超聲波輔助雜多酸提取竹葉多糖工藝優(yōu)化及其生物活性研究

(浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 310023)

竹子屬于禾本科竹亞科常綠植物,中國是竹資源大國,竹林種植面積達(dá)到500萬公頃,世界上排名第一[1]。竹葉作為竹材的副產(chǎn)品,長期未得到有效的利用,隨著社會(huì)的發(fā)展人們對(duì)生物質(zhì)資源越來越重視,竹葉的開發(fā)利用成為熱點(diǎn)。竹葉中含有大量的纖維素和半纖維素,理論上可以制備單糖、葡聚糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡萄甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖等多糖或低聚糖。多糖是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物等有機(jī)體中的大分子化合物,聚合度一般大于10[1],在自然界中儲(chǔ)量十分豐富,主要分為植物多糖、動(dòng)物多糖和微生物多糖[2-3]。大量研究表明多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、降血糖、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和抑菌等生理活性[4-8]。中醫(yī)理論認(rèn)為竹葉味甘、性寒,具有利尿、清心除煩的功效,大量研究表明竹葉多糖是一種大分子雜多糖且具有抗癌功能,能增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力,有抗氧化、降低血糖和抑菌等多種生理功能[9-12]。因此,竹葉多糖作為天然產(chǎn)物,其毒副作用非常小,其發(fā)展應(yīng)用前景較廣闊。

目前,關(guān)于竹葉多糖的研究主要圍繞在提取工藝的優(yōu)化,但對(duì)竹葉多糖的生物活性研究較少。竹葉多糖傳統(tǒng)的提取方法有超聲波提取法[13-14]、酶提取法[15]、水浸提法[16]等提取方法,這些傳統(tǒng)的提取方法具有原料消耗大、提取時(shí)間長、得率低、工業(yè)化生產(chǎn)難度高等缺點(diǎn)。傳統(tǒng)的提取方法不能從竹葉中提取出大量的多糖,因此,將多種方法協(xié)同起來提取竹葉多糖成為一種趨勢(shì)。同時(shí),竹葉多糖生物活性研究主要圍繞在抗氧化、抑菌等基礎(chǔ)的生物活性,關(guān)于抗腫瘤方面的研究較少。

本文以一年生毛竹竹葉為主要試材,通過超聲固體雜多酸技術(shù)提取毛竹竹葉多糖,提高竹葉多糖的得率,并對(duì)其結(jié)構(gòu)與組成進(jìn)行初步鑒定,將獲得的竹葉多糖進(jìn)行體外抗氧化活性和抗腫瘤活性研究,其主要目的是提高竹資源利用效率,為竹產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)助力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

一年生新鮮毛竹竹葉1 kg 3月份自摘于浙江科技學(xué)院后山;鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、葡萄糖醛酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品,阿拉丁;半乳糖醛酸分析標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司;磷鎢酸、氫氧化鈉、乙酸鈉 分析純,美國賽默飛世爾科技公司;濃硫酸、苯酚、無水乙醇 分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù);基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗 武漢譜諾賽生命科技有限公司。

ICS-5000+離子色譜儀、電化學(xué)檢測(cè)器(Au為工作電極,Ag/AgCl為參比電極)、Heraeus Multifuge X1R離心機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱、MSC-AdvantageTMII 級(jí)生物安全柜 美國賽默飛世爾科技公司;UNIQUE-LC多功能超純水系統(tǒng) 瑞斯捷;BSA124S分析天平 德國賽多利斯;DHG-9013A烘箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;超聲波反應(yīng)釜 上海霍桐實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器有限公司;傅立葉變換紅外光譜儀 德國布魯克儀器公司;EM-1011透射電鏡 日本電子公司;倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將新鮮采摘的毛竹竹葉除雜、純水清洗、烘干至恒重、粉碎,加入3倍體積的95%乙醇抽提,重復(fù)3～4次,60 ℃烘干至恒重,使用水分測(cè)定儀測(cè)其含水率,烘干密封,備用。

1.2.2 竹葉多糖提取及含量測(cè)定 稱取竹葉粉加入到100 mL的超聲波反應(yīng)釜中,加入一定量的水和一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的磷鎢酸,在反應(yīng)器中按照一定的超聲功率和一定的超聲溫度反應(yīng)一定的時(shí)間,布氏漏斗抽濾,除去殘?jiān)?加入最終濃度為80%的無水乙醇,4 ℃靜至12 h,8000 r/min下離心獲得竹葉多糖沉淀。分別經(jīng)過Sevage法除去蛋白質(zhì)、真空冷凍干燥,最終得到竹葉多糖。

采用苯酚-硫酸法檢測(cè)樣品中多糖含量[17-18],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,以多糖的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),吸光度(y)為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.007x-0.0047,線性范圍為20.00～120.00 μg/mL,相關(guān)系數(shù)R2為0.9999。吸取25 μL多糖溶液,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖濃度,按照式(1)計(jì)算多糖含量。

式(1)

式中:c為樣液中多糖濃度(μg/mL);V為樣液體積(m/L);M為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以竹葉多糖的得率為考察指標(biāo)。分別考察超聲波功率、磷鎢酸的質(zhì)量濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間以及料液比對(duì)多糖得率的影響。

1.2.3.1 超聲功率對(duì)竹葉多糖得率的影響 精密稱取3.0 g竹葉粉,在磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.5%,超聲溫度為80 ℃,超聲時(shí)間為2 h,料液比為1∶20 g/mL下,分別考察超聲功率60、120、180、240、300 W對(duì)竹葉多糖得率的影響。

1.2.3.2 磷鎢酸質(zhì)量濃度對(duì)竹葉多糖得率的影響 精密稱取3.0 g竹葉粉,在超聲功率為300 W,超聲溫度為80 ℃,超聲時(shí)間為2 h,料液比為1∶20 g/mL下,分別考察磷鎢酸質(zhì)量濃度0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%對(duì)竹葉多糖得率的影響。

1.2.3.3 超聲溫度對(duì)竹葉多糖得率的影響 精密稱取3.0 g竹葉粉,在超聲功率為300 W,磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.50%,超聲時(shí)間為2 h,料液比為1∶20 g/mL下,分別考察超聲溫度60、70、80、90、100 ℃對(duì)竹葉多糖得率的影響。

1.2.3.4 提取時(shí)間對(duì)竹葉多糖得率的影響 精密稱取3.0 g竹葉粉,在超聲功率為300 W,磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.50%,超聲溫度為80 ℃,料液比為1∶20 g/mL下,分別考察提取時(shí)間1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h對(duì)竹葉多糖得率的影響。

1.2.3.5 料液比對(duì)竹葉多糖得率的影響 精密稱取3.0 g竹葉粉,在超聲功率為300 W,磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.50%,超聲溫度為80 ℃,提取時(shí)間為2 h下,分別考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL對(duì)竹葉多糖得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以料液比(A)、反應(yīng)溫度(B)和提取時(shí)間(C)這3個(gè)因素為自變量進(jìn)行組合優(yōu)化,以多糖得率(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素及水平Table 1 Levels and factors of response surface experiment

1.2.5 竹葉多糖結(jié)構(gòu)分析

1.2.5.1 紅外光譜分析 準(zhǔn)確稱取1.0 mg干燥的竹葉多糖與 KBr 粉末于研缽中研磨混合均勻,壓成薄片,在波4000～400 cm-1范圍內(nèi)利用紅外光譜儀進(jìn)行光譜掃描[19-22],分辨率為0.09 cm-1。

1.2.5.2 多糖物理形貌分析 采用電子掃描顯微鏡(SEM)將反應(yīng)前后的原料及竹葉多糖放大5.5×103倍進(jìn)行表征。表征前需對(duì)樣品進(jìn)行噴金處理,電鏡工作電壓為10 kV。

1.2.5.3 竹葉多糖單糖組成分析 準(zhǔn)確稱取適量竹葉多糖,加入適量的2 mol/L三氟乙酸(TFA),在110 ℃下封管2 h。將水解液低于40 ℃條件下減壓蒸干,加入3 mL甲醇蒸干,重復(fù)4～5次,以完全除去TFA[23-25]。用超純水定容到5 mL容量瓶中,采用高效陰離子色譜法檢測(cè)多糖水解液中單糖組成。

色譜條件:ICS-5000+高效陰離子色譜儀(HPAEC)、CarboPACTMPA10(4.0 mm×250 mm)陰離子交換柱(帶保護(hù)柱)、四電位波形。流速為0.80 mL/min;柱溫為20 ℃;進(jìn)樣體積為25 μL,流動(dòng)相為氫氧化鈉和乙酸鈉。竹葉多糖水解液梯度淋洗程序:0～30 min:2.5% 200 mmol/L NaOH和5% 200 mmo/L CH3COONa混合洗脫;30.1～53 min:50% 200 mmol/L NaOH和50% 200 mmol/L CH3COONa混合洗脫;53.1～56 min:100% 200 mmol/L NaOH洗脫;56.1～60 min:100% 200 mmol/L NaOH洗脫。

1.2.6 竹葉多糖體外抗氧化活性研究

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 用無水甲醇將DPPH試劑配制成1×10-4mol/L的溶液。準(zhǔn)確吸取不同質(zhì)量濃度(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg/mL)竹葉多糖待測(cè)樣液各2 mL,分別加入DPPH溶液4 mL,混合均勻,在25 ℃恒溫水浴下,放置30 min,于517 nm波長處測(cè)定吸光度[26-27]。以去離子水作為參比溶液、相同濃度的VC溶液作為陽性對(duì)照,按照式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

式(2)

式中:A0為去離子水+DPPH-甲醇溶液吸光度;A1為樣品+DPPH-甲醇溶液吸光度;A2為樣品+甲醇溶液吸光度。

1.2.6.2 還原力的測(cè)定 將1 mL不同質(zhì)量濃度的竹葉多糖溶液(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mg/mL)分別與2.5 mL pH=6.6的磷酸鹽緩沖溶液以及2.5 mL 1%的鐵氰化鉀(w/v)混合,于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min,然后加入2.5 mL 10%的三氟乙酸和0.5 mL 0.1%三氯化鐵(w/v)終止反應(yīng),離心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵(w/v),混合均勻,在700 nm下測(cè)定吸光度[28-29]。以去離子水為參比溶液,以相同濃度的VC溶液作為陽性對(duì)照。

1.2.6.3 ABTS+自由基清除能力 取7.00 mmol/L ABTS+和5.00 mmol/L過硫酸鉀等體積混合,在室溫下黑暗放置12～16 h,得到ABTS+儲(chǔ)備液,用PBS緩沖溶液將儲(chǔ)備液稀釋,使其在734 nm波長下吸光度值在0.7±0.02之間,備用。取不同質(zhì)量濃度的竹葉多糖溶液(0.30、0.50、0.70、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg/mL)300 μL,分別加入5 mL上述稀釋液,在30 ℃條件下,反應(yīng)1 h,在734 nm波長下測(cè)定吸光度[30-31]。以去離子水作為參比溶液,相同濃度的VC溶液最為陽性對(duì)照。按照式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率。

式(3)

式中:A0為去離子水+ABTS+自由基PBS溶液吸光度;A1為樣品+ABTS+自由基PBS溶液吸光度;A2為樣品+PBS溶液吸光度。

圖1 不同因素對(duì)竹葉組多糖提取率的影響Fig.1 Effects of different factors on the extraction rate of bamboo leaves polysaccharides

1.2.7 竹葉多糖體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用MTT法進(jìn)行測(cè)定。人肝癌細(xì)胞HepG-2生長于EMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,在37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)并傳代。將處于對(duì)數(shù)期的HepG-2細(xì)胞用胰蛋白酶消化后加入新鮮的EMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置成濃度為1×105cell/mL,每孔100 μL加入到96孔板內(nèi)。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞貼壁后。培養(yǎng)液中加入不同濃度的多糖(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL)100 μL各組分繼續(xù)孵育48 h。陰性對(duì)照由未經(jīng)處理的細(xì)胞設(shè)定。培養(yǎng)結(jié)束后,用顯微鏡對(duì)各組的細(xì)胞進(jìn)行觀察,棄上清液,每孔加入100 μL PBS清洗一次,每個(gè)孔中添加10 μL 新鮮配制的MTT(5.00 mg/mL)和100 μL新鮮的EMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。經(jīng)過4 h的培養(yǎng)后,用Formazan(100 μL)溶解形成的晶體,恒溫振蕩培養(yǎng)箱搖勻。用酶標(biāo)儀在波長570 nm處測(cè)定吸光度,按照式4計(jì)算竹葉多糖的腫瘤細(xì)胞抑制率。

式(4)

式中:A0為空白對(duì)照孔的吸光度;A1為樣品孔的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次回歸分析及方差分析,其余實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用Origin 9.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

竹葉多糖提取過程中磷鎢酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲功率、提取時(shí)間、料液比對(duì)提取竹葉多糖效果的影響見圖1。

由圖1a可知,隨著磷鎢酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,竹葉多糖得率逐漸上升,這是由于磷鎢酸破壞了竹葉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),促進(jìn)了竹葉多糖的浸出。當(dāng)磷鎢酸質(zhì)量濃度在0.5%～4.5%范圍內(nèi)時(shí),竹葉多糖得率隨著磷鎢酸質(zhì)量濃度上升呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì),當(dāng)磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.5%時(shí),竹葉多糖得率最高,考慮到成本問題如果進(jìn)一步增加磷鎢酸質(zhì)量濃度,將會(huì)提高成本。因此,選擇磷鎢酸質(zhì)量濃度為4.5%作為最佳反應(yīng)濃度。

如圖1b,隨著提取溫度的上升,竹葉多糖得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),隨著溫度的上升促進(jìn)了分子運(yùn)動(dòng),加快了多糖的浸出;但是隨著溫度的進(jìn)一步上升,促進(jìn)了多糖的降解。因此,選擇80 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

圖1c表明,隨著超聲功率的提高,竹葉多糖得率呈上升趨勢(shì),由于超聲波產(chǎn)生的空化作用,促進(jìn)了多糖的浸出。由于儀器原因,最大功率只能達(dá)到300 W,因此,選擇超聲波功率300 W為最佳反應(yīng)功率。

由圖1d可知,隨著提取時(shí)間的增加,竹葉多糖的得率逐漸上升,在2 h時(shí)達(dá)到最大值。2 h后,竹葉多糖得率呈現(xiàn)相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài),因此,選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為2 h。

圖1e表明,隨著料液比的增加,竹葉多糖的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)料液比為1∶20 g/mL時(shí),竹葉多糖得率最大,因此,選擇最佳料液比為1∶20 g/mL。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2,利用Design-Expert 8.0軟件,建立料液比、提取溫度及提取時(shí)間三因數(shù)數(shù)學(xué)回歸模型為:

Y=9.64+0.89A+0.61B+0.12C-1.25AB-0.28AC-0.65BC-1.51A2-1.31B2-0.56C2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

注：*差異顯著(P<0.05);**差異高度顯著(P<0.01);***差異極顯著(P<0.001)。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 由圖2可以直觀的看出料液比、提取溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)竹葉多糖的提取的影響及各因素之間交互作用的顯著程度。通過響應(yīng)面曲面的坡度可以直接反映了因素發(fā)生變化時(shí)竹葉多糖得率的響應(yīng)靈敏度,等高線圖為橢圓形時(shí)說明兩因素交互作用顯著。由圖2a1、圖2b1、圖2c1可知,料液比對(duì)多竹葉多糖的得率影響最為顯著,料液比和反應(yīng)溫度對(duì)竹葉多糖的得率有較大的影響。由圖2a2、圖2b2、圖2c2可知,料液比和提取溫度以及超聲溫度和提取時(shí)間交互作用對(duì)竹葉多糖的得率影響顯著。通過回歸模型的分析,以竹葉多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),竹葉多糖適宜的提取工藝參數(shù)為超聲功率300 W,磷鎢酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.50%,提取時(shí)間1.99 h、超聲溫度80.61 ℃、料液比1∶21.22 g/mL。在此條件下,模型預(yù)測(cè)竹葉多糖提取率為9.78%?？紤]到實(shí)際應(yīng)用過程中操作簡單,將最佳工藝參數(shù)修正為超聲功率300 W,磷鎢酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.50%,提取時(shí)間2 h、超聲溫度80 ℃、液料比1∶20 g/mL;在此條件下,竹葉多糖的提取率為9.89%,實(shí)際值與理論值基本相符,說明模型對(duì)竹葉多糖提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化可靠可行,具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.3 竹葉多糖結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紅外光譜分析 由圖3可知,竹葉水溶性多糖在3413 cm-1有較強(qiáng)且較寬的吸收峰為O-H伸縮振動(dòng),位2924 cm-1附近的吸收峰為CH3或CH2的C-H收縮振動(dòng)峰[32]。位于1635 cm-1附近的吸收峰是羧基的C=O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)[33]。位于1462 cm-1附近的吸收峰為C-H的變角振動(dòng),位于1000～1300 cm-1附近的吸收峰為吡喃環(huán)的醚鍵(C-O-C)和羥基(C-O-H)的伸縮振動(dòng)[34]。位于894 cm-1附近的吸收峰說明多糖含有β-糖苷鍵,位于817 cm-1附近的吸收峰為α-型吡喃糖的C-H彎曲振動(dòng)[35]。綜上所述,以上吸收峰的存在說明提取物具有多糖化合物的特征吸收峰。

圖3 竹葉多糖的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectrum of bamboo leaves polysaccharides

圖2 各因數(shù)對(duì)竹葉多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface map and contour map of the effect of various factors on the yield of bamboo leaves polysaccharides

圖4 竹葉粉末和竹葉多糖SEM圖(×5500)Fig.4 SEM images of bamboo leaf powder and polysaccharides(×5500)注:a:未處理的竹葉粉;b:提取后的竹葉粉;c:竹葉多糖;紅色箭頭標(biāo)注:提取前后竹葉的微觀變化。

2.3.2 竹葉多糖表面形貌分析 由圖4a竹葉原料反應(yīng)前的掃描電鏡圖觀察到,未經(jīng)處理的竹葉粉末表面形貌光滑、組織呈現(xiàn)出完整的塊狀、有少量的小碎片且形狀不規(guī)則。由圖4b超聲波耦合磷鎢酸提取后竹葉粉末掃描電鏡圖觀察到,在超聲波和磷鎢酸共同作用后,竹葉粉末凹凸不平,帶有孔洞的褶皺結(jié)構(gòu),從而將竹葉粉末的內(nèi)容物釋放出來,提高了竹葉多糖的提取率。圖4c為竹葉多糖的掃描電鏡圖,通過對(duì)竹葉多糖的形貌特征的觀察,多糖表面呈現(xiàn)塊狀和蜂窩狀結(jié)構(gòu),表面結(jié)合較為緊密,呈現(xiàn)蜂窩狀的原因可能是因?yàn)槎嗵欠肿渔滈g形成細(xì)微的多孔結(jié)構(gòu),且蜂窩狀表面較緊密、平整,表明多糖分子存在聚集體。

2.3.3 竹葉多糖單糖組成分析 將竹葉多糖水解得到的單糖與9種混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的高效陰離子色譜圖進(jìn)行比對(duì)(圖5和圖6)可知,竹葉多糖由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖組成,根據(jù)其峰面積計(jì)算6種單糖的摩爾比為0.32∶0.12∶1.75∶1.89∶1.22∶15.13。

圖5 9種混合標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的HPAEC圖Fig.5 HPAEC for derivatives of9 standard monosaccharide mixture注:1:巖藻糖;2:鼠李糖;3:阿拉伯糖;4:半乳糖;5:葡萄糖;6:木糖;7:果糖;8:半乳糖醛酸;9:葡萄糖醛酸;圖6同。

圖6 竹葉多糖衍生物的HPAEC圖Fig.6 HPAEC of derivatives ofbamboo leaves polysaccharide

2.4 竹葉多糖抗氧化活性能力

2.4.1 DPPH自由基清除能力 由圖7可知,隨著竹葉多糖質(zhì)量濃度逐漸增加,其對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增大,當(dāng)竹葉多糖質(zhì)量濃度達(dá)到4.00 mg/mL時(shí)DPPH自由基清除率趨于穩(wěn)定,其清除能力達(dá)到85.91%。在所測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),竹葉多糖的DPPH自由基清除能力均明顯低于相同質(zhì)量濃度的VC。竹葉多糖與賈金霞等[36]研究的銅綠菇多糖抗氧化活性相比較,當(dāng)多糖濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí),竹葉多糖DPPH自由基清除率為85.91%,銅綠菇多糖DPPH自由基清除率為38.97%,表明竹葉多糖可作為抗氧化劑良好來源。

圖7 竹葉多糖DPPH自由基清除率Fig.7 Scavenging rate of DPPH freeradical of bamboo leaves polysaccharides

2.4.2 還原能力 竹葉多糖分子中含有醛基和羰基,可以通過自身的還原作用,清除自由基,還原能力越強(qiáng),其抗氧化能力越強(qiáng)[37]。由圖8可知,隨著竹葉多糖的質(zhì)量濃度逐漸增加,其還原力緩慢上升,當(dāng)竹葉多糖質(zhì)量濃度為7.00 mg/mL時(shí),其還原力為0.569。在所測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),竹葉多糖的還原力明顯低于相同質(zhì)量濃度的VC。與教小磐等[38]的甜茶葉多糖的還原力比較發(fā)現(xiàn),竹葉多糖的還原能力優(yōu)于甜茶葉多糖。

圖8 竹葉多糖還原力Fig.8 Reducing power of bamboo leaves polysaccharides

2.4.3 ABTS+自由基清除能力 ABTS+被過硫酸鉀氧化形成藍(lán)綠色的穩(wěn)定的ABTS+自由基,ABTS+自由基與抗氧化劑結(jié)合使之褪色,在734 nm波長下,測(cè)定其吸光度,比較樣品抗氧化能力。由圖9可知,隨著竹葉多糖的質(zhì)量濃度逐漸增加,其對(duì)ABTS+自由基清除率逐漸增大,當(dāng)竹葉多糖質(zhì)量濃度達(dá)到2.00 mg/mL后ABTS+自由基清除率趨于穩(wěn)定,其清除率達(dá)99.23%。與許海棠等[39]研究的山豆根多糖比較發(fā)現(xiàn),竹葉多糖和山豆根多糖在ABTS+自由基清除能力相當(dāng)。表明竹葉多糖可作為抗氧化劑良好來源。

圖9 竹葉多糖ABTS+自由基清除率Fig.9 Scavenging rate of ABTS+ freeradical of bamboo leaves polysaccharides

2.5 竹葉多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

圖10 竹葉多糖對(duì)HepG2細(xì)胞體外增殖的影響Fig.10 Effect of bamboo leaf polysaccharide on thegrowth of HepG-2 cells in vitro

活細(xì)胞中的線粒體含有琥珀酸脫氫酶,它可以與MTT黃色溶液形成不可溶的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶,并沉積在細(xì)胞中;死細(xì)胞中不存在琥珀酸脫氫酶,不會(huì)出現(xiàn)紫色甲瓚結(jié)晶。根據(jù)此原理,測(cè)試了竹葉多糖對(duì)肝癌HepG-2細(xì)胞的抑制效果。由圖10可知,竹葉多糖對(duì)HepG-2細(xì)胞的增殖顯示出了較強(qiáng)的抑制作用,隨著竹葉多糖質(zhì)量濃度的增加,其對(duì)HepG-2細(xì)胞的增殖抑制率逐漸提高,說明抑制率與竹葉多糖的質(zhì)量濃度有關(guān)。當(dāng)竹葉多糖的質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL時(shí),對(duì)HepG-2細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到半抑制濃度，抑制率為53.18%。綜上可知,竹葉多糖具有一定的抗腫瘤活性。

由圖11a觀察到細(xì)胞貼壁生長,細(xì)胞之間緊密連接,細(xì)胞壁光滑,折光性好。由圖11b～圖11d經(jīng)過竹葉多糖處理的細(xì)胞,隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。由圖11d觀察到經(jīng)過4.00 mg/mL的竹葉多糖處理的細(xì)胞,細(xì)胞核發(fā)生明顯改變,部分細(xì)胞出現(xiàn)貼壁細(xì)胞數(shù)量減少、懸浮和凋亡小泡等明顯的凋亡特征。

圖11 竹葉多糖誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察Fig.11 Cell morphology of Hep G2 cells treatedwith bamboo leaf polysaccharides注:a:未處理正常細(xì)胞;b:0.25 mg/mL竹葉多糖處理的細(xì)胞;c:1.00 mg/mL竹葉多糖處理的細(xì)胞;d:4.00 mg/mL竹葉多糖處理的細(xì)胞;紅色標(biāo)記-死亡、凋亡的非正常細(xì)胞。

3 結(jié)論與討論

研究利用超聲波輔助雜多酸水解法對(duì)竹葉多糖進(jìn)行提取,通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳工藝參數(shù)為:提取竹葉多糖最優(yōu)條件為:超聲溫度80 ℃、提取時(shí)間2 h、料液比1∶20 g/mL、磷鎢酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.50%、超聲功率300 W。此條件下,竹葉多糖的提取率為9.89%。與回歸方程的預(yù)測(cè)值相近,具有一定的實(shí)用價(jià)值。采用高效陰離子色譜和傅里葉紅外色譜對(duì)竹葉多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步表征,為竹葉多糖結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究和多糖的高值化利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。竹葉多糖對(duì)ABTS+和DPPH自由基有較好的清除能力,且與多糖的質(zhì)量濃度成正相關(guān),對(duì)ABTS自由基清除率在2.00 mg/mL接近100%,對(duì)DPPH自由基清除率在4.00 mg/mL達(dá)85.91%,具有良好的自由基清除能力。竹葉多糖質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL時(shí)對(duì)癌細(xì)胞HepG-2增殖的抑制率可達(dá)到半抑制濃度,說明竹葉多糖具有一定的抗腫瘤活性。