南極羅斯海沉積物中可培養(yǎng)菌株的分離及胞外水解酶活性檢測

王飛 叢柏林 張朝暉 楊黃浩

研究論文

南極羅斯海沉積物中可培養(yǎng)菌株的分離及胞外水解酶活性檢測

王飛1叢柏林2張朝暉2楊黃浩1

(1福州大學, 福建 福州 350108;2自然資源部第一海洋研究所, 山東 青島 266061)

研究了南極羅斯海地區(qū)沉積物中可培養(yǎng)微生物多樣性, 并檢測了菌株胞外酶活性, 為開發(fā)利用南極資源奠定基礎(chǔ)。采用Zobell 2216E培養(yǎng)基、土豆培養(yǎng)基(PDA)及稀釋平板劃線法分離并獲得純培養(yǎng)的細菌和真菌, 分別通過16S rDNA、18S/ITS序列鑒定分析了可培養(yǎng)微生物的多樣性和系統(tǒng)發(fā)育。從南極羅斯海沉積物樣品中獲得78株細菌和54株真菌, 細菌、真菌的優(yōu)勢菌株分別為嗜冷桿菌屬()、枝孢屬(); 78株細菌菌株中有2株與模式菌株的16S rDNA基因序列相似性小于97%, 可能是潛在的細菌新物種。細菌API20NE生理生化和真菌產(chǎn)胞外酶活性結(jié)果表明, 獲得的細菌和真菌大多數(shù)可檢測到胞外水解酶活性。本研究豐富了南極可培養(yǎng)微生物資源, 為南極羅斯海地區(qū)可培養(yǎng)微生物的多樣性研究以及南極微生物資源的應用研究奠定了基礎(chǔ)。

南極羅斯海 可培養(yǎng)菌株 胞外酶

0 引言

南極位于地球的最南端, 由陸地和海洋兩部分構(gòu)成, 終年被冰雪覆蓋, 氣候酷寒干燥、強光輻射、鹽度變化大, 是地球上最冷最干的地區(qū)[1]。由于南極特殊的地理位置和氣候特征, 生存于其中的微生物也具備了獨特的生物學機制和生理生化特性, 如具有耐低溫、耐高鹽、抗輻射等特點。這些微生物可以在低溫下通過調(diào)節(jié)它們的新陳代謝以在嚴酷的南極環(huán)境中繁衍生存[2]。研究南極地區(qū)微生物的多樣性, 特別是獲得可培養(yǎng)的南極微生物資源, 為將來開發(fā)利用南極微生物提供重要的參考依據(jù)[3], 也可以為人類了解低溫微生物在南極自然環(huán)境下的物質(zhì)循環(huán)、生物地球化學過程等提供重要的線索[4]。

由于低溫微生物及其相關(guān)產(chǎn)物如低溫酶類、胞外多糖、色素、抗生素等的研究意義以及它們在現(xiàn)代生物工程中的潛在價值, 近年來對低溫酶的研究已經(jīng)成為研究熱點[5]。低溫酶主要由生活在極地、深海、高山、永凍土等寒冷環(huán)境的低溫微生物產(chǎn)生, 人類已獲得了一些可培養(yǎng)的低溫活性菌株。Olivera等[6]從亞南極埃斯塔多斯島海洋沉積物中分離出了19株產(chǎn)低溫蛋白酶的菌株。另外從南極土壤[7-8]、阿拉斯加凍土[9]以及深層地下水[10]等環(huán)境中分離到產(chǎn)低溫酶的菌株, 并對其基因和酶學特性進行了研究。低溫酶在食品、洗滌劑、化妝品、水產(chǎn)飼料等工業(yè)上被廣泛應用[11-12]。如蛋白酶可被應用于奶酪成熟、牛奶加工、洗滌劑等; 淀粉酶可被應用于果汁加工、蔬菜加工、糖漿制造等[13]。

羅斯海(Ross Sea)位于羅斯海灣北部、南極太平洋扇形區(qū), 是南極地區(qū)最容易接近的邊緣海之一[14]。羅斯海地區(qū)是南極巖石圈、冰凍圈、生物圈和大氣圈相互作用最集中的區(qū)域, 對全球氣候變化響應最敏感, 生態(tài)系統(tǒng)脆弱, 具有重要的研究價值, 是開展科學考察的理想之地。國內(nèi)外學者對羅斯海地區(qū)地質(zhì)、海冰、地球物理、氣候及地球化學等方面做了大量的研究工作, 包括在地震層序[15]、油氣潛力[16]、海冰特征[17]、構(gòu)造演化[18]、古氣候[19]、有機物[20-21]等方面進行了深入探討。但對于羅斯海地區(qū)沉積物中的可培養(yǎng)微生物多樣性及胞外酶活性等方面的研究較少, 本文通過純化培養(yǎng)及分子鑒定, 從南極羅斯海地區(qū)中獲得一批可培養(yǎng)的細菌和真菌, 并對其酶活力進行了鑒定, 評估了其應用潛力, 研究中還發(fā)現(xiàn)了潛在的新的細菌菌種資源。這對于了解南極羅斯海地區(qū)沉積物中可培養(yǎng)微生物的多樣性、發(fā)現(xiàn)新的微生物菌種資源以及開發(fā)利用其特殊的功能基因和生物活性物質(zhì)都具有重要意義。

3 材料與方法

3.1 樣品來源及實驗涉及的儀器及試劑

實驗樣品來源于中國第33次南極科學考察隊的考察地羅斯海地區(qū)的6個采樣點(表1和圖1)。用箱式取樣器采集羅斯海地區(qū)的沉積物, 將沉積物存放于無菌離心管中, 4°C低溫保存。

表1 樣品采集站位信息

實驗中所使用的主要儀器及試劑有: SW-CJ 超凈工作臺(蘇州安提空氣技術(shù)有限公司)、SPX 系列生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)、ELGA超純水儀(英國ELGA公司)、XW-80A 旋渦振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、D3024離心機(Eppendorf有限公司)、YXQG02高壓蒸汽滅菌鍋(致微儀器有限公司)、細菌DNA提取試劑盒(中國天根生化科技有限公司)、真菌DNA提取試劑盒(北京方程生物科技有限公司)、API20NE (bioMerieux, 法國)、PCR反應試劑(大連寶生物工程有限公司)。

圖1 樣品采集站位圖

Fig. 1. Sample collection stations

1.2 培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)基(2216E培養(yǎng)基): 蛋白胨5 g, 酵母粉1 g, 瓊脂18 g, 陳海水1 000 mL, 高溫高壓滅菌20 min。真菌培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基): 土豆200 g, 葡萄糖10 g, 瓊脂17 g, 陳海水1 000 mL, 高溫高壓濕熱滅菌20 min。產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別為: 產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基[22], 產(chǎn)酪蛋白酶培養(yǎng)基[23], 產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基[24]。

1.3 細菌、真菌的分離培養(yǎng)及菌種保藏

將采集的南極沉積物樣品稱取約1 g于10 mL無菌海水中, 取5 mL混勻后的樣品懸液加到等體積無菌海水中, 混勻靜置過夜。

將預處理后的樣品懸液系列稀釋至原來的10–1、10–2、10–3, 分別取100 μL涂布于細菌和真菌培養(yǎng)基平板, 于12℃培養(yǎng)。培養(yǎng)7—10 d后, 根據(jù)菌落形態(tài)、色素、干燥等特征, 挑取形態(tài)差異較大的菌落進行劃線純化。挑取純化后的單菌落, 分別在4°C下用斜面培養(yǎng)基保種和在﹣80°C下用30%甘油保種。

1.4 鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

1.4.1 16S rDNA擴增

按照細菌基因組DNA提取試劑盒(中國天根生化科技有限公司)的操作手冊進行DNA的提取。將提取的DNA作為DNA模板。采用通用引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′及1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,擴增16S rRNA序列[25]。PCR反應體系為: 2×Taq PCRSuperMix(Tiangen)25 μL, 雙蒸水21 μL, 引物各1 μL, 模板DNA 2 μL。PCR反應程序: 94°C預變性5 min, 94°C變性30 s; 55°C退火30 s; 72°C延伸90 s; 30個循環(huán), 最后72°C延伸10 min。

1.4.2 真菌18S/ITS基因序列擴增

將篩選純化的真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7—10 d后, 刮取50 mg左右菌苔, 在研缽中間斷地加入液氮研磨, 參照中國天根生化科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒的操作說明書提取真菌DNA。

18S/ITS區(qū)段的擴增采用通用引物18S/ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和18S/ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(引物由生工生物工程股份有限公司合成)進行擴增。PCR反應體系為: 2×Taq PCRSuperMix(Tiangen)25 μL, 雙蒸水21 μL, 引物各2 μL, 模板DNA 3 μL。擴增程序為: 94°C DNA雙鏈預變性5 min, 94°C變性30 s; 55°C退火30 s; 72°C延伸40 s; 共30個循環(huán), 最后72°C延伸10 min。各取10 μLPCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 有特異性明亮條帶的PCR產(chǎn)物送擎科生物技術(shù)有限公司(山東青島)測序。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測定細菌的16S rDNA和真菌18S/ITS基因序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ blast.cgi), 選擇與GenBank中的參考菌株的16S rDNA 序列進行比較分析。采用MEGA6.0軟件的鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育分析, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[26]。

1.5 胞外水解酶活性檢測

1.5.1 細菌API20NE鑒定

細菌的理化性質(zhì)采用非發(fā)酵G-桿菌鑒定試劑盒API20NE (bioMerieux, 法國)。根據(jù)分子鑒定結(jié)果選取細菌每個種屬的代表性菌株進行測定,操作過程在室溫下進行。具體操作步驟依照API20NE說明書。

1.5.2 真菌產(chǎn)胞外酶活性

(1) 淀粉酶(amylase)活性初篩: 將每一個平板平分成四份, 菌株用滅菌牙簽在淀粉培養(yǎng)基上點種4株, 12°C培養(yǎng)4—7 d, 每天觀察。在菌落周圍滴加新鮮配制的碘液。菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈的說明菌株具有淀粉酶活性, 為陽性, 透明圈的大小表示淀粉酶活性的強弱[27]; 菌落周圍未出現(xiàn)無色透明圈的, 說明菌株無淀粉酶活性, 為陰性。

(2) 酪蛋白酶(caseinase)活性初篩: 將每一個平板平分成四份, 菌株用滅菌牙簽在酪蛋白酶的培養(yǎng)基上點種4株, 12°C培養(yǎng)4—7 d, 每天觀察。在長出菌落的培養(yǎng)基上, 覆蓋40%的三氯乙酸10— 15 min后, 倒去三氯乙酸溶液, 菌落周圍呈現(xiàn)透明圈者說明菌株具有酪蛋白酶活性, 為陽性, 透明圈的大小表示酪蛋白酶活性強弱[28]; 菌落周圍未出現(xiàn)無色透明圈的, 說明菌株無酪蛋白酶活性, 為陰性。

(3) 纖維素酶(cellulase)活性初篩: 將每一個平板平分成四份, 菌株用滅菌牙簽在纖維素酶的培養(yǎng)基上點種4株, 12°C培養(yǎng)4—7 d, 每天觀察。在長出菌落的培養(yǎng)基上, 覆蓋1 mg·mL–1的剛果紅溶液, 靜置10—15 min后, 倒去剛果紅溶液, 加入1 mol·L–1的NaCl溶液, 15 min后倒掉NaCl溶液, 菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈者說明菌株具備纖維素酶活性, 為陽性, 透明圈的大小表示纖維素酶活性強弱[29]; 菌落周圍未出現(xiàn)無色透明圈者說明菌株無纖維素酶活性, 為陰性。

2 結(jié)果

2.1 可培養(yǎng)菌株的分子鑒定

從羅斯海采集的沉積物樣品中分離的微生物, 根據(jù)菌落形態(tài)特征進行純化, 共分離獲得78株細菌、54株真菌, 部分細菌、真菌照片如圖2、圖3所示。分別進行16S rRNA和18S/ITS鑒定, 得到13個屬的78株細菌、5個屬的54株真菌, 具體見表2、表3。

78株細菌中, 嗜冷桿菌屬()為優(yōu)勢類群, 有20株; 黃桿菌屬()17株; 希瓦氏菌屬()14株; 假單胞菌屬()9株; 科貝特氏菌屬()6株; 鹽單胞菌屬()3株; 蘇特氏菌()2株; 噬冷菌()2株; 海旋菌()1株; 類芽胞八疊球菌()1株; 鞘脂菌屬()1株; 動球菌屬()1株; 檸檬胞菌()1株。

54株真菌中, 枝孢屬()為優(yōu)勢類群, 有33株; 鏈格孢屬() 13株; 青霉菌屬() 5株; 殼二孢屬() 2株; 金擔子菌屬() 1株。

圖2 部分細菌菌落圖片. 2Z3: Flavobacterium sp; XB3: Cobetia sp.; 4D1: Shewanella sp.; 6D2: Psychrobacter sp.; XD5: Flavobacterium sp.;5D6: Sphingobium sp.

Fig.2. Partial pictures of bacteria. 2Z3:sp; XB3:sp; 4D1:sp; 6D2:sp; XD5:sp;5D6:sp

圖3 部分真菌菌落圖片. 2D3: Cladosporium sp.;D84: Alternaria sp.; W3: Cladosporium sp.; 2D1: Ascochyta sp.;ZZ2: Cladosporium sp.;D52: Penicillium sp.

Fig.3. Partial pictures of fungi. 2D3:sp;D84:sp; W3:sp; 2D1:sp;ZZ2:sp;D52:sp

表2 羅斯海沉積物中可培養(yǎng)細菌的分離鑒定

續(xù)表2

表3 羅斯海沉積物中可培養(yǎng)真菌的分離鑒定

續(xù)表

將測得的細菌、真菌基因序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫進行對比分析, 使用N-J法建樹, 構(gòu)建的菌株系統(tǒng)進化樹分別如圖4、圖5所示。獲得的78株細菌(數(shù)據(jù)根據(jù)鑒定表來確定)的序列在NCBI中選擇與GenBank中的參考菌株16S rDNA 序列進行比較分析后, 其相似度均在98%—100%之間, 而XD2、3D1這2株菌株相似度分別為97%、95%, 可能代表了潛在的細菌新物種[30]。54株真菌(數(shù)據(jù)根據(jù)鑒定表來確定)的序列在NCBI中選擇與GenBank 中的參考菌株的ITS序列進行比較分析后, 其相似度均在98%—100%之間。

2.2 胞外水解酶活性檢測

2.2.1 細菌API20NE鑒定

從沉積物樣品中分離到的細菌中選取代表性菌株, 采用API20NE非發(fā)酵G-桿菌鑒定試劑盒測定其理化性質(zhì), 具體見表4。

結(jié)果表明, 100%的菌株都能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和氮氣, 幾乎所有的菌株不能產(chǎn)生吲哚、脲酶、β-半乳糖苷酶等反應; XD1、DC20等10株菌可產(chǎn)生精氨酸雙水解酶活性; XD1、DC20、2Z1等菌株具有脲酶活性。XB3菌株可產(chǎn)生蛋白酶。實驗菌株具有代謝各種化合物的能力, 如菌株3D1能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和氮氣, 能產(chǎn)生精氨酸水解酶、脲酶, 同化葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、葡萄糖酸鉀、己二酸、蘋果酸; 菌株XB3能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和氮氣, 能產(chǎn)生精氨酸水解酶、脲酶、蛋白酶和β-半乳糖苷酶(對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷酶), 同化甘露醇、麥芽糖、葡萄糖酸鉀。

2.2.2 可培養(yǎng)真菌產(chǎn)胞外酶活性測定

依據(jù)分子鑒定結(jié)果選擇不同種的可培養(yǎng)真菌進行胞外酶活性測定, 結(jié)果表明: 54株真菌中, 有18株真菌產(chǎn)生淀粉酶, 43株真菌產(chǎn)酪蛋白酶, 35株真菌產(chǎn)纖維素酶, 有16株菌同時產(chǎn)生三種酶, 其中DA2、DA4菌株產(chǎn)生的透明圈非常清晰。具體見表5。部分酶活篩選平板如圖6所示。

3 討論

獲得可培養(yǎng)微生物是微生物資源利用的基礎(chǔ), 在南極可培養(yǎng)微生物多樣性研究方面, 目前取得了一定的研究成果。本研究通過對南極羅斯海區(qū)域沉積物的細菌、真菌進行分離、純化和培養(yǎng), 基于16S rDNA、ITS基因序列進行了系統(tǒng)發(fā)育分析, 最終獲得含有13個屬的細菌78株、5個屬的真菌54株。Bowman等[31]也利用16S rDNA分子鑒定, 發(fā)現(xiàn)南極海冰中細菌種群的主要部分是類群。本研究鑒定的真菌菌屬類別與陳皓文等[32]、孔華忠和齊祖國[33]鑒定出的真菌菌屬類別不完全一致, 例如本研究分離出的鏈格孢屬、殼二孢屬、金擔子菌屬與陳皓文等[32]、孫華忠和齊祖國[33]鑒定出的曲霉菌屬、散子囊菌屬、布魯?shù)现忝?、梅林瓶霉等菌屬類的不? 這種差異可能是由于采樣地點、采樣時間、樣品處理等因素的影響造成的, Arenz和Blanchette[34]采用分離培養(yǎng)的方法對比分析了南極干谷、羅斯海地區(qū)和南極半島三個南極無冰區(qū)土壤中的真菌多樣性, 發(fā)現(xiàn)采集地區(qū)不同, 分離得到真菌的種類不同, Tabacchioni等[35]、S?rheim等[36]的研究也發(fā)現(xiàn)用不同的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)獲得的菌株間差異較大, 因而有可能導致真菌多樣性存在一定差異。

圖4 南極羅斯海區(qū)域細菌16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)進化樹(bootstrap=1000)

Fig.4. The phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of bacteria isolated from Ross Sea region of Antarctica (bootstrap=1000)

圖5 南極羅斯海區(qū)域真菌18S/ITS基因序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)進化樹(bootstrap=1000)

Fig.5. The phylogenetic trees based on 18S/ITS sequences of fungus isolated from Ross Sea region of Antarctica and the closely related sequences (bootstrap=500)

表4 可培養(yǎng)細菌API生理生化測定結(jié)果

注: (1) N03、TRP、、、、ESC、GEL、PNPG分別代表硝酸鹽還原、吲哚產(chǎn)生、葡萄糖發(fā)酵、精氨酸雙水解、脲酶、水解α-葡萄糖苷酶、水解(蛋白酶)和β-半乳糖苷酶反應。(2) GLU、ARA、MNE、MAN、NAG、MAL、GNT、CAP、ADI、MLT、CIT、PAC分別代表葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、乙酰葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖酸鉀、羊蠟酸、己二酸、蘋果酸、枸櫞酸鈉、苯乙酸。(3) +為陽性反應, —為陰性反應

表5 可培養(yǎng)真菌產(chǎn)胞外酶活性測定結(jié)果

注: “+++”表示透明圈非常大, “++”表示透明圈較大, “+”表示透明圈較小, “-”表示無透明圈

圖 6 部分酶活性檢測結(jié)果

南極是產(chǎn)新型生物活性物質(zhì)和先導化合物(酶、抗生素等)菌株的重要來源地[37]。近年來對南極可培養(yǎng)微生物產(chǎn)酶性能的研究已經(jīng)成為研究熱點。如王全福等[38]發(fā)現(xiàn)生長在南極低溫環(huán)境下的嗜冷菌和適冷菌為了適應低溫環(huán)境, 使代謝系統(tǒng)中的酶在低溫下保持較高活性, 它的最適酶活溫度會比相應中溫酶低。李昭和孫謐[39]對分離出的187株細菌全部進行了過氧化氫酶活性檢測, 共有96株細菌具有過氧化氫酶活性, 67株細菌具有弱過氧化氫酶活性。從本研究對可培養(yǎng)細菌理化性質(zhì)的鑒定和真菌產(chǎn)胞外低溫酶活性初步測定的實驗結(jié)果可看出, 細菌具有硝酸鹽還原酶活性、精氨酸雙水解酶活性、脲酶活性及蛋白酶活性, 蛋白酶是可水解蛋白質(zhì)的一系列工業(yè)生物催化劑, 篩選出的可產(chǎn)蛋白酶的菌株為蛋白質(zhì)的降解提供潛在的利用資源。真菌中大多數(shù)菌株產(chǎn)生淀粉酶、酪蛋白酶和纖維素酶, 由透明圈大小可顯示出酶活力較好, 但具體的酶活性有待進一步驗證。

本實驗對南極羅斯海區(qū)域沉積物樣品中可培養(yǎng)微生物的多樣性、理化性質(zhì)和酶活性進行研究, 結(jié)果說明南極羅斯海區(qū)域沉積物中可培養(yǎng)微生物具有良好的多樣性和豐富性, 獲得的細菌中有潛在的新種。這在理論上豐富了我們對南極微生物資源的認知, 并獲得了一批可培養(yǎng)的、經(jīng)過標準化鑒定的南極菌株, 未來可以深入探究南極菌在進化、生物學特性等方面的特點, 深入研究菌種個體的生物活性, 進而揭示南極生物適應南極特殊環(huán)境的規(guī)律; 亦可以利用現(xiàn)在獲得的菌種資源, 在低溫酶、藥物先導化合物等方面進行應用潛力研究, 為南極微生物的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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ISOLATION OF CULTURABLE STRAINS FROM ANTARCTIC ROSS SEA SEDIMENTS AND STUDY OF EXTRACELLULAR HYDROLASE ACTIVITY

Wang Fei1, Cong Bailin2, Zhang Zhaohui2, Yang Huanghao1

(1Fuzhou University, Fu Zhou 350108, China;2First Institute of Oceanography, Ministry of Natural Resources, Qingdao 266061, China)

To evaluate the potential of Antarctic microbial resources for exploitation, we isolated culturable bacteria from sediments collected from the Ross Sea region in Antarctica and examined their diversity and extracellular enzyme activities. Pure cultured bacteria and fungi were isolated using Zobell 2216E medium and potato dextrose agar(PDA). Diversity and phylogeny of culturable microorganisms were analyzed using 16S rDNA and 18S/ITS sequencing. We found 79 strains of bacteria and 54 strains of fungi, of whichandwere dominant. Phenotypic similarity with model strain was low (less than 97%) in two bacterial strains, indicating the potential discovery of new species. Results from API20NE tests show that most strains have extracellular hydrolase activity. This study provides new information on culturable microbial resources in Antarctica and lays the foundation for exploitation of Antarctic microbial resources.

Ross Sea, culturable strains, ectoenzyme

2019 年9 月收到來稿, 2019 年11 月收到修改稿

“十三五”國家重點研發(fā)計劃(2018YFC1406701)資助

王飛, 女, 1991 年出生。碩士研究生, 主要從事極地微生物研究。E-mail: wangfeiguofen@163.com

叢柏林, E-mail: biolin@fio.org.cn

10. 13679/j.jdyj.20190051