EPA藻油微膠囊工藝及其制備過程中脂肪酸組成的變化

劉小亞 萬仁口 范亞葦 肖俊勇 從仁懷 鄧澤元*

（1 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047 2 中國無限極有限公司 廣州510000）

海藻油是指從海洋藻類中提取的脂質(zhì)，其最大的特點是富含亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸（Eieosapentaenoicaeid，EPA）、二十二碳六烯酸（Doeosahexaenoicaeid，DHA）等多不飽和脂肪酸（PUFA）[1-2]，其中EPA 和DHA 含量高達50%以上。純EPA 和DHA 常溫下均為無色無味液體，脂溶性，易溶于有機溶劑，不溶于水，熔點分別為-54～-53 ℃和-45.5～-44.1 ℃，低溫下仍能保持較高流動性[5]。EPA 和DHA 屬ω3-系列多不飽和脂肪酸，人體不能自身合成[3～4]。DHA 是人腦的重要組成部分之一，在神經(jīng)原表層高度富集，約占腦細(xì)胞中脂肪酸總量的10%，在胎兒大腦形成及心血管系統(tǒng)的生成中起著重要作用；且能夠有效抑制血小板凝集，減少血栓素的形成，有預(yù)防心肌梗塞、腦血栓等功效。EPA 和DHA 均有明顯的降血脂效應(yīng)，主要表現(xiàn)在降低血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白，升高血清密度。一般認(rèn)為，其降血脂和預(yù)防動脈粥樣硬化的機理是增加膽固醇從肝臟的排泄，抑制內(nèi)源性膽固醇合成，改變脂蛋白中脂肪酸的組成，從而增加其流動性，減少極低密度脂蛋白中甘油三酯的合成[7]。EPA 和DHA 亦有抑制乳腺癌、胃癌、膀胱癌及子宮癌等作用，能明顯抑制腫瘤的發(fā)生，成長和轉(zhuǎn)移速度[8]。

EPA 和DHA 化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，能發(fā)生縮合、聚合、鹵化、氧化、氫化、脫水、脫羧及異構(gòu)化等反應(yīng)，得到一系列衍生物[6]。EPA 和DHA 對光、熱、氧等因素不穩(wěn)定，極易氧化，氧化海藻油不但使生理活性功能喪失，還會對人體健康造成損害[9-10]。通過微膠囊技術(shù) （microencapsulation technology）保護EPA 和DHA 等FUFA 是食品工業(yè)的重要手段。

微膠囊技術(shù)是指通過特定的工藝手段將固體、氣體或液體包裹在一個微小密閉的膠囊之中的技術(shù)。被包裹的物質(zhì)稱之為芯材，包裹物質(zhì)稱之為壁材?？勺鳛槲⒛z囊壁材的物質(zhì)很多，最常用的是高分子材料，主要分為天然高分子材料、半合成高分子材料和全合成高分子材料。天然高分子材料有著無毒、穩(wěn)定、成膜性好等優(yōu)點，常用主要是碳水化合物（辛烯基琥珀酸淀粉酯、玉米淀粉、小麥淀粉、馬鈴薯淀粉等）和蛋白質(zhì)類（乳清分離蛋白、大豆分離蛋白、酪蛋白等）和植物膠[11]。微膠囊的直徑一般在5～200 μm，壁厚為0.5～150 μm[12]，對被包裹的芯材物質(zhì)起到保護作用，延長了貯藏期。可將液態(tài)物料通過微膠囊技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w粉末，提高了產(chǎn)品的流動性，便于運輸[13]。噴霧干燥法是目前國內(nèi)外使用最普遍的微膠囊技術(shù)[14-16]。其特點是噴霧干燥時間短，產(chǎn)品可免于長時間受熱，適用于許多熱敏性材料[17]。

乳清分離蛋白作為微膠囊壁材，主要是由于蛋白質(zhì)分子中親水親油殘基易形成乳狀液，且有良好的成膜性及形成膜的通透性[18]。辛烯基琥珀酸酯化淀粉HI-CAP100 是由淀粉中少量羥基接上了辛烯基琥珀酸酯基制備而成的[19]。親水性的淀粉加上親油性的長鏈烯基后，使得淀粉具有親水和親油的兩性性質(zhì)，產(chǎn)品具有很好的乳化性[20]。可在水包油型（O/W）乳狀液的油水界面上定向形成一層堅韌、連續(xù)且不容易破裂的界面膜，從而達到穩(wěn)定乳狀液的效果。

本研究采用噴霧干燥技術(shù)固化EPA 藻油（EPA 和DHA 含量高達54.79%），以乳清分離蛋白、HI-CAP100 和麥芽糊精DE20 為壁材，通過篩選復(fù)合壁材比例、乳化劑用量、固形物含量、投油量、均質(zhì)壓力及次數(shù)和進出風(fēng)溫度等，以包埋率和微膠囊性質(zhì)為指標(biāo)，確定最佳壁材比例和工藝條件，并測定工藝過程中EPA 藻油脂肪酸組成變化，為富含不飽和脂肪酸油脂微膠囊技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

型號為O55-O100 的EPA 藻油（EPA 18.3%，DHA 36.2%），由廣州市無限極有限公司提供。HI-CAP100 ，國民淀粉有限公司；麥芽糊精，山東西王糖業(yè)有限公司；蒸餾單硬脂酸甘油酯，江蘇省南通市佳力士添加劑（海安）有限公司；L-抗壞血酸棕櫚酸酯，鄭州高研生物科技有限公司；迷迭香提取物，河南聚榮化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：正己烷，乙酸甲酯、乙酸乙酯，上?；瘜W(xué)試劑公司；蒸餾水、石油醚、氯仿、甲醇、甲醇鈉/甲醇溶液、石油醚、草酸-乙酸甲酯、無水Na-SO4，上海西隴化工股份有限公司；甲醇、乙腈、正己烷（均為色譜純），美國Tedia 公司；α-淀粉酶，阿拉丁試劑有限公司。

主要儀器：GYM 60-6S 型均質(zhì)機，上海東華高壓均質(zhì)機廠；MDRP-50 型噴霧塔，無錫市現(xiàn)代噴霧干燥機；HJ-3 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，常州國華電器有限公司；AR1140 電子分析天平，美國奧豪斯貿(mào)易公司；6890N 氣相色譜，美國安捷倫公司；Anke TDL-5-A 低速大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；RE-52 智能旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；Zatasizer nano zs90 粒度和電位測量儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；JSM 6701F 場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀 （SEM），日本日立公司；DSY-Ⅲ氮吹儀，北京金科科技公司；KL-UP-Ⅲ-10 超純水制備機，臺灣艾柯實驗專業(yè)純水設(shè)備廠；HH-S11 型恒溫水浴鍋，太倉科教器材廠。

1.3 方法

1.3.1 EPA 藻油微膠囊的制備工藝流程

1.3.2 乳液穩(wěn)定性評估

1.3.2.1 乳液穩(wěn)定性[21]取一定量的初乳狀液于10 mL 離心管中，放置60 ℃恒溫水浴箱中恒溫5 min，在4 200 r/min 下離心5 min，觀察分層情況，記錄離心體積以確定乳狀液的穩(wěn)定性。

乳狀液的穩(wěn)定性（%）=（1-上層液體積/液體總體積）×100

1.3.2.2 乳液平均粒徑 采用馬爾文Mastersizer Micro 激光衍射粒度分布儀，通過接受和測量散射光的能量分布，測得微膠囊的粒度分布及平均粒徑。激光器波長：633 nm，最小樣品體積：0.75 mL；溫度范圍：25 ℃。

1.3.3 微膠囊包埋率的測定

1.3.3.1 微膠囊表面油測定 準(zhǔn)確稱取2 g 樣品（準(zhǔn)確至0.001 g）m 至恒重的三角瓶m1中，加入15 mL 石油醚（沸程30～60 ℃），不時振蕩，提取10 min，用濾紙過濾樣品，浸提3 次后用10 mL 石油醚洗滌三角瓶和濾紙，合并濾液于已干燥稱重的雞心瓶中，于30 ℃真空旋干，冷卻稱重m2。

表面油含量%=（m2-m1）/m×100

1.3.3.2 總油測定 準(zhǔn)確稱取2 g 藻油微膠囊，溶于10 mL 60 ℃熱水，加入α-淀粉酶，60 ℃水浴10 min，將微膠囊壁材中淀粉水解，釋放藻油。冷卻后加入氯仿/甲醇（15/30 mL）混合液，振蕩10 min后，加入15 mL 氯仿振蕩2 min，加入15 mL 蒸餾水振蕩5 min，倒入離心杯中在4 200 r/min 下離心5 min，取下層液置已干燥稱重的圓底燒瓶，30 ℃真空旋干。

1.3.3.3 包埋率

包埋率%=[（總油含量-表面油含量）/總油含量]×100%

1.3.4 微膠囊物理性質(zhì)評價

1.3.4.1 水分含量 GB50093-2010 105 ℃恒重法

1.3.4.2 休止角 將大孔漏斗固定于鐵架臺上，正下方放入A4 紙，將微膠囊粉末緩慢均勻地從漏斗上方倒入正下方白紙上，直至所堆積錐體高度不再增高，測定椎體的底面半徑及高度，測定休止角。

1.3.4.3 松緊密度[22]將一定質(zhì)量的微膠囊粉末在不施加任何外力的情況下緩慢均勻地加入帶有刻度的量筒中，測定其松體積，通過外力作用振實后測定其緊體積，計算其松緊密度。

1.3.4.4 表面形態(tài)觀察[23]采用電子掃描顯微鏡（SEM）觀察EPA 藻油微囊粉末表面形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。首先在樣品臺上貼一層雙面膠，將微膠囊粉末薄薄撒在樣品臺上，并用吸耳球吹去多余的粉末，輕壓粉末使粉末一部分陷入雙面膠的膠基中，

用刀片輕刮雙面膠表面粉末，然后用電子掃描顯微鏡觀察微膠囊產(chǎn)品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，加速電壓為20 kV。

1.3.5 脂肪酸組成的測定[24]樣品甲酯化取2 mg油脂，加入1.5 mL 的正己烷，渦流30 s，再加40 μL 乙酸甲酯與100 μL 甲醇鈉/甲醇溶液，渦流30 s，在37 ℃條件下反應(yīng)20 min，然后置于-20 ℃條件下冷凍10 min，取出后迅速加入60 μL 的草酸-乙酸甲酯，離心取上清液200 μL，N2吹干，加1 mL 正己烷溶解，進行氣相色譜分析。

測定條件為：色譜柱采用CP-7489 毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；載氣為H2，燃?xì)鉃镹2、H2和空氣；進樣口溫度為250 ℃，壓力為24.52 Pa，總流量為29.4 mL/min；氣相柱的柱壓為24.52 Pa，柱內(nèi)流速為1.8 mL/min；爐溫程序升溫：45 ℃條件下保持4 min，然后以13 ℃/min 的速率升至175 ℃保持27 min，后以4 ℃/min 的速率升至215℃保持35 min，總測定時間為86 min；檢測器的溫度為250 ℃，H2流速為30.0 mL/min；空氣流速為300 mL/min；N2流速為30.0 mL/min。通過與脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)對照，采用面積歸一化法確定脂肪酸的百分含量（以峰值面積的百分比表示）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有測定均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均數(shù)±方差（x±s）表示。采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件，經(jīng)單因素方差分析，比較均值，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 EPA 藻油微膠囊配方及工藝選擇

2.1.1 壁材比例的選擇 在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，我們選擇HI-CAP100、乳清分離蛋白和麥芽糊精5 種比例進行試驗。由圖1可知，他們比例為4 ∶4 ∶1，2 ∶2 ∶1，1 ∶1 ∶2 時，包埋率均在90%以上，分別為96.10%，96.23%，92.52%，其中比例為2 ∶2 ∶1 時包埋率較高，且顯著大于比例為1 ∶1 ∶2，1 ∶1 ∶4（72.33%），1 ∶1 ∶8（69.51%）時包埋率。原因可能是HI-CAP100 與乳清分離蛋白均為兩親性大分子，加入一定比例小分子麥芽糊精可填充大分子交聯(lián)空隙，提高包埋率，但小分子過量時，因其不具備兩親性，且不能形成大分子框架壁囊結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致包埋率降低。本研究最佳壁材比例為2 ∶2 ∶1。

圖1 不同壁材比例EPA 藻油微膠囊包埋率差異Fig.1 Difference in embedding rate of EPA algal oil microcapsules with different wall materials

2.1.2 乳化劑比例的選擇 由圖2可知，隨著單甘脂添加量的增加，微膠囊包埋率逐漸下降，添加量為0.1%～2%時，包埋率均在96.53%以上，且沒有顯著性差異；添加量為3%和4%時，包埋率顯著降低（86.09%和83.6%）。乳液平均粒徑隨著單甘脂添加量的增加先減少后增加，添加量為1%時，乳液平均粒徑最小，此時分散最均勻，乳液穩(wěn)定性最高。由圖2可得結(jié)論，乳液平均粒徑越小，乳液越穩(wěn)定，所得微膠囊包埋率越高，原因在于過少單甘脂乳化性較差，不能形成穩(wěn)定的乳液；過量單甘脂使大分子壁材過度聚集，形成絮凝，降低乳液穩(wěn)定性。故本研究單甘脂最佳添加量為1%。

圖2 不同單甘脂添加量對包埋率和乳液平均粒徑的影響Fig.2 Effects of different monoglyceride content on embedding rate and average particle size of emulsion

圖3 載油量對包埋率的影響Fig.3 Influence of oil load on embedding rate

2.1.3 載油量的選擇 由圖3可知，包埋率隨著載油量的增加逐漸降低。載油量為30%，35%，40%，45%，50%時，包埋率分別為97.03%，96.61%，95.61%，93.68%，92.88%。載油量30%時包埋率最高，后期可根據(jù)實際需求確定載油量。

2.1.4 固形物含量選擇 由圖4可知，當(dāng)固形物含量低于40%時，包埋率無顯著性差異，均在96.52%～96.89%之間。說明一定濃度的固形物含量對包埋率無顯著影響；當(dāng)固形物含量為45%和50%時，包埋率明顯提高，但由于制作乳液過程中黏度較大，影響試驗的進行，故固形物含量低于40%為宜。

2.1.5 均質(zhì)壓力的選擇 由圖5可知，均質(zhì)壓力在20～35 mPa 之間，包埋率隨著壓力升高而升高，高于35 mPa 時，包埋率有所下降。在35 mPa 時包埋率最高（97.55%），20 mPa 時包埋率僅有91.53%。出現(xiàn)此種現(xiàn)象與乳液的剪切破碎程度有關(guān)。

2.1.6 均質(zhì)次數(shù)的選擇 由圖6可知，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加包埋率顯著增高。均質(zhì)3 和4 次包埋率分別為96.27%和95.75%，顯著高于均質(zhì)1 次和2 次（88.75%和92.92%）。均質(zhì)次數(shù)增多，乳液的剪切破碎程度越高，壁材和芯材結(jié)合更牢固，包埋率越高，選擇均質(zhì)3 次。

圖4 固形物含量對包埋率的影響Fig.4 Influence of solid content on embedding rate

圖5 均質(zhì)壓力對包埋率的影響Fig.5 Influence of homogeneous pressure on embedding rate

圖7 進出風(fēng)溫度對微膠囊包埋率及水分含量的影響Fig.7 Influence of inlet and outlet wind temperature on encapsulation rate and moisture content of microcapsules

2.1.7 進出風(fēng)溫度的選擇 由圖7可知，進風(fēng)溫度為160～200 ℃時，包埋率無明顯差異，均在96.89%～97.55%之間，160 ℃時微膠囊水分含量明顯高于其它進風(fēng)溫度；出風(fēng)溫度為60 ℃時，其包埋率（92.94%）顯著低于其它（96.78%～97.79%），但水分含量隨著出風(fēng)溫度的升高顯著降低，當(dāng)出風(fēng)溫度為100 ℃時，水分含量僅有0.71%。此結(jié)果說明，進風(fēng)溫度對微膠囊包埋率和水分無顯著影響，出風(fēng)溫度對二者影響顯著。即最佳進風(fēng)溫度為185～195 ℃，出風(fēng)溫度為90～100 ℃。

2.2 最佳配方及工藝條件下，EPA 藻油乳液穩(wěn)定性及微膠囊物理性質(zhì)研究

2.2.1 物理性質(zhì) 由表1可知，EPA 藻油乳液的穩(wěn)定性為100%，平均粒徑較?。?03.2 nm），且分散集中，乳液整體穩(wěn)定性好；微膠囊包埋率高達97.47%，水分較少，為后期的儲藏穩(wěn)定性奠定基礎(chǔ)，且流動性好，緊密度大（0.686 g/mL），便于包裝盒運輸。

表1 EPA 藻油乳液穩(wěn)定性及微膠囊物理性質(zhì)Table 1 Stability of EPA alga oil emulsion and physical properties of microcapsules

2.2.2 表面形態(tài) 由圖8a，b，c 可知，EPA 藻油微膠囊呈現(xiàn)不規(guī)則話梅狀，表面有部分凹陷和褶皺，且大小在10～70 μm 之間，分布較均勻，幾乎無破損；壁囊橫切面致密，無明顯空隙，防止藻油與外界環(huán)境接觸，起到很好的保護作用。

圖8 微膠囊及囊壁橫切面表面形態(tài)Fig.8 Surface and cross section morphology of microcapsules

2.3 EPA 藻油微膠囊制備過程中脂肪酸組成變化

由表2可知，分別測定原油及其在乳化，分散，均質(zhì)和噴霧干燥過程中脂肪酸組成變化。相較于原油，EPA、DHA、SFA、MUFA、PUFA 和TFA 含量在噴霧干燥之前乳化均質(zhì)過程中無顯著降低，噴霧干燥后EPA 僅降低了2.021%，DHA 顯著降低了1.627%，SFA 增加了3.766%，MUFA 增加了0.439%，PUFA 減少了4.115%，TFA 增加了0.58%。PUFA 氧化水解后生成SFA，MUFA 和TFA。EPA 藻油脂肪酸在微膠囊制作過程中有一定的氧化，但氧化程度較輕。

表2 微膠囊制備過程中脂肪酸組成變化（%）Table 2 Changes of fatty acid composition during preparation of microcapsules （%）

（續(xù)表2）

3 討論

采用噴霧干燥法包埋富含PUFA 油脂時，不同配方和工藝對其微膠囊包埋率及性質(zhì)影響較大。本研究中，以乳清分離蛋白，辛烯基琥珀酸淀粉鈉（HI-CAP100），麥芽糊精（DE20）組合為壁材，包埋率高達96.10%，高于以辛烯基琥珀酸淀粉酯與阿拉伯膠壁材包埋魚油（74.96%）[25]，以乳清分離蛋白和麥芽糊精為壁材（62.3%）包埋亞麻籽油[26]，以阿拉伯膠為壁材包埋亞麻籽油（88.7%）[27]的包埋率，原因在于本研究中大豆分離蛋白和HI-CAP100 形成穩(wěn)定兩性大分子構(gòu)架，DE20 的麥芽糊精充分填充大分子構(gòu)架中空隙，使乳液更穩(wěn)定，水相、油相和壁材結(jié)合更牢固，從而提高EPA 藻油包埋率。EPA 藻油微膠囊水分含量僅為1.067%，低于Estefanía Jiménez-Martín（4.75%）的魚油微膠囊[28]的水分含量，便于加工和儲存；囊壁致密，而Carneiro[26]、Renata V.Tonon[27]、Sri Haryani Anwar[29]等研究微膠囊壁囊有較多的空隙，不利于后期的儲藏穩(wěn)定性。由以上可知，本研究微膠囊化配方和工藝對EPA 藻油較好的保護作用，便于其儲藏和運輸。

4 結(jié)論

壁材對微膠囊包埋效果影響較大，采用兩性大分子和小分子結(jié)合壁材所形成的微膠囊囊壁較致密，二者起到互補作用，辛烯基琥珀酸淀粉鈉黏度低，與大豆分離蛋白組合提高了乳液固形物含量，從而降低商業(yè)成本。以抗壞血酸棕櫚酸酯和迷迭香提取物為抗氧化劑，可較大程度保護噴霧干燥過程中富含PUFA 的油脂有效成分，其組合與其它抗氧化劑在儲藏過程中的抗氧化效果將進一步研究。