脂肪UCP-1表達(dá)Figure 3. UCP-1 Expression of Peri-uterine and Inguinal Fat

圖4 腓腸肌PGC-1α與FNDC5表達(dá)Figure 4. PGC-1α and FNDC5 Expression of Gastrocnemius

圖5 子宮周圍與腹股溝脂肪TH表達(dá)Figure 5. TH Expression of Peri-uterine and Inguinal Fat

2.1.6 棕色化標(biāo)志物UCP-1表達(dá)與交感神經(jīng)標(biāo)志物TH、肌肉因子標(biāo)志物FNDC5表達(dá)間的相關(guān)性分析

對(duì)內(nèi)臟與皮下脂肪UCP-1分別與TH、FNDC5進(jìn)行相關(guān)分析顯示，內(nèi)臟脂肪UCP-1表達(dá)與內(nèi)臟脂肪TH間呈中度相關(guān)（R=0.578，P＜0.05），皮下脂肪 UCP-1與骨骼肌FNDC5呈中度相關(guān)，但不具顯著性（R=0.340，P＞0.05）。其余指標(biāo)間呈低度相關(guān)且不具顯著性（P＞0.05，圖6）。

2.2 研究二：HIIT通過(guò)交感神經(jīng)途徑促進(jìn)內(nèi)臟脂肪棕色化的機(jī)制驗(yàn)證

SR組在注射β3型腎上腺素能受體拮抗劑SR59230a，阻斷了交感神經(jīng)對(duì)脂肪組織的調(diào)節(jié)途徑后，進(jìn)行10天HIIT訓(xùn)練，SR組小鼠體重有大于Saline組的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性（P＞0.05）；內(nèi)臟脂肪重量SR組有大于Saline組的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性（P＞0.05）；SR組內(nèi)臟脂肪UCP-1表達(dá)顯著低于Saline組（P＜0.05，圖7）。

3 討論

3.1 MICT與HIIT的降體重效果相同，但HIIT能減少更多內(nèi)臟脂肪積累

在經(jīng)典的能量代謝理論中，單位時(shí)間脂肪消耗絕對(duì)值最高的方式是中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)，所以傳統(tǒng)觀點(diǎn)一直認(rèn)為MICT是最佳的減肥運(yùn)動(dòng)方式。然而MICT必須達(dá)到較長(zhǎng)的運(yùn)動(dòng)時(shí)間才能獲得明顯的減重效果（Nielsen et al.，2011），而缺乏時(shí)間恰恰是妨礙現(xiàn)代人運(yùn)動(dòng)參與的一個(gè)重要因素（Trost et al.，2002），所以HIIT最初被用于運(yùn)動(dòng)減肥的目的是節(jié)省運(yùn)動(dòng)時(shí)間。對(duì)18～45歲超重或肥胖人群運(yùn)動(dòng)減肥的Meta分析顯示，HIIT與MICT減輕體重的效果相同，但HIIT能節(jié)省40%以上的時(shí)間（Wewege et al.，2017）。隨著HIIT研究的深入，多個(gè)系統(tǒng)綜述與Meta分析也顯示，HIIT相比MICT能使機(jī)體在心臟、血管、血壓、血糖等方面獲得更多健康益處（Batacan et al.，2017；Milanovi? et al.，2015；Ramos et al.，2015）。在相同運(yùn)動(dòng)量下，HIIT比MICT可以減少更多內(nèi)臟脂肪（Maillard et al.，2018；Zhang et al.，2015），由于內(nèi)臟脂肪堆積是代謝疾病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，此發(fā)現(xiàn)可以證明HIIT對(duì)改善代謝類疾病的作用。

本研究中，在奔跑距離相等的條件下，12周MICT與HIIT訓(xùn)練都可以顯著抑制高糖高脂膳食引起的體重增長(zhǎng)。由于跑速不同，HIIT的運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯少于MICT，但HIIT組體重與MICT組無(wú)顯著差異，說(shuō)明HIIT在達(dá)到相同的減重效果時(shí)，確實(shí)能夠節(jié)省時(shí)間。12周運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，HIIT組小鼠子宮周圍脂肪墊重量顯著低于MICT組，腹股溝皮下脂肪較MICT有輕微降低的趨勢(shì)，但不具顯著性。此結(jié)果與以往的研究相符，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)量相同的情況下HIIT能夠減少更多內(nèi)臟脂肪。

3.2 HIIT相比MICT能夠促進(jìn)更多內(nèi)臟WAT棕色化

脂肪組織的棕色化可以使以儲(chǔ)存能量為主要功能的WAT具備一定的非顫栗性產(chǎn)熱能力，從而能夠消耗更多FFA。自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，WAT棕色化一直被認(rèn)為是治療肥胖、糖尿病等代謝疾病的關(guān)鍵途徑（Festuccia et al.，2017）。Bartesaghi等（2014）借助基因敲除發(fā)現(xiàn)，人體米色脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱能力完全取決于UCP-1表達(dá)，所以可使用UCP-1表達(dá)量來(lái)反映WAT棕色化的程度。寒冷刺激可促使脂肪組織UCP-1表達(dá)大幅提高（Jeremic et al.，2016），值得注意的是，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)脂肪組織UCP-1表達(dá)的改變不像寒冷刺激那樣劇烈。Bostr?m等（2013）的研究在RNA轉(zhuǎn)錄層面上證明了中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以劇烈增加內(nèi)臟與皮下脂肪組織UCP-1 mRNA，但在蛋白表達(dá)層面上，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的UCP-1升高并不顯著。徐瑞等（2017）的研究顯示，給予大鼠一次運(yùn)動(dòng)刺激，中等強(qiáng)度訓(xùn)練不能改變運(yùn)動(dòng)后6 h內(nèi)內(nèi)臟脂肪組織UCP-1表達(dá)，HIIT能提高運(yùn)動(dòng)后即刻UCP-1表達(dá)，但在運(yùn)動(dòng)后6 h即回落至安靜水平，長(zhǎng)期HIIT的作用尚未可知。Norheim等（2014）的人體研究顯示，長(zhǎng)期進(jìn)行MICT雖有提升健康人和糖尿病風(fēng)險(xiǎn)人群皮下脂肪UCP-1 mRNA的趨勢(shì)，但只有將健康組與風(fēng)險(xiǎn)組數(shù)據(jù)合并，UCP-1 mRNA的升高才具有顯著性，且升幅不大，說(shuō)明MICT促皮下脂肪棕色化的作用有限。

圖6 UCP-1與FNDC5及TH的相關(guān)性分析Figure 6. CorrelationAnalysis among UCP-1 and FNDC5 and TH

圖7 Saline組與SR組在10天HIIT訓(xùn)練后體重、脂肪重量及內(nèi)臟脂肪UCP-1表達(dá)Figure 7. Body Mass，F(xiàn)at Weight and Visceral Fat UCP-1 Expression in the Saline and SR Groups after 10-day HIIT

本研究發(fā)現(xiàn)，HIIT組內(nèi)臟脂肪組織UCP-1顯著增加，MICT組無(wú)增加。MICT組和HIIT組皮下脂肪UCP-1雖有增加趨勢(shì)，但不具顯著性。此結(jié)果與Norheim的研究相近，說(shuō)明MICT與HIIT促皮下脂肪組織棕色化的作用不明顯，但HIIT有顯著的促內(nèi)臟脂肪棕色化的作用。再者，研究驗(yàn)證了HIIT相比MICT確實(shí)能夠減少更多內(nèi)臟脂肪，提示HIIT減少內(nèi)臟脂肪的機(jī)制與內(nèi)臟脂肪組織棕色化關(guān)系密切。

3.3 長(zhǎng)期HIIT引起的脂肪組織棕色化現(xiàn)象與FNDC5/Irisin信號(hào)無(wú)顯著相關(guān)

2013年首次報(bào)導(dǎo)的Irisin被認(rèn)為是一個(gè)非常有希望改善肥胖及相關(guān)代謝疾病的肌肉因子。然而此后幾年內(nèi)，大量關(guān)于運(yùn)動(dòng)是否能夠提高血液Irisin濃度的研究結(jié)果卻相當(dāng)模糊且相互矛盾（Dinas et al.，2017）。由于血液Irisin濃度測(cè)試主要基于商業(yè)Elisa試劑盒，Albrecht等對(duì)市售的4種主流試劑盒進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)它們均會(huì)與非特異性蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)。此外，人血漿中較低濃度的Irisin能被串聯(lián)質(zhì)譜法檢出時(shí)，此4種試劑盒卻無(wú)法測(cè)出（Albrecht et al.，2015）。Archundia等（2017）分別使用 Western blot與Elisa對(duì)肌肉和血液內(nèi)的Irisin進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)雖然能顯著增加肌肉Irisin（WB測(cè)試結(jié)果），但血液Irisin并無(wú)變化（Elisa測(cè)試結(jié)果）。由于上述研究均質(zhì)疑了Elisa方法對(duì)血液Irisin檢測(cè)的靈敏性，目前國(guó)際上僅對(duì)使用串聯(lián)質(zhì)譜檢法測(cè)血液Irisin濃度的結(jié)果較為認(rèn)可。但鑒于難度與成本，研究者大多改用Western blot測(cè)試的肌肉FNDC5含量來(lái)間接反映Irisin的分泌量。

本研究同樣采用肌肉FNDC5及其上游信號(hào)PGC-1α作為運(yùn)動(dòng)促進(jìn)Irisin分泌的代表指標(biāo)。與Granata等（2015）的研究相近，HIIT相比MICT能夠更顯著的激活PGC-1α，這說(shuō)明PGC-1α可能與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度存在關(guān)聯(lián)。當(dāng)然也有某些研究發(fā)現(xiàn)HIIT與MICT對(duì)PGC-1α的激活無(wú)差異（Shirvani et al.，2018），這可能與不同的物種、訓(xùn)練方法或其他條件有關(guān)。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)中FNDC5的變化并不與PGC-1α同步：HIIT組PGC-1α雖然顯著升高，但MICT組的FNDC5卻具有升高的趨勢(shì)，而HIIT組無(wú)變化（圖4A，4B）。同時(shí)，MICT組內(nèi)FNDC5個(gè)體差異很大（圖4B，MICT組標(biāo)準(zhǔn)差較大），這說(shuō)明MICT僅對(duì)組內(nèi)某些個(gè)體的FNDC5表達(dá)有顯著的激活作用。Bonafiglia等（2016）的研究與本研究結(jié)果相符，他認(rèn)為“個(gè)體差異”是影響運(yùn)動(dòng)激活I(lǐng)risin信號(hào)的重要因素。Dinas在2017年的系統(tǒng)綜述中，檢索到了16項(xiàng)關(guān)于運(yùn)動(dòng)激活PGC-1α、FNDC5與Irisin的研究，但其中僅有4項(xiàng)研究顯示運(yùn)動(dòng)能使PGC-1α與FNDC5同步升高；45項(xiàng)對(duì)血液Irisin濃度的研究中，僅有22項(xiàng)顯示運(yùn)動(dòng)后Irisin濃度上升（Dinas et al.，2017）。Pekkala等（2013）發(fā)現(xiàn)，Irisin僅在急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后顯著增加，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)后并無(wú)變化。Archundia等（2017）認(rèn)為，F(xiàn)NDC5與Irisin的激活，不僅依賴與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相關(guān)的PGC-1α信號(hào)，更多的是與個(gè)體差異、機(jī)體對(duì)急性運(yùn)動(dòng)的不適應(yīng)有關(guān)。綜上，Irisin信號(hào)的激活并不完全與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相關(guān)，本研究采用的12周長(zhǎng)期HIIT訓(xùn)練并不能激活FNDC5表達(dá)。12周長(zhǎng)期MICT訓(xùn)練雖然能使一些個(gè)體出現(xiàn)FNDC5顯著升高的現(xiàn)象，但整體不具顯著性，關(guān)于MICT是否能夠顯著激活FNDC5/Irisin信號(hào)，其激活作用對(duì)何種個(gè)體更明顯，還需后續(xù)的深入研究闡明。本研究同時(shí)也對(duì)FNDC5與UCP-1表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)論內(nèi)臟或皮下脂肪均無(wú)顯著相關(guān)（圖6C，6D），提示本研究中HIIT促小鼠內(nèi)臟脂肪棕色化與骨骼肌分泌的FNDC5/Irisin信號(hào)無(wú)關(guān)。

3.4 HIIT通過(guò)交感神經(jīng)途徑促進(jìn)內(nèi)臟WAT棕色化

交感神經(jīng)活動(dòng)在機(jī)體調(diào)控脂肪分解的過(guò)程中占據(jù)核心地位（Braun et al.，2018），交感神經(jīng)節(jié)后纖維直接支配皮下、腹腔及胸部脂肪墊，并通過(guò)突觸分泌的去甲腎上腺素，促進(jìn)脂肪分解（Vaughan et al.，2014）。Hillebrand等（2014）對(duì)868名成年人的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，人體的脂肪重量，特別是內(nèi)臟脂肪重量，與交感神活動(dòng)的高低有關(guān)。Sipe等（2017）發(fā)現(xiàn)，食物熱量攝入限制導(dǎo)致的小鼠脂肪重量減輕，伴隨著交感神經(jīng)活動(dòng)的增強(qiáng)，同時(shí)，交感神經(jīng)會(huì)優(yōu)先動(dòng)員內(nèi)臟脂肪墊分解。這些研究提示，HIIT更顯著減少內(nèi)臟脂肪的作用也可能是通過(guò)支配脂肪的交感神經(jīng)實(shí)現(xiàn)的。下丘腦調(diào)節(jié)機(jī)體的攝食、飲水、性行為、打斗、體溫等生理機(jī)能，同時(shí)也是交感與副交感神經(jīng)的最高位中樞。生理學(xué)者在多年前就已知道下丘腦通過(guò)交感神經(jīng)活動(dòng)直接調(diào)節(jié)BAT產(chǎn)熱（Morrison et al.，2014）。在WAT能夠棕色化生成米色脂肪的現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)后，Dodd等（2015）發(fā)表在Cell上的研究直接證明了下丘腦POMC神經(jīng)元可通過(guò)交感神經(jīng)活動(dòng)直接促進(jìn)米色脂肪的增加，在理論上證實(shí)了“下丘腦-脂肪交感神經(jīng)”軸對(duì)WAT棕色化具有明顯的作用效果。

TH是合成兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)鍵限速酶，僅在中樞與周圍神經(jīng)系統(tǒng)及腎上腺髓質(zhì)內(nèi)表達(dá)。由于交感神經(jīng)末梢的神經(jīng)遞質(zhì)主要是去甲腎上腺素，所以TH一直被當(dāng)作交感神經(jīng)外周組織調(diào)控的活性標(biāo)志物。TH的短期調(diào)節(jié)通過(guò)絲氨酸位點(diǎn)磷酸化實(shí)現(xiàn)，而長(zhǎng)期調(diào)節(jié)則在轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)層面上完成（Nagatsu，2007）。由于本研究的訓(xùn)練方案為12周長(zhǎng)期干預(yù)，故選取TH表達(dá)代表交感神經(jīng)調(diào)控脂肪組織分解的活動(dòng)程度。無(wú)論內(nèi)臟或皮下脂肪，HIIT組TH表達(dá)均高于MICT，說(shuō)明HIIT組的脂肪交感神經(jīng)活動(dòng)相比MICT更加劇烈。需要注意的是，HFD組雖無(wú)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，但內(nèi)臟脂肪TH表達(dá)相比MICT組也顯著升高，推測(cè)存在2種可能：1）由于飼養(yǎng)與訓(xùn)練溫度控制在20℃～22℃，而小鼠的體溫調(diào)節(jié)功能較差，此溫度激活了HFD小鼠的脂肪交感神經(jīng)活動(dòng)。Cui等（2016）的研究有類似的發(fā)現(xiàn)，同樣的高脂膳食飼養(yǎng)小鼠，22℃飼養(yǎng)個(gè)體的脂肪TH表達(dá)顯著高于30℃飼養(yǎng)的個(gè)體。2）由于MICT改善了小鼠體質(zhì)，MICT小鼠的體溫調(diào)節(jié)相對(duì)HFD小鼠更強(qiáng)，對(duì)脂肪非顫栗性產(chǎn)熱的依賴較少，所以脂肪交感神經(jīng)活動(dòng)降低。雖然HIIT同樣能夠改善小鼠體質(zhì)，但由于其對(duì)植物神經(jīng)的刺激遠(yuǎn)大于MICT，所以脂肪TH表達(dá)依然較高。由于本研究未對(duì)參與體溫調(diào)節(jié)的其他組織器官進(jìn)行觀察，故推論二還需更多實(shí)驗(yàn)證據(jù)驗(yàn)證。

對(duì)UCP-1與TH表達(dá)的相關(guān)分析顯示，皮下脂肪內(nèi)兩者不具顯著相關(guān)，但內(nèi)臟脂肪UCP-1與TH呈中度相關(guān)（圖6A，R=0.578，P＜0.05），說(shuō)明HIIT應(yīng)促進(jìn)更多內(nèi)臟WAT棕色化的過(guò)程中，脂肪交感神經(jīng)對(duì)脂肪細(xì)胞的調(diào)控可能具備潛在的重要作用。由于相關(guān)分析并不能驗(yàn)證上游信號(hào)（交感神經(jīng)活動(dòng)）與下游現(xiàn)象（內(nèi)臟WAT棕色化）之間存在直接的因果關(guān)系，故研究二的內(nèi)容通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行10天HIIT訓(xùn)練，并阻斷內(nèi)臟脂肪的交感神經(jīng)調(diào)節(jié)活動(dòng)，觀察WAT的UCP-1表達(dá)是否會(huì)因?yàn)槭ソ桓猩窠?jīng)的調(diào)控活動(dòng)而下降。交感神經(jīng)對(duì)組織的調(diào)控，主要末梢分泌去甲腎上腺素，并激活下游細(xì)胞的β型腎上腺素能受體來(lái)實(shí)現(xiàn)。與其他組織不同，脂肪組織的腎上腺素能受體亞型為β3型，故腹腔注射β3型受體的特異性拮抗劑SR59230a，能特異性抑制內(nèi)臟WAT的交感神經(jīng)支配（Sipe et al.，2017）。Dewal等（2019）綜述了運(yùn)動(dòng)促進(jìn)WAT棕色化的效果，指出10～60天的運(yùn)動(dòng)周期均可顯著提升UCP-1表達(dá)，且UCP-1在運(yùn)動(dòng)開始前3周的幅度最明顯。而本研究顯示，經(jīng)過(guò)10天HIIT后，SR組相比Saline組內(nèi)臟WAT的UCP-1表達(dá)顯著降低，說(shuō)明交感神經(jīng)末梢的β3受體被阻斷后，HIIT促進(jìn)UCP-1表達(dá)的效果被抑制。此結(jié)果可有力證明HIIT通過(guò)交感神經(jīng)途徑促進(jìn)了內(nèi)臟脂肪細(xì)胞UCP-1表達(dá)，提高了內(nèi)臟脂肪非顫栗性產(chǎn)熱，有利于特異性的減少內(nèi)臟脂肪。

總之，本研究的相關(guān)結(jié)果，在分子層面上確認(rèn)了HIIT能夠顯著提高內(nèi)臟WAT的棕色化，且此過(guò)程是依靠交感神經(jīng)途徑實(shí)現(xiàn)的（圖8）。應(yīng)指出的是，骨骼肌FNDC5與皮下脂肪UCP-1表達(dá)間具有中度相關(guān)的趨勢(shì)，但由于目前Irisin作用于脂肪細(xì)胞的受體尚不明確（Dinas et al.，2017），很難阻斷Irisin對(duì)皮下脂肪細(xì)胞的調(diào)控，故骨骼肌FNDC5/Irisin信號(hào)促皮下脂肪的作用，有待進(jìn)一步研究。

圖8 HIIT與MICT促進(jìn)內(nèi)臟與皮下WAT棕色化的信號(hào)途徑

4 結(jié)論

相比中等強(qiáng)度持續(xù)訓(xùn)練（MICT），高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（HIIT）能夠更顯著地促進(jìn)內(nèi)臟白色脂肪組織棕色化。HIIT促進(jìn)內(nèi)臟脂肪組織棕色化與交感神經(jīng)纖維對(duì)脂肪細(xì)胞的調(diào)控活動(dòng)密切相關(guān)。