正交試驗(yàn)法優(yōu)選香芎凝膠貼膏處方提取工藝

楊曉日 李詠梅 張俊生

[摘要] 目的 優(yōu)選香芎凝膠貼膏處方最佳提取工藝。 方法 采用醇提工藝，以阿魏酸和王不留行黃酮苷的提取率和處方的出膏率為指標(biāo)，以正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察提取過程中乙醇濃度、提取倍數(shù)、提取時(shí)間等條件對(duì)各指標(biāo)的影響，優(yōu)選出最優(yōu)醇提工藝。并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。 結(jié)果 最優(yōu)醇提工藝為加入8倍量60%乙醇，提取2次，每次1.5 h。結(jié)論 該工藝合理可行，有效成分提取率高，重復(fù)性好?？蔀橄丬耗z貼膏現(xiàn)代制劑的開發(fā)提供技術(shù)參考。

[關(guān)鍵詞] 香芎凝膠貼膏;正交試驗(yàn);阿魏酸;王不留行黃酮苷;出膏率;提取工藝

[中圖分類號(hào)] R283.6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）02（c）-0123-04

[Abstract] Objective To optimize the extraction process of Xiangxiong Gel Plaster. Methods The ethanol extraction process was used， the extraction rate of ferulic acid and flavone glycoside and the extract rate of prescription as the indexes， the orthogonal experimental design was used to investigate the influence of ethanol concentration， extraction times， extraction time and other conditions in the extraction process on each index， and the optimal extraction process was optimized. And a verification test was carried out. Results The optimal ethanol extraction process was to add 8 times of 60% ethanol and extract? twice， with 1.5 h each time. Conclusion The process is reasonable and feasible， the effective component extraction rate is high， the repeatability is good. It can provide technical reference for the development of Xiangxiong Gel Plaster.

[Key words] Xiangxiong Gel Plaster; Orthogonal test; Ferulic acid; Flavone glycosides from codonopsis; Extract rate; Extractprocess

香芎散是煙臺(tái)市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科臨床外用經(jīng)驗(yàn)方劑，由川芎、王不留行、香附、沒藥、乳香等組成，具有活血止痛理氣的作用[1-5]。臨床上用于治療肝郁氣滯、氣滯血瘀所致的冠心病、心臟神經(jīng)官能癥、高血壓、高血脂等代謝綜合征。課題組擬將其研制成中藥復(fù)方經(jīng)皮給藥制劑，即香芎凝膠貼膏[6-10]。在提取工藝研究中，以阿魏酸王不留行黃酮苷的提取率和出膏率為指標(biāo)，優(yōu)選最優(yōu)醇提工藝。

1 材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 1260 InfinitⅡ;Milli-Q超純水機(jī);Es-E120BⅡ電子分析天平（天津市德安特傳感技術(shù)有限公司0.01 mg）;DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)技術(shù)有限公司）;GM-0.33A隔膜真空泵（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

川芎（山東商都藥業(yè)有限公司，批號(hào)：18060202）;王不留行（安徽九州方圓制藥有限公司，批號(hào)：201803 01）;阿魏酸、王不留行黃酮苷（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110773-201313、11853201303）;甲醇、乙腈（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 香芎凝膠膏劑處方藥材的核查

根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典（一部）》[11]（以下簡(jiǎn)稱“《中國藥典》”）的規(guī)定，對(duì)處方中各藥材進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果川芎和炒王不留行含量分別為0.26%和0.23%，符合《中國藥典》要求。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化香芎凝膠膏劑的提取工藝

2.2.1阿魏酸含量測(cè)定? 色譜條件? 色譜柱：Agilent EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;填充劑為十八烷基鍵合硅膠;流動(dòng)相：甲醇∶1%醋酸溶液（30∶70）;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長：321 nm;柱溫：25℃。理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)不低于5000。陰性對(duì)照液中色譜對(duì)測(cè)定無干擾。

對(duì)照品溶液的制備取精密稱定的阿魏酸對(duì)照品，置于棕色容量瓶中，加70%甲醇配成0.12 mg/mL的溶液。供測(cè)定線性使用。取以上溶液按照《中國藥典》要求配成20 μg/mL的溶液備用。

供試品溶液的制備? 取處方藥材30 g，按L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表提取藥材2次，合并提取液，用相應(yīng)濃度的乙醇定容至1000 mL備用。

空白溶液的制備? 稱取除川芎外其余藥材，回流提取（8倍量80%乙醇）2次，1 h/次，合并提取液，用相應(yīng)濃度乙醇定容至1000 mL備用。

2.2.2 方法專屬性考察? 取供試品溶液、對(duì)照品溶液、川芎空白溶液10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，供試品溶液和對(duì)照品溶液均在9 min左右現(xiàn)阿魏酸的特征吸收峰，川芎空白溶液則無特征吸收峰，方法專屬性良好。見圖1。

A：阿魏酸對(duì)照品溶液;B：供試品溶液;C：川芎空白溶液。1.阿魏酸

2.2.3 線性關(guān)系考察? 分別精密吸取0.12 mL/min阿魏酸貯備液各0.5、1、2、3、4、10 mL置于10 mL棕色容量瓶中，分別稀釋后得系列對(duì)照品溶液，各進(jìn)樣20 μL。橫坐標(biāo)為對(duì)照品的質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為峰面積，回歸方程：Y = 26 075X-19.894，r2 = 0.9998，阿魏酸在0.0123～0.246 mg/mL濃度范圍內(nèi)阿魏酸線性關(guān)系良好。

2.2.4精密度考察? 取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算其平均峰面積為754.0676，RSD為0.13%。儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 吸取同一供試品溶液10 μL于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均峰面積為1015.611，其RSD為4.33%。供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)? 同一供試品溶液6份，在上述色譜條件下測(cè)定。計(jì)算阿魏酸提取率，RSD為3.6%。方法重復(fù)性良好。

2.3 王不留行黃酮苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件? 色譜柱：Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;填充劑為十八烷基鍵合硅膠;流動(dòng)相：A（乙腈）：B（水），梯度洗脫;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長：280 nm;柱溫：25℃[7]。理論板數(shù)按王不留行黃酮苷峰計(jì)不低于5000。陰性對(duì)照液中色譜對(duì)測(cè)定無干擾。梯度洗脫程序：0～10.0 min，5%→10%A;10.0～85.0 min，10%→30%A;85.0～90.0 min，30%→30%A。

2.3.2 王不留行黃酮苷對(duì)照品溶液的制備? 按《中國藥典》王不留行黃酮苷對(duì)照品溶液的制備方法制備得0.1 mg/mL的溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備? 取“2.2.1”項(xiàng)下制備的溶液備用。

2.3.4王不留行空白溶液的制備? 取除王不留行外其余藥材，照“2.2.4”項(xiàng)下的方法制備。

2.3.5方法專屬性考察? 分別取供試品溶液、王不留行黃酮苷對(duì)照品溶液，王不留行空白溶液10 μL，照上述色譜條件測(cè)定，供試品溶液和王不留行黃酮苷對(duì)照品溶液均在33 min左右現(xiàn)王不留行黃酮苷特征吸收峰，而王不留行黃酮苷空白溶液在此處無干擾，方法專屬性良好。見圖2。

A：王不留行黃酮苷對(duì)照品溶液;B：供試品溶液;C：王不留行黃酮苷空白溶液。2.王不留行黃酮苷

2.3.6 線性關(guān)系考察? 分別取王不留行黃酮苷對(duì)照品溶液各1、2、3、4、5 mL置于5mL容量瓶中，稀釋后得系列對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL。橫坐標(biāo)為對(duì)照品的質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為峰面積，回歸方程：Y = 17 083X-38.772，r2 = 0.9917，王不留行黃酮苷在0.01～0.05 mL/min范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.7精密度考察? 取王不留行黃酮苷對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算平均峰面積為1993.382，其RSD為0.82%。儀器精密度良好。

2.3.8穩(wěn)定性試驗(yàn)? 取同一供試品溶液10 μL分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，計(jì)算平均峰面積為248.502，其RSD為3.36%。供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9重復(fù)性試驗(yàn)? 同一供試品溶液6份，在上述的色譜條件下測(cè)定。計(jì)算王不留行黃酮苷提取率，其RSD為2.86%。方法重復(fù)性良好。

2.4 出膏率測(cè)定

取“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液25 mL置于已知恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥3 h后移置干燥器中，冷卻30 min后精密稱定重量，出膏率=干膏質(zhì)量（g）/藥材總質(zhì)量（g）x100%[8，12]。

2.5 正交試驗(yàn)法優(yōu)選提取工藝

據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果及參考文獻(xiàn)[13-17]，將提取次數(shù)設(shè)2次，考察因素為乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間3個(gè)因素，每因素取3水平，以出膏率和阿魏酸，王不留行黃酮轉(zhuǎn)移率做為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交表安排試驗(yàn)。見表1。

各因素對(duì)阿魏酸的轉(zhuǎn)移率的影響程度依次為C>B>A，最佳提取條件為A3B2C2;各因素對(duì)王不留行中黃酮苷的轉(zhuǎn)移率的影響程度依次為C>B>A，最佳提取條件為A2B3C2。見表2～4。

各因素對(duì)出膏率的影響程度依次為A>B>C，見表5。最佳提取工藝為A1B3C1。A、B、C三因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。綜合分析，建議最佳提取工藝為A1B2C2。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

按以上最佳工藝，60%乙醇，8倍加醇量，提取2次，每次1.5 h，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。最佳工藝中，阿魏酸平均轉(zhuǎn)移率為61.84%，RSD%為0.27%;王不留行黃酮苷平均轉(zhuǎn)移率為57.95%，RSD%為2.85%;平均出膏率為22.71%，RSD%為0.08%。見表6。

3 討論

川芎為香芎外用方的君藥，主要成分阿魏酸具有增加冠脈血流量、保護(hù)心肌缺血、抗血小板聚集等藥理功效[17-24];王不留行為處方中的臣藥，其主要成分王不留行黃酮苷具有降脂、抗心律失常、抗炎等藥理作用。故選這兩個(gè)成分的轉(zhuǎn)移率及出膏率作為考察指標(biāo)，篩選處方的最優(yōu)提取工藝。

測(cè)定王不留行黃酮苷時(shí)，對(duì)不同的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，采用流動(dòng)相：A（乙腈）：B（水），梯度洗脫。在此色譜條件下王不留行黃酮苷的色譜峰與相鄰成分達(dá)到基線分離，理論板數(shù)按王不留行黃酮苷峰計(jì)不低于5000故選擇乙腈-水作為其流動(dòng)相。

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（收稿日期：2019-09-06? 本文編輯：劉永巧）