雷珠單抗或加減駐景方對形覺剝奪性近視豚鼠眼軸和脈絡(luò)膜厚度的短期影響

劉俐娜，鐘興武，劉紅山，王丹陽，徐家窈，勞 偉，吳挺飛

0引言

隨著對脈絡(luò)膜厚度研究的逐漸深入，大量研究發(fā)現(xiàn)脈絡(luò)膜厚度隨著近視度數(shù)的增加而變薄[1-2]，因此脈絡(luò)膜厚度的變化在青少年近視的防控中起著十分重要的作用。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是二聚體糖蛋白，其負(fù)責(zé)新生血管的形成和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的通透性，當(dāng)與血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)結(jié)合后可通過調(diào)控血管通透性來影響血流灌注率[3]，由于脈絡(luò)膜厚度取決于其灌注率，抗VEGF藥物可能通過與VEGF結(jié)合，使VEGF失去活性，從而改變毛細(xì)血管通透性、改變血流灌注率，并通過影響脈絡(luò)膜血流量和脈絡(luò)膜腔隙的大小來改變脈絡(luò)膜的厚度。本研究通過制作形覺剝奪性近視豚鼠動物模型，觀察加減駐景方和雷珠單抗注射液對豚鼠形覺剝奪恢復(fù)期的屈光度、眼軸長度和脈絡(luò)膜厚度的短期變化，探討兩種藥物對形覺剝奪性近視恢復(fù)期的影響。

1材料和方法

1.1材料選取2周齡健康英國種三色短毛豚鼠60只(長沙市天勤生物技術(shù)有限公司)，體質(zhì)量120g左右，入組前對各組豚鼠眼部進(jìn)行篩查，排除白內(nèi)障、先天性近視、角膜疾病等常見眼部疾病，測量各組豚鼠眼球屈光度及眼軸長度，各組實(shí)驗前屈光度及眼軸長度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、2。飼養(yǎng)溫度保持25℃左右，控制12h/12h的晝夜規(guī)律，自由飲食。本研究程序遵循實(shí)驗程序依照《實(shí)驗動物管理與使用指南》，本研究方案經(jīng)海南省眼科醫(yī)院動物倫理委員會審查批準(zhǔn)(2017-003)。

加減駐景方顆粒劑：由枸杞子、楮實(shí)子、菟絲子、五味子、茺蔚子、三七等組成，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供；雷珠單抗眼用注射液：由諾華制藥公司(瑞士)提供(進(jìn)口藥品注冊證號：S20160002，產(chǎn)品批號：SDY07)。

1.2方法

1.2.1動物模型制作和分組60只2周齡豚鼠連續(xù)配戴右眼遮蓋的頭罩2wk。無毒半透明小號乳膠氣球，按照豚鼠頭部大小形狀剪成頭套，充分露出豚鼠的左眼、口鼻及雙耳。2wk后分別測量各組的屈光度及眼軸長度，觀察近視造模情況。將4周齡豚鼠去除右眼遮蓋頭罩，隨機(jī)分為駐景方組、雷珠單抗組和生理鹽水組各20只，駐景方組行加減駐景方灌胃3.285g/(kg·d)(1.5mL/d)，生理鹽水組予生理鹽水灌胃1.5mL/d，共7d，雷珠單抗組第1d右眼玻璃體腔注射雷珠單抗注射液0.02mg 1次。4周齡豚鼠在給藥前和給藥后1、3d，1wk上午8∶00～12∶00通過A超測量右眼眼軸長度和OCT測量脈絡(luò)膜厚度。

1.2.2雷珠單抗注射液玻璃體內(nèi)注射提前1d使用妥布霉素滴眼液(愛爾康公司，美國)滴右眼(每日6次)，術(shù)前用復(fù)方托吡卡胺滴眼液(參天制藥有限公司，日本)散瞳，50g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，眼周用碘伏消毒完畢后鋪無菌洞巾，聚維酮碘滴眼液消毒結(jié)膜囊及眼表，1min后用氯化鈉注射液沖洗干凈。在顯微鏡下用顯微鏡有齒鑷固定眼球，微量注射器在顳側(cè)角膜緣后1mm處垂直鞏膜進(jìn)針，針頭向眼球壁傾斜20°避開晶狀體推進(jìn)約3mm后注射雷珠單抗，注射完畢后用齒鑷輕輕夾住針孔30s，妥布霉素眼膏(愛爾康公司，美國)涂眼，無菌紗布遮蓋包扎，術(shù)后第2d抗生素滴眼液滴右眼(每天6次)。

1.2.3測量屈光度右眼使用睫狀肌麻痹劑10g/L鹽酸環(huán)噴脫酯滴眼液(愛爾康公司，美國)，每5min滴1次，共4次，30min后進(jìn)行帶狀光檢影驗光(YZ24型，中國蘇州六六公司)，由驗光經(jīng)驗豐富的檢查者檢影，以等效球鏡(球鏡度+1/2柱鏡度)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4測量眼軸長度應(yīng)用AVISO眼科A超測量儀(光太公司，法國)，測量前先用10g/L鹽酸丙美卡因滴眼液(美國愛爾康公司)行角膜表面麻醉。測量時探頭對準(zhǔn)角膜中心并垂直于角膜平面，測定右眼眼軸長度手動模式連續(xù)測量5次，計算平均值，精確到0.01mm。

1.2.5測量脈絡(luò)膜厚度豚鼠處于自然清醒狀態(tài)，撐開右眼眼瞼，固定于OCT(SpectralisHRA+OCT，海德堡公司，德國)頜架合適位置，通過監(jiān)視屏觀察，按照設(shè)備使用方法對豚鼠眼球后極部進(jìn)行掃描，選擇870nm的波長，增強(qiáng)的深度成像模式(EDI)，模式大小為30°×15°，沿水平和垂直掃描視盤，中心與視盤中心相連。該脈絡(luò)膜定義為從外表面延伸視網(wǎng)膜色素上皮到鞏膜內(nèi)表面，測量距離視盤1mm處的顳側(cè)脈絡(luò)膜厚度(圖1)。豚鼠OCT掃描過程均由兩位醫(yī)師在OCT檢查室內(nèi)進(jìn)行操作完成，一名醫(yī)師負(fù)責(zé)保持豚鼠眼睛位置，同時協(xié)助調(diào)整被檢眼距離OCT掃描鏡頭的距離，以使監(jiān)視器可以清晰看到視盤；另一名醫(yī)師負(fù)責(zé)進(jìn)行OCT操作。重復(fù)檢測3次以上，取平均值。

2結(jié)果

2.1三組屈光度比較三組給藥前后不同時間點(diǎn)的屈光度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組別=5.873，P組別=0.006；F時間=6.047，P時間=0.003)，且時間因素和分組因素存在交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F交互作用=14.45，P交互作用<0.01)。雷珠單抗組給藥前后的屈光度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，駐景方組和生理鹽水組給藥后1、3d的屈光度明顯降低(P<0.05)，但在1wk時恢復(fù)到給藥前的水平(P>0.05)，且3d時的屈光度低于1d(P<0.05)。給藥1d時生理鹽水組和駐景方組低于雷珠單抗組(P<0.05)，駐景方組和生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥3d時生理鹽水組低于駐景方組和雷珠單抗組，且駐景方組低于雷珠單抗組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥前及給藥1wk時三組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2三組眼軸長度比較三組給藥前后不同時間點(diǎn)的眼軸長度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組別=10.876，P組別=0.001；F時間=7.110，P時間=0.003)，并且時間因素和分組因素存在交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F交互作用=8.765，P交互作用<0.01)。雷珠單抗組給藥前后的眼軸長度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，駐景方組和生理鹽水組給藥后1、3d的眼軸長度明顯縮短(P<0.05)，但在1wk時恢復(fù)到給藥前的水平(P>0.05)，且3d時的眼軸長度短于1d(P<0.05)。給藥1d時生理鹽水組和駐景方組的眼軸長度短于雷珠單抗組(P<0.05)，駐景方組和生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥3d時生理鹽水組的眼軸長度短于駐景方組和雷珠單抗組(P<0.05)，且駐景方組短于雷珠單抗組(P<0.05)。給藥前及給藥1wk時三組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

圖1 測量距離視盤1mm處的顳側(cè)脈絡(luò)膜厚度。

組別給藥前給藥1d給藥3d給藥1wk雷珠單抗組-7.45±1.41-7.48±1.53-7.51±2.42-7.49±1.85駐景方組-7.46±1.62-6.84±1.71a,c -5.61±1.73a,c-7.63±1.94生理鹽水組-7.46±1.32-6.63±1.95a,c-3.79±2.11a,c -7.94±2.16

注：aP<0.05vs組內(nèi)給藥前；cP<0.05vs同時間雷珠單抗組。

組別給藥前給藥1d給藥3d給藥1wk雷珠單抗組8.11±0.138.11±0.238.13±0.198.14±0.15駐景方組8.12±0.147.93±0.16a,c7.69±0.24a,c8.12±0.17生理鹽水組8.12±0.177.85±0.22a,c7.06±0.18a,c8.18±0.136

注：aP<0.05vs組內(nèi)給藥前；cP<0.05vs同時間雷珠單抗組。

組別給藥前給藥1d給藥3d給藥1wk雷珠單抗組86.12±8.2590.36±6.4789.58±6.6384.33±10.45駐景方組85.25±9.01110.44±8.57a,c124.28±8.92a,c87.01±8.15生理鹽水組86.17±8.43112.62±9.23a,c196.18±10.41a,c90.64±8.42

注：aP<0.05vs組內(nèi)給藥前；cP<0.05vs同時間雷珠單抗組。

2.3三組脈絡(luò)膜厚度比較三組給藥前后不同時間點(diǎn)的脈絡(luò)膜厚度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組別=16.243，P組別<0.01；F時間=8.332，P時間=0.001)，并且時間因素和分組因素存在交互作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F交互作用=7.766，P交互作用<0.01)。雷珠單抗組給藥前后的脈絡(luò)膜厚度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。駐景方組和生理鹽水組給藥后1、3d的脈絡(luò)膜厚度明顯變厚(P<0.05)，但在1wk時恢復(fù)到給藥前的水平(P>0.05)，且3d時的脈絡(luò)膜厚度較1d時更厚(P<0.05)。給藥1d時生理鹽水組和駐景方組的脈絡(luò)膜厚度厚于雷珠單抗組(P<0.05)，駐景方組和生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥3d時生理鹽水組的脈絡(luò)膜厚度厚于駐景方組和雷珠單抗組(P<0.05)，且駐景方組厚于雷珠單抗組(P<0.05)。給藥前及給藥1wk時三組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

3討論

豚鼠屬于哺乳動物，眼球結(jié)構(gòu)和功能接近于人類，有著和人類相似的正視化機(jī)制，以及與人類相似的形覺剝奪性近視生長曲線。眼球正視化過程受到光照、飲食習(xí)慣和遺傳等因素的影響，這個過程出現(xiàn)差錯時將會導(dǎo)致屈光不正或者其他眼病[4-5]。

有研究[6]發(fā)現(xiàn)小雞的脈絡(luò)膜厚度的變化與近視相關(guān)，這是近視動物研究的一項重大發(fā)現(xiàn)。脈絡(luò)膜可通過自身厚度的改變使光學(xué)平面前后移動，從而引起眼屈光度的改變，當(dāng)配戴正鏡片時，視網(wǎng)膜成像產(chǎn)生近視離焦，小雞的眼脈絡(luò)膜厚度顯著增加，使視網(wǎng)膜前移接近成像焦點(diǎn);而誘發(fā)近視時，視網(wǎng)膜成像產(chǎn)生遠(yuǎn)視離焦，脈絡(luò)膜厚度會變薄。同時，脈絡(luò)膜還會將視網(wǎng)膜感應(yīng)到的離焦信息傳遞給鞏膜，進(jìn)而阻止或加速眼軸的增長[7]。因此，脈絡(luò)膜厚度的改變在屈光不正的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。已在小雞等實(shí)驗動物和人類身上發(fā)現(xiàn)[4, 8-9]。

迄今為止，大量文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)在形覺剝奪性近視和恢復(fù)的過程中，隨著脈絡(luò)膜血管滲透性的雙向變化，脈絡(luò)膜的厚度也產(chǎn)生了相應(yīng)的變化。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，在人類形覺剝奪性近視恢復(fù)期，脈絡(luò)膜增厚，脈絡(luò)膜上腔液中蛋白含量增加;而形覺剝奪性近視進(jìn)展期，脈絡(luò)膜變薄，上腔液中蛋白含量下降，這與我們實(shí)驗中對照組豚鼠的脈絡(luò)膜厚度在形覺剝奪性近視恢復(fù)期出現(xiàn)短暫的脈絡(luò)膜增厚的變化是一致的，可能與毛細(xì)血管通透性改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)移至細(xì)胞外基質(zhì)或淋巴管有關(guān)。還有相應(yīng)的研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，脈絡(luò)膜血管直徑引起的血流量變化也會導(dǎo)致脈絡(luò)膜厚度發(fā)生變化。Wallman等提出動物實(shí)驗中近視離焦后的脈絡(luò)膜厚度增加主要通過脈絡(luò)膜血流的變化和脈絡(luò)膜腔隙的擴(kuò)張而產(chǎn)生[6]。Nickla等[13]也發(fā)現(xiàn)，在離焦性近視中，毛細(xì)血管通透性增加而導(dǎo)致的血流量增加可能會導(dǎo)致脈絡(luò)膜增厚。

由此我們推測，抗VEGF藥物可通過與VEGF-A結(jié)合，使VEGF-A失去活性，改變毛細(xì)血管通透性，減少血流灌注率從而減少脈絡(luò)膜血流量和脈絡(luò)膜腔隙的大小來抑制形覺剝奪恢復(fù)期脈絡(luò)膜厚度的增厚，Mathis等[14]研究發(fā)現(xiàn)，玻璃體腔內(nèi)注射了貝伐珠單抗注射液的小雞在形覺剝奪性近視恢復(fù)期的脈絡(luò)膜厚度增厚被抑制，且持續(xù)了1wk的時間，而且脈絡(luò)膜中VEGF因子顯著減少，這也證實(shí)了抗VEGF藥物可以通過與VEGF-A結(jié)合來抑制脈絡(luò)膜厚度的增厚。雷珠單抗是一種能有效抗人眼VEGF的抗體并已廣泛應(yīng)用于臨床，我們的實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)玻璃體腔內(nèi)注射了雷珠單抗注射液的豚鼠在形覺剝奪性近視恢復(fù)期的脈絡(luò)膜厚度增厚同樣在1wk的時間內(nèi)得到了抑制，也有研究[15]以《中醫(yī)眼科六經(jīng)法要》[16]中駐景方形成固定方劑，發(fā)現(xiàn)其可以減少脈絡(luò)膜新生血管中VEGF的表達(dá)，我們在研究中也發(fā)現(xiàn)兩種藥物均對脈絡(luò)膜厚度的變化產(chǎn)生了相應(yīng)的影響,抑制了脈絡(luò)膜的增厚，眼軸的縮短以及屈光度的減少，但是雷珠單抗的影響要明顯得多，全程均明顯抑制了形覺剝奪性近視恢復(fù)期脈絡(luò)膜的增厚，而駐景方在3d時才開始出現(xiàn)輕微的增厚抑制，但均只持續(xù)了短暫的1wk時間。這種變化既可能是因為雷珠單抗的抗VEGF作用很顯著，通過與VEGF-A結(jié)合，改變了毛細(xì)血管通透性導(dǎo)致蛋白質(zhì)移至細(xì)胞外基質(zhì)或淋巴管，血流灌注率減少從而減少脈絡(luò)膜血流量和脈絡(luò)膜腔隙的大小，也不排除由于豚鼠形覺剝奪恢復(fù)期的脈絡(luò)膜增厚僅表現(xiàn)為短暫的1wk時間，中藥駐景方由于服用時間較短作用尚未充分顯現(xiàn)，本實(shí)驗1wk的研究時間較短，有一定的局限性，但雷珠單抗注射液對豚鼠形覺剝奪性近視的脈絡(luò)膜厚度有明顯的干預(yù)效果，這可作為青少年近視防控研究的一個著陸點(diǎn)，進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，雷珠單抗注射液玻璃體腔注射全程抑制了豚鼠形覺剝奪性近視恢復(fù)期的脈絡(luò)膜增厚，同時也抑制了眼軸的縮短和近視度數(shù)的恢復(fù)，而中藥駐景方在3d時才出現(xiàn)了輕微的脈絡(luò)膜增厚抑制，且均只持續(xù)了短暫的1wk時間。這可能與抗VEGF藥物通過與VEGF-A因子結(jié)合，能夠減少血流灌注率，降低脈絡(luò)膜血流量，抑制脈絡(luò)膜增厚有關(guān)。