牛蒡不同部位多糖的抗氧化與抗凝血活性研究

王家輝,劉杉杉,張 鑫,王 振,李新朋

(臨沂大學(xué)藥學(xué)院,山東臨沂 276000)

本文對(duì)牛蒡根、莖、葉三個(gè)部位提取多糖的單糖組成和總糖含量進(jìn)行測(cè)定,并對(duì)其抗氧化活性和抗凝血活性進(jìn)行研究和比較,以此為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)確定牛蒡各部位多糖的生物活性差異,以便于更好開發(fā)牛蒡多糖的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛蒡 采收時(shí)間為6月份中旬,山東省臨沂市某市場(chǎng);木瓜蛋白酶(80萬(wàn) U/g) 北京索萊寶科技有限公司;甘露糖(Man)、葡萄糖氨(GlcN)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品純度≥99%)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP,≥99%) 分析純,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;三氟乙酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉 分析純,國(guó)藥集團(tuán);鄰苯三酚、硫酸亞鐵、DPPH、鐵氰化鉀 色譜純,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;乙腈 色譜純,德國(guó)Merk公司;抗凝血試劑盒(APTT、PT、TT) 南京建成生物工程研究所。

HH-ZK4四孔水浴鍋 鄭州予華儀器有限責(zé)任公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏儀器設(shè)備有限公司;Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Agilent 1260高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛蒡多糖的提取 取牛蒡根、莖、葉各部位水洗,置于干燥箱中,60 ℃干燥3 h,粉碎,過(guò)60目篩,用甲醇-乙酸乙酯(1∶2)混合液加熱回流脫脂[9]。脫脂產(chǎn)物經(jīng)干燥后采用熱水提取牛蒡多糖,具體條件為:料液比為1∶20 (g/mL),100 ℃,時(shí)間為2 h。將提取混合物過(guò)濾,借助木瓜蛋白酶(4 mg/kg)去除蛋白質(zhì),透析(截留分子量為3500 Da),凍干(-80 ℃預(yù)凍,后于冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干,-80 ℃),得牛蒡多糖粗品,稱重,計(jì)算提取率[10-11]:提取率(%)=凍干多糖粗品×100/投入量

1.2.2 單糖組成測(cè)定 采用PMP柱前衍生法測(cè)定牛蒡根、莖、葉三個(gè)部位提取多糖的單糖組成[12-13]。將三種牛蒡提取多糖分別配制成5 mg/mL的水溶液,取500 μL于西林瓶中,再加入500 μL、4 mol/L 三氟乙酸,封口。西林瓶置于115 ℃烘干箱中降解4 h。降解結(jié)束后,使用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性,移取200 μL溶液用于PMP衍生。衍生時(shí)各樣品加入200 μL、0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液,240 μL PMP-甲醇溶液,混勻后70 ℃水浴反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后,加入220 μL 0.3 mol/L的HCl溶液中和。加入1 mL氯仿萃取三次,過(guò)0.22 μm濾膜,高效液相色譜分析其單糖組成。單糖標(biāo)準(zhǔn)品:Man、GlcN、Rha、GlcA、Glc、Gal和Ara,配制成0.4 mg/mL的水溶液,取200 μL直接進(jìn)行衍生即可,衍生方法與樣品相同。

HPLC色譜條件:色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈∶0.1 mol/L PBS溶液(pH=7.0)=18∶82 (v/v);流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器(254 nm);柱溫:30 ℃。

1.2.3 總糖含量測(cè)定 采用苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量[14]。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,后將標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成不同濃度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL),加入5%苯酚溶液1 mL,混勻后加入硫酸溶液5 mL,放置30 min后在485 nm下測(cè)定吸光度,得總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)牛蒡多糖樣品配制成的溶液,取0.15 mL按上述條件測(cè)定,每個(gè)樣品平行測(cè)定三次,取平均值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總糖含量。

1.2.4 抗氧化活性測(cè)定 選用抗壞血酸作為對(duì)照品,對(duì)比牛蒡根、莖、葉提取多糖0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL濃度下實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以表明其抗氧化活性強(qiáng)弱。

清除率計(jì)算公式:

式(1)

式中:A0為水代替多糖時(shí)測(cè)得的吸光度值;Ai為不同濃度待測(cè)多糖測(cè)得的吸光度值;Aj為水代替鄰苯三酚時(shí)不同濃度待測(cè)多糖測(cè)得的本底吸光度值。

1.2.4.2 羥基自由基(·OH)清除能力 采用硫酸亞鐵-水楊酸法測(cè)定牛蒡根、莖、葉三個(gè)部位多糖的羥基自由基清除能力[15]。依次向不同試管中加入6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL、不同濃度的三個(gè)部位多糖溶液1 mL、6 mmol/L的過(guò)氧化氫溶液1 mL,搖勻后室溫靜置10 min,加入6 mmol/L的水楊酸溶液1 mL,搖勻后室溫靜置30 min,用蒸餾水調(diào)零,測(cè)定其在510 nm處吸光度值,計(jì)算公式見(jiàn)式(1)。

1.2.4.3 DPPH·清除能力 采用DPPH標(biāo)準(zhǔn)品-乙醇法測(cè)定牛蒡根、莖、葉三個(gè)部位提取多糖的DPPH清除能力[16-17]。依次向試管中加入不同濃度的三個(gè)部位多糖溶液0.500 mL,DPPH溶液3 mL,搖勻后室溫靜置30 min,用蒸餾水調(diào)零,測(cè)定其在517 nm處的吸光度值。

清除率計(jì)算公式:

式(2)

1.2.4.4 還原能力 采用鐵氰化鉀-三氯化鐵法測(cè)定抗壞血酸、牛蒡根、莖、葉三個(gè)部位多糖的還原能力[18],在不同試管中分別加入不同濃度的三種多糖溶液各1 mL,1%鐵氰化鉀溶液1 mL,搖勻后50 ℃水浴20 min,向反應(yīng)體系中加入0.1%的三氯乙酸溶液5 mL停止反應(yīng),5 min后加入0.1%三氯化鐵溶液1.2 mL,搖勻后測(cè)定其在700 nm處的吸光度值。還原能力與吸光度值成正比。

1.2.5 抗凝血活性 通過(guò)測(cè)定活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)評(píng)價(jià)其抗凝血活性[19-21]。測(cè)定過(guò)程均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用半自動(dòng)凝血儀檢測(cè);多糖樣品用生理鹽水溶解;陽(yáng)性對(duì)照選用濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的肝素鈉,空白對(duì)照選用生理鹽水。

1.2.5.1 活化部分凝血酶時(shí)間(APTT) 依次向不同血凝杯中加入APTT試劑(液體白陶土)50 μL、血漿50 μL及不同濃度的三種多糖溶液50 μL,混勻后37 ℃孵育3 min,而后加入已預(yù)熱的氯化鈣溶液50 μL,立即混勻,記錄血漿凝固時(shí)間。每個(gè)樣品平行測(cè)定三次,取平均值。

1.2.5.2 凝血酶原時(shí)間(PT) 向不同血凝杯中加入血漿50 μL及不同濃度的三種多糖溶液50 μL,混勻后37 ℃孵育3 min,后加入已預(yù)熱的凝血酶原PT試劑100 μL,立即混勻。記錄血漿凝固時(shí)間。每個(gè)樣品平行測(cè)定三次,取平均值。

1.2.5.3 凝血酶時(shí)間(TT) 向不同血凝杯中加入血漿100 μL及不同濃度的三種多糖溶液100 μL,混勻后37 ℃孵育3 min,后加入已預(yù)熱的凝血酶TT試劑100 μL,立即混勻。記錄血漿凝固時(shí)間。每個(gè)樣品平行測(cè)定三次,取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)的處理

對(duì)各樣品多糖的高效液相色譜圖中各單糖的峰面積進(jìn)行積分測(cè)定單糖組成及相對(duì)含量,進(jìn)而計(jì)算摩爾百分比?？寡趸钚院涂鼓钚詫?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 6.0軟件整合[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡多糖單糖組成及總糖含量測(cè)定結(jié)果

牛蒡根、莖、葉三個(gè)部位提取多糖的單糖組成經(jīng)PMP柱前衍生法測(cè)定結(jié)果如圖1示(橫坐標(biāo)為單糖出峰時(shí)間)。從圖1中可以看出,牛蒡根、莖、葉多糖中均含有不等量的Man、GlcN、Rha、GlcA、Glc、Gal和Ara,其摩爾比如表1所示。從表1中數(shù)據(jù)可看出,牛蒡根、莖、葉多糖的單糖組成摩爾比有明顯不同,其中牛蒡根中Glc含量最高,其次為GlcA和Gal;牛蒡莖中主要有Gal、Glc和Ara組成;而牛蒡葉中也是主要以Glc為主,Gal和Ara次之。

圖1 牛蒡多糖的單糖組成Fig.1 Monosaccharide composition ofArctium lappa L. polysaccharides

由單糖組成結(jié)果分析看出:牛蒡根多糖和牛蒡葉多糖主要以Glc為主,在測(cè)試總糖時(shí)以Glc為標(biāo)準(zhǔn)品,而牛蒡莖中主要以Gal為主,測(cè)試總糖以Gal為標(biāo)準(zhǔn)品(牛蒡根及牛蒡葉多糖測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=1.9143x+0.0629,R2=0.997;牛蒡莖多糖測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=4.5204x+0.1468,R2=0.998)。

結(jié)果顯示牛蒡根總糖含量最高(69.4%),其次為牛蒡葉(56.1%),而牛蒡莖的含量最低(56.1%),表明牛蒡中多糖整體含量比較高。三種多糖的提取率都比較高,超過(guò)10%,其中牛蒡根部多糖提取率最高(15.3%),而牛蒡莖的提取率最低(11.5%)。

表1 牛蒡多糖單糖組成、提取率及總糖含量(%)Table 1 The monosaccharide composition,yield and total sugar(%)

2.2 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

圖2 牛蒡多糖超氧陰離子自由基清除能力Fig.2 Superoxide anion free radical scavengingability of Arctium lappa L. polysaccharide

2.2.2 羥基自由基(·OH)清除能力 羥基自由基清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。在濃度低于0.8 mg/mL時(shí),牛蒡莖多糖清除能力隨濃度升高而明顯升高,當(dāng)濃度高于0.8 mg/mL后,清除能力隨濃度變化的趨勢(shì)較小,與抗壞血酸相比差距較小。牛蒡根多糖的清除能力遠(yuǎn)低于其余兩種多糖,在0～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi),清除率與濃度成正相關(guān)。三個(gè)部位提取多糖的羥基自由基清除能力以牛蒡莖最強(qiáng),牛蒡葉次之,牛蒡根最弱。在濃度為1.0 mg/mL時(shí),牛蒡根多糖清除能力僅為30%,而牛蒡莖與牛蒡葉清除能力分別在86%與95%,此濃度下,牛蒡莖多糖清除能力抗壞血酸差距極小。

圖3 牛蒡多糖羥基自由基清除能力Fig.3 Scavenging capacity of Arctium lappa L.polysaccharide on hydroxyl radicals

2.2.3 DPPH·清除能力 DPPH·清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。牛蒡根、莖多糖在濃度低于0.8 mg/mL時(shí),清除能力與濃度成正相關(guān)性,在濃度高于0.8 mg/mL后,清除能力不再隨濃度增加而升高。牛蒡葉在濃度低于0.4 mg/mL時(shí),清除能力隨濃度升高而迅速升高,在濃度高于0.4 mg/mL后,清除能力變化不明顯。當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí),三個(gè)部位多糖的DPPH·清除能力以牛蒡葉多糖最強(qiáng),達(dá)到69%,牛蒡莖次之(51%),牛蒡根多糖最弱,為44%。牛蒡莖、根多糖間清除能力差距較小。牛蒡葉多糖的清除能力在濃度低于0.6 mg/mL時(shí)要遠(yuǎn)高于其余兩種多糖,濃度高于0.6 mg/mL后,這一差距縮小。三種多糖的清除能力同抗壞血酸相比,差距較大,相差20%。

圖4 牛蒡多糖DPPH·清除能力Fig.4 DPPH scavenging capacity ofArctium lappa L. polysaccharide

2.2.4 還原能力 還原能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出,各濃度下,牛蒡葉多糖的還原能力與其余兩種多糖相比略高,牛蒡莖多糖次之,牛蒡根多糖最弱,還原能力僅為0.3。牛蒡根多糖隨濃度升高還原能力逐漸升高,但升高趨勢(shì)較低;牛蒡莖多糖在濃度低于0.6 mg/mL時(shí),還原能力隨濃度升高而升高,在高于0.6 mg/mL時(shí),還原能力隨濃度升高反而呈略微下降趨勢(shì);牛蒡葉多糖在0～1.0 mg/mL濃度區(qū)間內(nèi)隨濃度升高還原能力一直升高,但在高于0.8 mg/mL后,升高趨勢(shì)略有降低。

圖5 牛蒡多糖還原能力Fig.5 Reduction capacity of Arctium lappa L. polysaccharide

2.3 抗凝血活性分析

2.3.1 活化部分凝血酶時(shí)間(APTT) 從圖6中可以看出,相較于肝素鈉,三種牛蒡多糖的APTT均較短(具有顯著性差異)。在0～0.3 mg/mL濃度區(qū)間內(nèi),隨濃度升高,各樣品APTT值也逐漸增大,當(dāng)濃度為0.3 mg/mL時(shí),牛蒡葉多糖的APTT時(shí)間最長(zhǎng),為35 s,而牛蒡根多糖次之,為29 s,牛蒡莖最短,僅為25 s。

圖6 牛蒡多糖對(duì)APTT影響Fig.6 Effects of Arctium lappa L. polysaccharides on APTT

2.3.2 凝血酶原時(shí)間(PT) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出,牛蒡莖、葉多糖對(duì)PT值影響隨濃度變化幾乎不變,無(wú)明顯延長(zhǎng)PT作用。牛蒡根多糖在濃度低于0.15 mg/mL時(shí),PT隨濃度升高而逐漸升高,在高于0.15 mg/mL后,無(wú)明顯變化。低濃度下(小于0.15 mg/mL),牛蒡根多糖PT略大于肝素鈉PT,中高濃度下(大于0.15 mg/mL),肝素鈉PT遠(yuǎn)大于牛蒡根多糖。

圖7 牛蒡多糖對(duì)PT影響Fig.7 Effects of Arctium lappa L. polysaccharides on PT

2.3.3 凝血酶時(shí)間(TT) 凝血酶時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8示。從圖中可以看出,0～0.3 mg/mL濃度間內(nèi),三種多糖的TT值隨濃度升高緩慢升高,各提取多糖間差距極小。在0.25～0.30 mg/mL范圍內(nèi),肝素鈉TT值驟然升高,遠(yuǎn)高于三種多糖的TT值。三種多糖延長(zhǎng)TT作用不明顯。

圖8 牛蒡多糖對(duì)TT影響Fig.8 Effect of Arctium lappa L. polysaccharide on TT

3 討論與結(jié)論

本研究首先采取傳統(tǒng)水提醇沉法提取牛蒡根、莖、葉三個(gè)部位的多糖,其中牛蒡根部多糖提取率最高(15.3%),相比于超聲波輔助熱水提取,收率明顯升高[23]?？偺呛糠治鲆脖砻髋］蚋偺呛孔罡摺翁欠治鲲@示:三種多糖均含有不等量的Man、GlcN、Rha、GlcA、Glc、Gal和Ara,但單糖摩爾比有明顯不同。牛蒡根多糖中主要為Glc(57.3%),其次是Glc、Gal和Ara;而牛蒡莖多糖中Gal(28.6%)和Glc(26.5%)以及Ara(26.2%)含量相差不大;牛蒡葉多糖含量最高的為Glc(48.7%),其次是Gal和Ara,與此前的相關(guān)研究比較,果糖的存在值得更深入的研究[24-25]。抗氧化活性測(cè)試結(jié)果表明牛蒡莖多糖和牛蒡葉多糖抗氧化性要優(yōu)于牛蒡根多糖。超氧陰離子自由基和羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)中可以看出,牛蒡莖多糖和牛蒡葉多糖表現(xiàn)出良好的抗氧化性,但相對(duì)于抗壞血酸還有一定的差距,但隨著濃度的增大,差距逐漸在縮小。而牛蒡根多糖對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力最差。而在DPPH·清除實(shí)驗(yàn)和還原能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中,牛蒡葉多糖能力要更強(qiáng),牛蒡莖多糖與牛蒡根多糖表現(xiàn)出的活性更相近,都遠(yuǎn)低于抗壞血酸。綜合抗氧化活性測(cè)試結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),牛蒡葉多糖活性要強(qiáng)與牛蒡莖多糖,牛蒡根多糖抗氧化活性相對(duì)較弱。對(duì)比已有研究,牛蒡根多糖已表現(xiàn)出良好的抗氧化活性[26-27],但牛蒡莖與牛蒡葉多糖研究較少,三者之間抗氧化活性對(duì)比比較罕見(jiàn),所以研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定差距[28]?？鼓钚詼y(cè)試結(jié)果表明所有牛蒡多糖樣品抗凝血活性均遠(yuǎn)低于肝素鈉,且隨濃度(0～0.3 mg/mL)變化的趨勢(shì)較小,說(shuō)明牛蒡多糖的抗凝血活性并不高。APTT測(cè)試中,牛蒡葉多糖的APPT長(zhǎng)于牛蒡根多糖,牛蒡莖多糖相對(duì)最短;而PT和TT測(cè)試中牛蒡根活性稍好,但三者相差并不大,并沒(méi)有表現(xiàn)出良好的抗凝血活性。

本研究結(jié)果表明牛蒡多糖具有相對(duì)比較好的抗氧化活性,但不同部位提取的多糖在抗氧化活性上表現(xiàn)出差異性,其中牛蒡葉多糖效果較好,牛蒡莖次之,而牛蒡根多糖抗氧化活性最低,但在抗凝血活性測(cè)試中牛蒡多糖并沒(méi)有表現(xiàn)出良好的活性,相比于肝素鈉,三種多糖的抗凝血活性明顯較弱。然而由于牛蒡根多糖產(chǎn)量大,易于處理,所以在工業(yè)價(jià)值上更加優(yōu)于牛蒡葉多糖。本研究結(jié)果為牛蒡葉多糖應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),更有利于牛蒡葉多糖的工業(yè)開發(fā)。