魚源腐敗希瓦氏菌生長/非生長界面模型的建立和驗證

郭全友 朱彥祺，2 姜朝軍 李保國

（1 中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所 上海200090 2 上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院 上海200093）

腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）屬于革蘭氏陰性菌，適宜低溫下生長[1-2]，能產(chǎn)生H2S、TMA、CH4SH 和（CH3）2S 等揮發(fā)性物質(zhì)，腐敗潛力強，被確認為有氧冷藏海水魚的特定腐敗菌（Specific spoilage organisms，SSO）[3-4]。研究者針對水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌生態(tài)特性、生長動力學、貨架期預(yù)測、靶向抑制和抑菌機制等進行了探究，如修艷輝等[5]研究了環(huán)境因子對大黃魚腐敗希瓦氏菌生長影響的計數(shù)法。藍蔚青等[6]研究了復合生物保鮮劑對腐敗希瓦氏菌的抑菌機理。水產(chǎn)品在加工、銷售、流通和貯藏過程中微生物受內(nèi)在和外在因子的影響，特別在運輸過程中溫度易產(chǎn)生波動，多因子交互作用下可能產(chǎn)生拮抗和協(xié)同作用。

通過設(shè)置“抑菌柵欄”和改變柵欄強度達到抑制微生物的作用。采用微生物生長／非生長（Growth/no growth，N/NG）界面模型可定量分析不同柵欄下目標微生物生長的可能性 （或概率），獲得不同環(huán)境因子下的生長／非生長信息，定量調(diào)節(jié)水產(chǎn)品內(nèi)外環(huán)境，達到殺滅或抑制作用。微生物生長/非生長界面模型常采用Logistic 回歸法[7]，食品中微生物生長/非生長界限模型多為致病菌模型，如單增李斯特菌[8]、黃曲霉菌和蠟樣芽孢桿菌等模型[9]，用于控制微生物毒素的產(chǎn)生，保障食品安全。目前食品腐敗菌模型的開發(fā)相對較少，如乳酸菌和結(jié)合酵母[10]等，通過定量控制微生物的生長/非生長，延長產(chǎn)品的貨架期。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Artificial neural Network，ANN）在食品加工工程中已廣泛應(yīng)用[11]，其中PNN（Probabilistic Neural Network）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法適用于生長／非生長模型的建立，具有結(jié)構(gòu)簡單和訓練速度快的特點，可利用線性學習算法實現(xiàn)非線性學習算法的功能，對微生物生長/非生長數(shù)據(jù)進行快速分類[12-13]。采用Logistic 回歸法和PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法構(gòu)建aw、pH 及鹽分交互作用下腐敗希瓦氏菌生長/非生長界面模型未見研究報道。

本文選取魚源腐敗希瓦氏菌為研究對象，研究室溫（25 ℃）條件下pH、aw 及鹽分（NaCl）對菌株腐敗希瓦氏菌生長概率的交互影響，采用二階線性Logistic 回歸方程擬合和PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法構(gòu)建環(huán)境因子交互作用下生長/非生長界面模型。旨在評估魚源腐敗希瓦氏菌在pH、aw 和鹽分范圍的生長動態(tài)，開發(fā)高效抑菌及定量評估方法，為保障海產(chǎn)品鮮度和品質(zhì)安全提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株D1 從低溫有氧貯藏大黃魚貨架期終點時分離，16SrRNA 測序鑒定為腐敗希瓦氏菌（序列號：KY786336），4 ℃保藏。

1.2 試驗試劑及儀器

胰蛋白胨大豆肉湯 （TSB）；胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基 （TSA）；1.0%鹽酸；1.0%氫氧化鈉；甘油和氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，上海）。

水分活度儀（AW LAB-Touch PMB35），大昌華嘉商業(yè)中國有限公司；pH 計（pHS-3C），上海雷磁儀器廠；微生物生長測定儀 （Bioscreen C），芬蘭；潔凈工作臺（SW-CJ-1FB），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；低溫培養(yǎng)箱（MIR-153），日本三洋公司。

1.3 培養(yǎng)基制備

采用TSB 作為培養(yǎng)基。參考文獻[5]25 ℃時，pH≤5.0 或aw≤0.920 或NaCl≥12%時，腐敗希瓦氏菌不生長，海水平均鹽度為3.5%，故交互試驗因素和水平設(shè)計如表1所示，選取均分水分活度0.90，0.92，0.94，0.96 作為訓練集建立模型，為避免誤差選擇具有代表性的相同水分活度0.91 為驗證集，計120 種工況，每種重復4 次和1 個空白平行。通過滅菌甘油調(diào)節(jié)水分活度，0.1 mol/L 稀鹽酸和0.1 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。

表1 腐敗希瓦氏菌pH，aw 和鹽分交互試驗設(shè)計Table 1 The design of the group of the Shewanella putrefaciens under different pH，aw and NaCl

1.4 菌懸液制備與接種

菌株活化：取腐敗希瓦氏菌接種于無菌營養(yǎng)肉湯中，振蕩30 s，25 ℃培養(yǎng)24 h，劃線得到單菌落。

菌株接種：把調(diào)節(jié)過pH、aw 和鹽分的TSB 經(jīng)121 ℃滅菌后接入100 孔微孔板，每孔180 μL，取105CFU/mL 的菌懸液20 μL，最終接種液濃度為4.5 lgCFU/mL，接種入孔，每個條件4 組平行，1 個空白，25 ℃培養(yǎng)，每隔1 h 測定其OD600nm值，測試周期為7 d。

1.5 生長/非生長邊界確定

當試驗結(jié)束時，微孔中出現(xiàn)明顯沉淀物或混濁，OD 值高于空白3 倍則判定為生長[14-16]，判定為生長時，取微孔中培養(yǎng)液100 μL 涂布于TSA 平板上，驗證菌株是否仍為純菌株。當OD 值1～3 倍之間時，涂布TSA 平板驗證，若平板出現(xiàn)典型菌落，

菌數(shù)與初始菌量差＞0.5 lgCFU/mL 時，則判定為生長。每種情況下的生長概率由重復孔的生長情況計算獲得，如4 孔中2 孔生長則該情況下生長概率為50%。

1.6 建立生長/非生長模型

1.6.1 Logistic 模型建立 依據(jù)試驗設(shè)計選取90例數(shù)據(jù)為訓練集用來建立模型，Logistic 模型如式1 所示[17]：

式中：p——生長／非生長概率；bi（0～9）——擬合參數(shù)；Na——鹽分（V/V）。

1.6.2 PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立 PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型是基于Bayes 分類規(guī)則與Parzen 窗的概率密度函數(shù)估計方法發(fā)展而來的一種并行算法[18-19]。

將試驗數(shù)據(jù)歸一化后，依據(jù)試驗設(shè)計選取90例數(shù)據(jù)，鹽分、pH 和aw 作為三維向量進入輸入層，在Matlab 軟件中進行訓練，輸出層神經(jīng)元設(shè)定為1，結(jié)構(gòu)概率≤0.5 的記作1 類非生長，＞0.5的記作2 類生長。訓練完成后剩余30 例數(shù)據(jù)作為驗證輸入，驗證訓練模型的準確性。

1.7 模型擬合優(yōu)度及預(yù)測力評價

1.7.1 擬合優(yōu)度評價Logistic 模型 擬合優(yōu)度采用似然比測試（-2lnL，the likehood test）、赤池信息準則（AIC=-2lnL+2k，Akaike's information criterion）、Hosmer-Lemeshow 測 試 （HL）和R2-Nagelkerke 進行評價。-2lnL、AIC 常用于模型擬合優(yōu)度評判，數(shù)值越小，證明擬合效果越好。Hosmer-Lemeshow 用于評估模型任意數(shù)量的連續(xù)與分散的解釋變量的擬合優(yōu)度，數(shù)值越小，擬合效果越好，但無法將標準偏差納入考慮，一個不理想的預(yù)測值亦可能導致該值的升高，故常結(jié)合R2-Nagelkerke 值一起考慮，R2-Nagelkerke 值主要反映了解釋變量與響應(yīng)變量間的關(guān)系，其值越接近1，擬合優(yōu)度越好。

1.7.2 預(yù)測力評價 Logistic 模型與PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測力采用C-matrix 獲得的一致率（Fraction correct，F(xiàn)C）和假陽性率 （False alarm rate，F(xiàn)AR）進行比較，F(xiàn)C 值越接近于100%說明預(yù)測效果越好，F(xiàn)C 值為預(yù)測值與實際值的吻合度，F(xiàn)AR 為假陽性錯判率，可作為模型的預(yù)測準確度的參考。公式如下：

1.8 模型驗證

選取30 例數(shù)據(jù)為驗證集對模型進行驗證，帶入建立的Logistic 模型與PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中，采用FC%和FAR%模型驗證的準確率和預(yù)測力進行評價。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS18.0（美國IBM 公司）對模型進行擬合模型，通過Origin9.0（美國OriginLab 公司）繪制生長／非生長曲線，PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立采用MatlabR2016b 進行建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗希瓦氏菌生長／非生長模型建立

2.1.1 Logistic 生長／非生長模型建立 腐敗希瓦氏菌Logistic 回歸模型的擬合參數(shù)如表2所示。對于二階線性Logistic 方程，aw、鹽分和pH2和aw2的作用對其生長情況有顯著影響（P＜0.01），其余參數(shù)在計算時差異性不顯著，故剔除，腐敗希瓦氏菌logistic 生長/非生長模型見式5：

二階線性logistic 方程：

表2 Logistic 生長/非生長模型擬合參數(shù)Table 2 The parameters of the Logistic models

2.1.2 PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)生長／非生長模型建立采用PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，建立了腐敗希瓦氏菌隱含層數(shù)2，輸出層神經(jīng)元1 的PNN 模型。通過隨機選取80%的數(shù)據(jù)訓練網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)訓練最優(yōu)時間為0.1 s，得到PNN 模型，剩余20%數(shù)據(jù)再帶入PNN 模型進行驗證。PNN 網(wǎng)絡(luò)測試診斷結(jié)果顯示，30 例驗證數(shù)據(jù)中有26 例數(shù)據(jù)符合試驗情況分類，準確率為86.67%。

2.1.3 兩種生長/非生長模型預(yù)測效果比較 腐敗希瓦氏菌二階線性logistic 方程訓練集和驗證集的FC 為93.8%與100%，F(xiàn)AR 分別為6%和0%，R2-Nagelkerke 為0.90，Hosmer-Lemeshow 的χ2=0.64 （P=1，Df=8），R2-Nagelkerke 參數(shù)接近1，且Hosmer-Lemeshow 參數(shù)值較小，說明該模型擬合優(yōu)度良好[16，20]。陳琛等[9]利用二階線性logistic方程建立了環(huán)境因子交互作用下蠟樣芽孢桿菌生長/非生長模型，結(jié)果顯示logistic 回歸模型擬合優(yōu)度較高，具有較廣的適用范圍，可避免對大系數(shù)的過度擬合，結(jié)果與本研究測試相符。

PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型訓練集一致率為100%，驗證集FC 為86.67%，但驗證集的FAR 比Logistic 模型高出6.25%。PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型能短時間內(nèi)對生長/非生長數(shù)據(jù)進行快速分類，且總體準確率較高，但僅能對生長/非生長數(shù)據(jù)進行分類，無法準確給出生長/非生長界面，僅能輸出生長概率0 和1 的數(shù)值，即無法給出具體細致的生長概率，但其快速分類功能可為工業(yè)生產(chǎn)提供便利。M.Hajmeer[21]對大腸埃希氏菌（Escherichia coli R31）生長/非生長研究顯示，同一組內(nèi)基于PNN 的模型比基于FEBANN （Feedforward error backpropagation artificial neural networks）的模型更精確，且基于二階logistic 回歸模型比線性模型更準確，而處理分類問題時PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型更優(yōu)?？赡苡捎谘芯繉ο蟮牟町悾疚幕赑NN人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的驗證集準確率低于Logistic模型。兩種模型擬合優(yōu)度和預(yù)測力比較如表3所示。

表3 兩種生長/非生長模型擬合優(yōu)度和預(yù)測力比較Table 3 Comparison of goodness of fit and predictive power of two growth / non-growth models

2.2 環(huán)境因子對腐敗希瓦氏菌生長概率的影響

2.2.1 鹽分對腐敗希瓦氏菌生長概率的影響 圖1（a～d）為鹽分1.0%～4.0%，腐敗希瓦氏菌生長概率預(yù)測值。圖1Logistic 模型預(yù)測曲線 （實線）顯示：鹽分1.0%，aw0.96 和0.94 時，生長概率隨pH的增大而增大，最終生長概率達到1；aw0.92 和0.91 時，生長概率在pH 5.2 和6.4 時開始增大，最終生長概率到達1 和0.45；鹽分1.0%，aw0.90時，無論pH 如何變化，該交互作用下腐敗希瓦氏菌均不生長。虛線為PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的預(yù)測情況，變化趨勢與實線近似，生長概率≤0.5 時視作非生長，＞0.5 時視為生長，沒有緩慢變化區(qū)域，生長概率直接從0 上升到1。aw0.92，pH=5.9處出現(xiàn)拐點，生長概率預(yù)測值從0 上升到1。

鹽分2.0%時，實線顯示aw0.96，0.94 和0.92時，生長概率隨pH 增大逐漸增大，最終達到1；aw0.91 時，生長概率從pH 6.5 時開始增大，pH 7時達到1；鹽分2.0%，aw0.90 時，無論pH 如何變化，該交互作用下腐敗希瓦氏菌均不生長。圖1虛線在aw 0.92，pH＜6.5 時預(yù)測與實線不完全統(tǒng)一，在pH 6.2 時實線預(yù)測的概率＞0.5，但虛線預(yù)測仍為0，其差別原因可能是由于2 種建模方式的個體差異、訓練集數(shù)據(jù)的選取差異等造成的。

鹽分3.0%和4.0%時，實線顯示aw 0.91 時，生長概率分別在pH 6.7 和6.9 時開始增大，最終到達0.06 和0.02。鹽分越高，pH 與aw 的交互作用逐漸加強，腐敗希瓦氏菌不適宜生長，生長界限開始變化點趨于高pH 范圍，高鹽分對腐敗希瓦氏菌有生長抑制作用，其趨勢與虛線相同。

圖1 2 種模型鹽分作用下腐敗希瓦氏菌生長概率預(yù)測值Fig.1 The influence of the growth probability of Shewanella putrefaciens by salty with two models

修艷輝等[5]對環(huán)境單因子對腐敗希瓦氏菌生長/非生長界限做了研究，表明25 ℃時生長概率隨鹽分的增加而逐漸降低，當鹽分≥12%時腐敗希瓦氏菌均不生長，與本研究結(jié)果趨勢相符，但由于其為單因素試驗故有一定差異。研究顯示[22]Shewanella amazonensis 細胞膜成分變化可能是高NaCl 脅迫的間接生理響應(yīng)，當NaCl 為9.35%時，生長速率被抑制至原來的50%。隨著鹽分的增長，腐敗希瓦氏菌生長受到抑制，生長界限向高pH、高aw 方向偏移；aw≤0.91 時，均不生長。

2.2.2 aw 對腐敗希瓦氏菌生長概率的影響 圖2（a～d）中l(wèi)ogistic 模型預(yù)測曲線（實線）為腐敗希瓦氏菌，aw 對腐敗希瓦氏菌生長概率影響預(yù)測值。aw0.90 時，該交互作用下腐敗希瓦氏菌均不生長。aw0.91 時，鹽分1.0%～4.0%條件下，生長概率在pH=6.4，6.5，6.7 和6.9 時開始增大，最終生長概率分別達到0.45，0.19，0.06 和0.02，該交互作用下腐敗希瓦氏菌生長概率很低，生長基本受到抑制。aw0.92，0.94 和0.96 時，生長概率受鹽分影響逐漸減小，隨pH 增大而增大，生長概率上升變化陡峭。aw 越高，pH 與鹽分的交互作用就被減弱，腐敗希瓦氏菌越適宜生長。

圖2中PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測結(jié)果（虛線），與Logistic 模型預(yù)測曲線結(jié)果相似，生長/非生長0，1 分界點在Logistic 模型預(yù)測曲線中位于生長概率0.5 附近，將生長概率＜0.5 的情況視作不生長，無法觀測到水分活度0.91 時，pH 大于6.5 之后的生長概率變化，實際生長概率有小幅上升趨勢。aw0.92 時，鹽分1%～4%條件下，分別在pH=6.0，6.3，6.4，6.5 處出現(xiàn)拐點，生長概率預(yù)測值由0變?yōu)?；aw0.94，0.96 變化趨勢與實線相似。

aw 反映水分與食品結(jié)合程度，是微生物酶和化學反應(yīng)能觸及的水分，是微生物生長繁殖的重要因素[23]，學者[24]利用山雞椒油改變產(chǎn)品aw，顯示濃度越高腐敗菌抑菌圈直徑越大，且破壞細胞結(jié)構(gòu)，抑制糖類和蛋白質(zhì)的消耗，抑制琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶活性，需要對aw 對腐敗菌生長抑制機制進行深入研究。

圖2 2 種模型下aw 對腐敗希瓦氏菌生長概率影響預(yù)測值對比Fig.2 The influence of the growth probability of Shewanella putrefaciens by water activity under two models

2.2.3 pH 值對腐敗希瓦氏菌生長概率的影響圖3（a～f）為pH=4.5～7.0 時，腐敗希瓦氏菌生長概率影響預(yù)測值。圖中實線為Logistic 模型預(yù)測的生長/非生長曲線，其中pH 4.5 時，腐敗希瓦氏菌的生長受到強烈抑制。pH 5.0 時，aw=0.96 且鹽分≤3%生長概率大于0.5。pH 5.5 時，aw0.96，0.94 時，隨鹽分增長腐敗希瓦氏菌生長概率從1.00 下降到0.86，其余水分活度均不生長。pH 6.0 時，aw＞0.92 條件下生長概率均為1，aw0.92 條件下，生長概率隨鹽分增大而下降，aw＜0.92 條件下均不生長。pH 6.5 與7.0 時，隨鹽分的增大腐敗希瓦氏菌的生長概率在aw0.92 與0.91 時逐漸遞減。圖3（a～f）虛線為PNN 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測曲線，與logistic模型預(yù)測曲線結(jié)果相似，但無法表示生長概率變化的范圍及過程，僅可顯示拐點。pH 5.0，aw=0.96，鹽分3%時以及pH 6.5，aw=0.92，鹽分4%為生長概率預(yù)測值拐點，生長概率從1 變?yōu)?。

Jung-HoonYoon 等[25]研究顯示希瓦氏菌屬最適生長pH 值在7.0 到8.0 之間，與本研究結(jié)果一致。研究[26]表明pH 變化會影響腐敗希瓦氏菌表面超微結(jié)構(gòu)，改變揚氏模量和細胞彈簧常數(shù)，pH 減小會導致細胞壁厚度變小，破壞細胞膜完整性。在生產(chǎn)過程中可適當添加有機酸調(diào)節(jié)pH，其抑菌機理包括能量競爭、透化細菌外膜、提高胞內(nèi)滲透壓、抑制生物大分子合成和誘導宿主產(chǎn)生抗菌肽等作用[27]，腐敗希瓦氏菌生長概率隨pH 減小而減小，其生長概率作用機理有待深入研究。

3 結(jié)論

1）建立了腐敗希瓦氏菌二階線性Logistic 模型和PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型來預(yù)測其生長/非生長情況。二階線性logistic 模型和PNN 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的訓練集一致率分別為93.80%和100.00%，驗證集一致率分別為100.00%和86.67%。PNN 網(wǎng)絡(luò)能對生長/非生長數(shù)據(jù)進行快速分類，但二階線性logistic 模型能更好的反映腐敗希瓦氏菌的生長概率預(yù)測，生長/非生長模型為：

圖3 2 種模型下pH 對腐敗希瓦氏菌生長概率影響預(yù)測值對比Fig.3 The influence of the growth probability of Shewanella putrefaciensby pH under two models

logit（P）=-9 847.799+20 712.603×aw-1.237×NaCl+0.567×pH2-10 901.375×aw2

2）隨著鹽分增長，腐敗希瓦氏菌生長/非生長界限小幅度向高aw，高pH 方向移動，高鹽分對腐敗希瓦氏菌有生長抑制作用。aw≤0.91 時，菌株均不生長，aw=0.92，0.94 和0.96 時，腐敗希瓦氏菌生長概率隨pH 增大而增大，上升變化陡峭。pH=4.5 時，腐敗希瓦氏菌基本不生長，隨pH 升高，高aw 情況下的生長概率先增長到1。