枯草芽孢桿菌β甘露聚糖酶的克隆表達(dá)及重組酶性質(zhì)研究

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(1.湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心(三峽大學(xué)),湖北宜昌 443002;2.生物催化宜昌市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué)),湖北宜昌 443002;3.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院,湖北宜昌 443002)

圖1 β-甘露聚糖酶作用位點(diǎn)Fig.1 Conceptual diagram of action from β-mannanase

β-甘露聚糖酶(β-mannanase)屬于半纖維素酶類,是一類能夠切斷甘露聚糖(包括線性甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖等)主鏈中β-1,4-D-甘露糖苷鍵(圖1)的內(nèi)切水解酶[1-3],水解產(chǎn)生的甘露低聚糖具有優(yōu)異的生理活性,能夠有效改善腸道環(huán)境和功能,增強(qiáng)人體機(jī)能,是一種優(yōu)良的保健品。甘露聚糖酶在食品、飼料、醫(yī)藥、生物能源等的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用價(jià)值,同時(shí)也是降解植物生物量的重要自然資源[4-5]。

甘露聚糖酶在自然界中普遍存在[6-7],微生物是其最主要的生產(chǎn)來(lái)源[8],而細(xì)菌產(chǎn)的β-甘露聚糖酶比真菌來(lái)源的溫度穩(wěn)定性更好,尤其是以芽孢桿菌來(lái)源的甘露聚糖酶[9]。雖然目前有大量不同種類不同來(lái)源的β-甘露聚糖酶被發(fā)現(xiàn),但野生型β-甘露聚糖酶[10]尚不能完全滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求,酶學(xué)性質(zhì)上都存在一定的缺陷[11],如野生型甘露聚糖酶活性較低,部分野生型甘露聚糖酶對(duì)于魔芋粉的降解能力較差,無(wú)法充分利用我國(guó)豐富的魔芋資源。通過(guò)異源表達(dá)提高β-甘露聚糖酶的酶活和適用范圍,獲取活性較高的、生產(chǎn)成本較低的甘露聚糖酶,進(jìn)一步拓寬魔芋的應(yīng)用范圍,開(kāi)發(fā)高附加值的魔芋產(chǎn)品,無(wú)疑是甘露聚糖酶進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用市場(chǎng)的重要方式。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了甘露聚糖酶基因在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母、黑曲霉和里氏木霉中的成功表達(dá)[12-18],馬威等[19]將枯草芽孢桿菌MA139中的β-甘露聚糖酶基因進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)并在畢赤酵母X-33中進(jìn)行表達(dá),10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)誘導(dǎo)72 h時(shí),可達(dá)到最大酶活2100 U/mL,異源表達(dá)后甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)更優(yōu)良。但目前對(duì)魔芋葡甘聚糖具有高度專一性的β-甘露聚糖酶的克隆表達(dá)及性質(zhì)解析仍有待進(jìn)一步深入。

本實(shí)驗(yàn)室前期以魔芋粉為唯一碳源,從土壤中定向篩選出可高效降解魔芋葡甘聚糖為魔芋低聚糖的細(xì)菌BacillussubtilisG1[20]。本文擬將B.subtilisG1中的β-甘露聚糖酶基因BsmanA轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行高效表達(dá),利用表達(dá)載體中的His-Tag編碼序列對(duì)重組酶進(jìn)行分離純化,并研究重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì),為深入了解其在分子水平上的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及其進(jìn)一步應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌G1(BacillussubtilisG1)、EscherichiacoilDH5α、E.coilBL21(DE3) 本實(shí)驗(yàn)室保存菌株;質(zhì)粒pACYCDuet-1、Taq DNA polymerase、DL 5000 bp Marker、蛋白質(zhì)電泳Marker、6×loading Buffer、5×蛋白上樣緩沖液 TAKARA有限公司;BamH I和HindIII限制性內(nèi)切酶 上海生工生物工程有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 Vazyme生物技術(shù)有限公司;魔芋粉 宜昌一致魔芋公司 葡甘聚糖純度>95%;瓜爾膠 源葉生物 分析純;刺槐豆膠 SIGMA公司 分析純;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,純度>99.9%) Calbiochem公司;其它試劑國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純;PCR引物合成及測(cè)序 上海生工生物技術(shù)有限公司。

C1000 Touch PCR儀、Gel Doc XR+凝膠成像儀 Bio-Rad公司;UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理有限公司;SX-700蒸汽滅菌器、MX-307落地高速冷凍離心機(jī) 日本Tomy公司;NanoDrop One超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) Thermo公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;ZQLY-180S恒溫培養(yǎng)搖床 上海知楚儀器有限公司;LRH-250A生化培養(yǎng)箱 泰宏醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 依據(jù)TIANamp Soil DNA Kit試劑盒的方法從B.subtilisG1提取基因組DNA,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的β-甘露聚糖酶基因序列及表達(dá)載體pACYCDuet-1的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)如下:上游引物Man-F:5′-CAGCCAGGATCCAGGGGAGTTGCATTTG-3′(下劃線處為BamH I酶切位點(diǎn)),下游引物Man-R:5′-GGCCGCAAGCTTTTACTCAACGATTGGCGTTAAAG-3′(下劃線處為HindIII酶切位點(diǎn))。

PCR反應(yīng)體系:1 μL基因組DNA模板,2 μL Man-F(10 μmol/L),2 μL Man-R(10 μmol/L),25 μL Prime STAR MAX Premix(2X),20 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性10 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min 30 s,30個(gè)循環(huán),最后72 ℃保溫5 min。PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

將質(zhì)粒pACYCDuet-1經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切,膠回收目的條帶,與經(jīng)同樣雙酶切的目的基因PCR產(chǎn)物通過(guò)T4連接酶16 ℃過(guò)夜連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含100 μg/mL氯霉素的LB平板上,37 ℃避光培養(yǎng),篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)提取質(zhì)粒,經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切驗(yàn)證及送至上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序,將驗(yàn)證正確的克隆載體命名為pACYCDuet-1-BsmanA(如圖2)。

圖2 重組表達(dá)載體pACYCDuet-1-BsmanA結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Structural schematic diagram of recombinantexpression vector pACYCDuet-1-BsmanA

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化 將重組表達(dá)載體pACYCDuet-1-BsmanA轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含100 g/mL氯霉素的LB抗性平板上,篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將驗(yàn)證正確的含有pACYCDuet-1-BsmanA的E.coliBL21(DE3)單菌落接種于含100 μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)14 h。按OD600為0.1的接種量轉(zhuǎn)接到含100 μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)OD600至0.6。加入誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃度為0.8 mmol/L,于20 ℃,160 r/min誘導(dǎo)表達(dá)8 h后4 ℃、11000 r/min離心10 min收集菌體。用50 mmol/L、pH6.5的磷酸緩沖液洗滌菌體3次后,按菌體與緩沖液1∶10的比例加0.05 mol/L磷酸緩沖液重懸細(xì)胞,超聲波破碎后于4 ℃、11000 r/min離心30 min收集上清液。

本實(shí)驗(yàn)pACYCDuet-1-BsmanA中含有His-Tag編碼序列,采用Ni-NTA柱純化目標(biāo)蛋白的方法純化,將目的蛋白上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后上柱,分別用10 mL含20、40和300 mmol/L咪唑的緩沖液進(jìn)行洗脫,并按照每流出液1 mL為1毫分收集,收集活性部分保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶活力及蛋白質(zhì)的分析 酶活力的定義及測(cè)定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[21],重組蛋白分析采用SDS-PAGE[22],濃縮膠5%,分離膠10%,考馬斯亮藍(lán)R-250染色顯示蛋白帶;蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法[23]。

1.2.4 重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.4.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 將純化后的β-甘露聚糖酶用pH6.5的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液稀釋,分別于30～80 ℃的溫度下保溫10 min,測(cè)定酶活力,研究溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響;將酶液置于50～80 ℃下保溫90 min,每隔10 min取樣測(cè)定酶活力,研究酶在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.2.4.2 最適pH及pH穩(wěn)定性 分別在60 ℃,pH3.0～8.0的條件測(cè)定β-甘露聚糖酶的酶活力,研究酶的最適pH;將酶液加入上述不同梯度pH的緩沖液中稀釋,置于4 ℃條件下放置1 h后測(cè)定其殘留酶活力,研究酶在不同pH下的穩(wěn)定性。

1.2.4.3 酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析 用pH6.5、50 mmol/L的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液配制質(zhì)量濃度為5 g/L的魔芋粉、瓜爾膠、刺槐豆膠,測(cè)定β-甘露聚糖酶對(duì)不同底物的催化活力。以不同濃度(3～10 g/L)魔芋粉、瓜爾膠、刺槐豆膠(用pH6.5的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液配制)為底物,在pH6.5,60 ℃的條件下測(cè)定酶的催化活力,Km和Vmax值通過(guò)Linewear-Burk方法[24]得到。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast對(duì)PCR擴(kuò)增的基因序列進(jìn)行在線比對(duì),采用DNA STAR進(jìn)行蛋白的多序列比對(duì)并繪制質(zhì)粒pACYCDuet-1-BsmanA圖譜;采用Excel對(duì)重組酶酶學(xué)性質(zhì)數(shù)據(jù)作圖;采用Oridin 9.5軟件并進(jìn)行非線性擬合,計(jì)算β-甘露聚糖酶的Km和Vmax值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值為最終結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-甘露聚糖酶(BsmanA)基因的表達(dá)與純化

2.1.1 基因的擴(kuò)增及序列分析 PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示,獲得一條約為1100 bp的特異性單一亮條帶,與預(yù)期條帶大小一致。

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretic map of the PCR amplification products注:M為DL 5000 DNA Marker;泳道1、2為BsmanA基因。

將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果通過(guò)在線BLAST程序?qū)ENBANK中登錄的基因和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),擴(kuò)增所獲得的基因序列及推斷的蛋白質(zhì)序列與GenBank中已經(jīng)登錄的枯草芽孢桿菌WL-7和枯草芽孢桿菌CICC9011中的β-甘露聚糖酶基因和蛋白質(zhì)序列具有高度一致性,最高分別達(dá)到99%和98%,初步鑒定擴(kuò)增的基因?yàn)棣?甘露聚糖酶基因,將其命名為BsmanA基因。

2.1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 將上述PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物純化后,與質(zhì)粒pACYCDuet-1分別用BamH I和HindIII雙酶切(如圖4),酶切位點(diǎn)位于目的基因兩端,經(jīng)雙酶切后目的基因大小變化很小,電泳結(jié)果與預(yù)期相符,膠回收產(chǎn)物后將分別經(jīng)酶切的載體pACYCDuet-1與PCR產(chǎn)物通過(guò)T4連接酶過(guò)夜連接,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pACYCDuet-1-BsmanA。

圖4 PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切Fig.4 Double digestion of PCR products and plasmids注:M為DL5000 DNA Marker;泳道1為目的基因BsmanA;泳道2為BamH I和Hind III雙酶切目的基因BsmanA;泳道3為BamH I和Hind III雙酶切質(zhì)粒pACYCDuet-1;泳道4為質(zhì)粒pACYCDuet-1。

對(duì)篩選到的陽(yáng)性克隆pACYCDuet-1-BsmanA再次用BamH I和HindIII進(jìn)行雙酶切(圖5),1號(hào)泳道為BamH I和HindIII雙酶切質(zhì)粒pACYCDuet-1結(jié)果,于5000 bp位置附近可見(jiàn)一條清晰地條帶,3號(hào)泳道為雙酶切結(jié)果,可以清晰觀察到5000和1100 bp附近兩條電泳帶,條帶大小與質(zhì)粒及目的基因大小相符,可初步驗(yàn)證目的基因BsmanA成功連接至pACYCDuet-1。

圖6 重組蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.6 Amino acid sequence alignment of recombinant protein

圖5 重組表達(dá)質(zhì)粒pACYCDuet-1-BsmanA的酶切電泳圖譜Fig.5 Digestion Electrophoresis of Recombinant ExpressionPlasmid pACYCDuet-1-BsmanA注:M為DL5000 DNA Marker;泳道1為BamH I和Hind III雙酶切質(zhì)粒pACYCDuet-1;泳道2為質(zhì)粒pACYCDuet-1;泳道3為BamH I和Hind III雙酶切重組質(zhì)粒pACYCDuet-1-BsmanA。

2.1.3 序列分析 將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送至上海生工公司測(cè)序,并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示:該β-甘露聚糖酶基因的序列全長(zhǎng)為1098 bp,包含366個(gè)氨基酸的編碼序列。通過(guò)NCBI中的Blast比對(duì)β-甘露聚糖酶的氨基酸序列結(jié)果如圖6所示:該酶的氨基酸序列與芽孢桿菌屬來(lái)源的MK-2(2016)β-mannanase(man)gene(GenBank登錄號(hào):ANG59296.1)和Bacillussubtilissubsp. subtilis str. SC-8(GenBank登錄號(hào):EHA29041.1)的序列相似性高達(dá)99%。

2.1.4 重組蛋白的異源表達(dá)和純化 將樣品組(構(gòu)建成功的重組菌株E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA)和空白組(沒(méi)有整合BsmanA基因的pACYCDuet-1空載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)的空白菌株E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1),分別以IPTG為誘導(dǎo)劑以相同的條件進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),收集的菌體經(jīng)超聲破碎破壁后測(cè)定酶活(圖7),測(cè)得空白組菌株E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1無(wú)明顯β-甘露聚糖酶活力,誘導(dǎo)表達(dá)的樣品組重組菌株E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA破壁上清的β-甘露聚糖酶活力高達(dá)220 U/mg。而沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)作用的重組菌株E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA培養(yǎng)后也無(wú)法測(cè)得甘露聚糖酶活性。由此可證明,枯草芽孢桿菌G1中的β-甘露聚糖酶基因BsmanA成功地在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。

圖7 重組菌株與空載菌株酶活檢測(cè)Fig.7 Enzyme activity detection ofrecombinant and empty strains

重組菌菌體破壁上清液蛋白SDS-PAGE電泳分析如圖8所示,重組菌E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行異源表達(dá)的β-甘露聚糖酶含有His標(biāo)簽,經(jīng)鎳柱親和層析純化后,與重組菌菌體破壁上清液相比,純化后的目的蛋白條帶較單一,目的條帶分子量約為38 kD,與預(yù)期相符,這與已報(bào)道的BacillussubtilisBCC41051[25]中的β-甘露聚糖酶蛋白分子量相近,均為38 kD。

圖8 重組蛋白純化SDS-PAGE電泳Fig.8 Purification of SDS-PAGEelectrophoresis by recombinant protein 注:M為蛋白Marker;泳道1為40 mmol/L咪唑平衡緩沖液第10毫分;泳道2為40 mmol/L咪唑平衡緩沖液第1毫分;泳道3為20 mmol/L咪唑平衡緩沖液第6毫分;泳道4為粗酶液。

2.2 BsmanA的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性 溫度對(duì)重組甘露聚糖酶活力的影響結(jié)果如圖9所示,酶的最適溫度為60 ℃,在45～70 ℃間保持60%以上的酶活,由Srivastava等[26]研究可知,微生物來(lái)源的甘露聚糖酶在37～70 ℃的不同溫度下具有活性,從各種芽孢桿菌分離出的甘露聚糖酶在50～70 ℃范圍內(nèi)具有活性。一般來(lái)說(shuō),細(xì)菌甘露聚糖酶比真菌甘露聚糖酶更耐熱,這是紙漿漂白等工業(yè)應(yīng)用的一個(gè)重要特性。將該重組酶置于不同溫度下孵育90 min后,測(cè)定其剩余酶活力的結(jié)果顯示,在50～70 ℃保溫70 min時(shí),剩余酶活力在70%以上,可以認(rèn)為具有較好的熱穩(wěn)定性;當(dāng)處理溫度提高至80 ℃以上,酶活顯著降低。

圖9 重組甘露聚糖酶最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.9 Optimum reaction temperature and temperaturestability of recombinant mannanase注:A:重組β-甘露聚糖酶的最適溫度;B:重組β-甘露聚糖酶的溫度穩(wěn)定性。

圖10 重組甘露聚糖酶最適pH和pH穩(wěn)定性Fig.10 Optimum pH and pH stability of recombinant mannanase注:A:重組β-甘露聚糖酶的最適pH;B:重組β-甘露聚糖酶的pH穩(wěn)定性。

2.2.2 最適pH和pH穩(wěn)定性 不同pH對(duì)重組甘露聚糖酶活力的影響結(jié)果如圖10所示,純化后的甘露聚糖酶蛋白在pH6.5條件下酶活最高,且在pH5.0～7.0之間表現(xiàn)出顯著(P<0.05)活性,保留最高酶活79%以上的活性。酸堿度對(duì)酶功能的影響與酶底物復(fù)合物的形成有關(guān),催化作用往往依賴于酶和底物上的電荷分布。據(jù)報(bào)道,細(xì)菌來(lái)源的甘露聚糖酶在中性至堿性的pH下具有最大活性,例如Srivastava等[27]研究報(bào)道的Bacillussp. CFR1601產(chǎn)的一種β-甘露聚糖酶(GH-26)在pH7下具有最佳活性。在pH穩(wěn)定性方面,許多真菌來(lái)源獲得的-β-甘露聚糖酶在酸性到中性范圍(pH4.0～7.0)內(nèi)可保持最高酶活的80%活性,細(xì)菌甘露聚糖酶在pH6.0～9.0范圍內(nèi)表現(xiàn)出顯著的穩(wěn)定性[26],本實(shí)驗(yàn)中,在pH4.5～7.0,重組酶的酶活表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性,于4 ℃保溫1 h,剩余酶活仍達(dá)75%以上。

2.2.3β-甘露聚糖酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析 通過(guò)改變底物的濃度,測(cè)定純化后的重組甘露聚糖酶對(duì)不同底物的活性,結(jié)果顯示重組酶對(duì)魔芋粉精粉催化活性最高,將其對(duì)魔芋粉的催化活性定為100%,該酶對(duì)刺槐豆膠和瓜爾膠的催化活性遠(yuǎn)低于魔芋精粉,相對(duì)酶活分別為20.9%和0.08%。重組甘露聚糖酶對(duì)魔芋粉的Km和Vmax值分別為4.09 mg/mL和9.86 μmol/(mL·min)。

3 結(jié)論

本文從魔芋生長(zhǎng)的土壤里分離出一株具有甘露聚糖水解能力的枯草芽孢桿菌G1,研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的甘露聚糖酶對(duì)魔芋粉水解效率較高,能水解魔芋粉中的魔芋葡甘聚糖得到魔芋低聚糖,有效提高魔芋的深加工利用價(jià)值。

本研究中成功克隆枯草芽孢桿菌G1中的甘露聚糖酶BsmanA編碼基因并在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá),重組β-甘露聚糖酶為胞內(nèi)酶,對(duì)魔芋粉的比活性為220 U/mg,純化后的酶學(xué)性質(zhì)研究表明,該酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃;在50 ℃處理90 min 后殘留酶活性為64%,80 ℃處理30 min后殘留酶活性為35%;其最適pH為6.5,在pH4.5～7.0的范圍內(nèi)較穩(wěn)定;所測(cè)酶的最適底物為魔芋粉,其對(duì)魔芋粉的Km和Vmax值分別為4.09 mg/mL和9.86 μmol/(mL·min)。本研究描述了BsmanA的克隆和詳細(xì)的序列分析,這些研究為生物催化制備低聚甘露糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ),展示了其在食品和動(dòng)物飼料技術(shù)中的潛在應(yīng)用價(jià)值,也為其它新酶在的基因進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用上提供了新的思路和策略。