高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定禽蛋中異丙嗪和氯丙嗪

王可*，曹倩玉，趙靈芝，陳龍星，高倩，楊莉麗

1. 石家莊市疾病預(yù)防控制中心毒物檢測中心（石家莊 050011）；2. 河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院（石家莊 050024）

氯丙嗪是一個(gè)直接作用于中樞神經(jīng)細(xì)胞的鎮(zhèn)靜劑，有中樞抑制作用，可用于治療躁狂癥、精神分裂癥等。異丙嗪有較強(qiáng)的中樞安定和抗過敏作用，可以起到鎮(zhèn)靜、麻醉和止痛的效果。氯丙嗪和異丙嗪混合可制成安定類藥物，能降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺活性[1]。一些養(yǎng)殖戶在飼料和水中添加此類藥物來抑制動(dòng)物運(yùn)動(dòng)，從而間接起到催肥促進(jìn)生長作用[2]；在動(dòng)物運(yùn)輸過程中使用，減少動(dòng)物運(yùn)輸途中失重、降低死亡率[3-4]。這類藥物在體內(nèi)代謝緩慢，容易產(chǎn)生體內(nèi)蓄積殘留，不僅可引起動(dòng)物中毒，還有可能通過食物殘留進(jìn)入人體，長期蓄積并引發(fā)人體腎臟和肝臟的病變而危及生命[5]。因此，世界各國對于動(dòng)物源食品中鎮(zhèn)靜劑類藥物的殘留均有嚴(yán)格限量要求，歐盟早在1997年就將氯丙嗪列入禁用清單中，中國于2002年規(guī)定氯丙嗪禁止用于食源性動(dòng)物[6-7]。該類藥物的檢測研究對象主要是飼料、豬肝、豬肉、血液、生物組織、尿液等[8-12]，關(guān)于動(dòng)物源食品禽蛋中異丙嗪和氯丙嗪的檢測方法未見報(bào)道。因此，建立禽蛋中異丙嗪和氯丙嗪的快速檢測方法具有重要意義。

對于異丙嗪和氯丙嗪的檢測方法主要包括液相色譜法[13]、氣相色譜法[14]、化學(xué)發(fā)光法[15]、光譜法[16]、電化學(xué)分析法[17]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[18]等。其中，液相色譜法以保留時(shí)間定性，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，且靈敏度不高?；瘜W(xué)發(fā)光法需柱后衍生，操作過程繁雜。HPLC-MS/MS具有高通量和高靈敏度的特點(diǎn)，分析時(shí)間短，可信度高，尤其是對復(fù)雜基質(zhì)樣品中痕量物質(zhì)的殘留檢測有著明顯優(yōu)勢。試驗(yàn)基于HPLC-MS/MS建立禽蛋中異丙嗪和氯丙嗪的分析方法，并對色譜條件、前處理方法等進(jìn)行優(yōu)化。該方法操作簡單、準(zhǔn)確度高、精密度好，適用于禽蛋中異丙嗪和氯丙嗪的快速定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200-6410B液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；AE 240型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；T-460/H型超聲清洗器（德國Elma公司）；C3I型臺(tái)式離心機(jī)（法國Jouan公司）；EVAP-Ⅲ型氮吹儀（美國Organomation）；MS3型渦旋振蕩器（德國IKA公司）；Milli-Q型超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

乙腈、甲酸、甲醇（均為色譜純，美國Fisher公司）；乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）填料（美國Supelco公司）；C18填料（美國Welch公司）；Oasis MCX固相萃取柱（美國Waters公司）；ProElut PLS固相萃取柱（美國Dikma）；C18固相萃取柱（美國Welch公司）；鹽酸異丙嗪（C17H20N2S·HCl，中國藥品生物制品鑒定所）；鹽酸氯丙嗪（C17H19ClN2S·HCl，Dr. Ehrenstorfer GmbH）。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量氯丙嗪和異丙嗪標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃保存。取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋得到1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液。采用空白基質(zhì)提取液稀釋，配制0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

取一枚禽蛋，去殼后攪拌均勻，準(zhǔn)確稱取約2 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻30 s，超聲15 min，以4 000 r/min離心5 min，移取提取液，再次加10 mL乙腈，進(jìn)行二次提取，合并兩次提取液并加入0.3 g NaCl渦旋混勻，靜置10 min；取12 mL上清液用0.03 g PSA和0.10 g無水硫酸鎂（MgSO4）進(jìn)行凈化，充分混合后以4 000 r/min離心5 min，取10 mL凈化液在40 ℃下氮吹至干，用1 mL乙腈復(fù)溶，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后，供HPLC-MS/MS檢測。

1.4 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm，美國Agilent公司）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相，0.1%甲酸水-乙腈（35︰65，V/V）；進(jìn)樣量5 μL；流速0.2 mL/min。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式；霧化氣（氮?dú)猓毫?0 psi；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；毛細(xì)管壓力4 000 V；監(jiān)測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。異丙嗪和氯丙嗪的母離子、碎裂電壓、子離子和碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 異丙嗪和氯丙嗪的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

在離子化過程中，異丙嗪和氯丙嗪易結(jié)合H+，形成[M+H]+，故在水相中加入0.1%甲酸，以提高其質(zhì)子化效率。液相色譜中常用的流動(dòng)相為乙腈或甲醇。試驗(yàn)針對有機(jī)相甲醇和乙腈進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)采用乙腈為有機(jī)相時(shí)，異丙嗪和氯丙嗪的峰型較好，且響應(yīng)值較高。故而選取0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相，并對流動(dòng)相比例進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)流動(dòng)相比例為0.1%甲酸水-乙腈（35︰65，V/V）時(shí)，分離效果及峰型較好（圖1）。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取劑的比較

比較乙腈、乙酸乙酯作為提取劑時(shí)異丙嗪和氯丙嗪的加標(biāo)回收率。試驗(yàn)結(jié)果顯示，乙腈作為提取劑時(shí)，異丙嗪和氯丙嗪的回收率最高，分別為86.3%和71.8%；比較向乙腈中加入氫氧化鈉溶液進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種鎮(zhèn)靜劑的回收率整體變差。因此，最終選定提取劑為乙腈。

2.2.2 凈化方式的選擇

分別比較采用固相萃取柱和分散固相萃取劑凈化對異丙嗪和氯丙嗪回收率的影響。如表2所示，采用PLS、C18、MCX固相萃取柱凈化時(shí)，異丙嗪和氯丙嗪的回收率較低，為32.9%～64.4%；使用分散固相萃取劑PSA與無水MgSO4進(jìn)行凈化時(shí)，異丙嗪和氯丙嗪的回收率分別為88.1%和78.7%，回收率較好。進(jìn)一步對PSA與無水MgSO4的用量進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇采用0.03 g PSA與0.1 g無水MgSO4進(jìn)行凈化。

圖1 異丙嗪和氯丙嗪的色譜圖

表2 不同凈化方式對異丙嗪和氯丙嗪回收率的影響

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)（ME）指樣品中除目標(biāo)分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響，使響應(yīng)信號(hào)增大的為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，使響應(yīng)信號(hào)減小的稱為基質(zhì)抑制效應(yīng)。試驗(yàn)采用同一濃度待測物在基質(zhì)液與純?nèi)軇┲许憫?yīng)的比值評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，比值越接近于100%，基質(zhì)效應(yīng)越小。比值80%～120%時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)較小，可忽略；比值低于80%或高于120%時(shí)，表明有較強(qiáng)的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)作用，需用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正[19]。試驗(yàn)得到異丙嗪和氯丙嗪在10.0，20.0，50.0和100.0 ng/mL質(zhì)量濃度下的基質(zhì)效為52.8%～71.9%（表3），說明這2種物質(zhì)都存在較大程度基質(zhì)抑制效應(yīng)。為減小基質(zhì)效應(yīng)影響，需選用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

以濃度（x）作為橫坐標(biāo)，目標(biāo)化合物峰面積（y）作為縱坐標(biāo)，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在0.5～100.0 ng/mL范圍內(nèi)，異丙嗪和氯丙嗪的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）＞0.999。平行測定11個(gè)空白禽蛋樣品，分別計(jì)算得出2種鎮(zhèn)靜劑的檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10），如表4所示。

表3 異丙嗪和氯丙嗪在禽蛋中的基質(zhì)效應(yīng)

表4 異丙嗪和氯丙嗪的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.4 方法的回收率與精密度

取禽蛋空白樣品，加標(biāo)濃度分別為10.0，20.0和100.0 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平平行測定7次，計(jì)算異丙嗪和氯丙嗪的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。由表5可知，該方法的平均回收率為80.2%～102.0%，RSD為2.5%～8.1%，準(zhǔn)確度與精密度較好，能滿足禽蛋中異丙嗪和氯丙嗪含量的定量分析要求。

表5 異丙嗪和氯丙嗪的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=7）

2.5 實(shí)際樣品的檢測

采用該方法對購自石家莊市不同超市、農(nóng)貿(mào)市場的10份雞蛋和10份鴨蛋樣品進(jìn)行檢測，樣品所測結(jié)果均低于檢出限。

3 結(jié)論

以超聲輔助提取，分散固相萃取凈化，建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對禽蛋中異丙嗪和氯丙嗪同時(shí)檢測的方法。該方法具有前處理步驟簡單、分析時(shí)間短、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于禽蛋中異丙嗪和氯丙嗪的快速測定。