紅茶加工過程中纖維素酶和主要品質(zhì)成分的動態(tài)變化

,*

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,安徽黃山 245000;2.安徽弋江源茶業(yè)有限公司,安徽黟縣 245500)

紅茶是我國六大茶類之一,經(jīng)過萎凋、揉捻、發(fā)酵等工藝,在多種酶的催化下發(fā)生復(fù)雜的酶促氧化與聚合縮合反應(yīng),特別是水解酶和氧化還原酶,使葉片內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生劇烈的變化,最終在干燥后終止酶活反應(yīng),由此形成紅茶優(yōu)良的品質(zhì)[1-3]。纖維素酶作為一種水解酶,分為β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)、內(nèi)切葡聚糖酶(endo-glucanase,EG)和外切葡聚糖酶(exo-glucanase,EXG),可以降解細(xì)胞壁,使細(xì)胞間的物質(zhì)與水分相互轉(zhuǎn)運(yùn),協(xié)調(diào)其他酶促反應(yīng)的進(jìn)行[4]。

目前國內(nèi)外對紅茶加工過程中酶活性和品質(zhì)成分含量變化的研究較多。β-葡萄糖苷酶通過催化茶葉糖苷類香氣前體物質(zhì)發(fā)生水解反應(yīng),生成芳樟醇、香葉醇等香氣物質(zhì),一般從萎凋過程開始,在揉捻和發(fā)酵階段逐漸加速[5-8]。兒茶素總量在紅茶加工過程中會逐漸降低;氨基酸含量在紅茶初制過程先上升后降低;咖啡堿在紅茶加工中含量緩慢減少,但變化不顯著[9-11],這些復(fù)雜的變化共同構(gòu)成了紅茶優(yōu)良品質(zhì)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。在茶葉加工過程中纖維素酶各組分之間存在協(xié)同作用,但關(guān)于纖維素酶的另外兩種—EG和EXG的研究卻相對較少[12]。

目前紅茶萎凋多采用熱風(fēng)萎凋方式,但本課題組的前期試驗(yàn)表明采用日光萎凋加工而成的紅茶湯色紅亮、滋味醇厚、甜香濃郁。為探究紅茶加工過程中茶葉品質(zhì)成分的相對變化,本研究以鳧早2號為原料,通過日光萎凋、揉捻、發(fā)酵等加工工序研究紅茶不同加工過程中β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶及外切葡聚糖酶的活性及可溶性糖、兒茶素、咖啡堿、游離氨基酸等品質(zhì)成分含量變化,為紅茶加工工藝機(jī)理與品質(zhì)提升提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試茶鮮葉 采自6年生茶樹品種“鳧早2號”(C.sinensiscv. Fuzao 2),種于安徽省農(nóng)科院茶葉研究所品種園內(nèi);乙腈(色譜級)、甲醇(色譜級)、醋酸 美國Tedia公司;咖啡堿(caffeine,CF)標(biāo)品、5種兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(兒茶素(Catechin,C)、表兒茶素(Epicatechin,EC)、表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin-3-gallate,ECG)、表沒食子兒茶素(Epigallocatechin,EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechingallate,EGCG)) 美國Sigma公司;茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 北京百靈威科技有限公司;35種游離氨基酸分析標(biāo)準(zhǔn)品 德國Sykam公司。

2010A 高效液相色譜儀 日本島津公司;Phenomenex C18色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm)、SYKAM 433D氨基酸分析儀 德國Sykam公司;酶標(biāo)儀Multiskan GO 美國Thermo Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制作 傍晚時采摘一芽二、三葉為材料,室內(nèi)攤放12 h;于次日上午日光萎凋6 h(上午8點(diǎn)至下午2點(diǎn)),過程中需不定時翻動及室內(nèi)靜置以避免葉片萎凋不均勻;揉捻40 min;25 ℃、95% RH發(fā)酵室發(fā)酵90 min;110 ℃初烘10 min;室溫?cái)倹?0 min;80 ℃復(fù)烘30 min。取鮮葉(FL)攤放12 h(S12H),日光萎凋2 h(W2H),日光萎凋4 h(W4H),日光萎凋6 h(W6H),揉捻葉(RL),發(fā)酵30(F30M)、60(F60M)、90 min(F90M)作為過程樣品。

用于酶活測定的過程樣品立即液氮處理,冷凍后于-80 ℃儲存待測。用于兒茶素、游離氨基酸、可溶性糖等含量測定的過程樣采用微波固樣法[13],微波1200 W,3 min終止物質(zhì)代謝,80 ℃ 60 min烘干。磨樣過篩(40目)后-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 纖維素酶活性測定

1.2.2.1 葉片粗酶液制備 取茶樣2 g,加入pH5.0的100 mmol·L-1檸檬酸三鈉/檸檬酸緩沖液20 mL、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(Crosslinking polyvingypyrrolidone,PVPP)1 g、石英砂0.5 g,冰上勻速研磨至糊狀。勻漿液離心(8000 r/min,4 ℃)5 min,取上清后離心(10000 r/min,4 ℃)10 min,上清液即為粗酶液[14]。

1.2.2.2 內(nèi)切葡聚糖酶活性測定 采用3,5二硝基水楊酸(DNS)定糖法[15-16],5 g·L-1的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)200 μL、粗酶液200 μL和100 mmol·L-1檸檬酸三鈉—檸檬酸緩沖液(pH5.0)600 μL。49 ℃溫浴2 h,用DNS試劑3 mL終止反應(yīng),沸水浴處理10 min,冷卻后于540 nm下測吸光值。以反應(yīng)前加入3 mL DNS終止反應(yīng)為對照。

1.2.2.3 外切葡聚糖酶活性測定 外切葡聚糖酶活性和β-葡萄糖苷酶活性測定反應(yīng)體系和條件與內(nèi)切葡聚糖酶相同,但底物分別為10 mmol·L-1的4-硝基苯-β-D-纖維素二糖苷(PNPC)和10 mmol·L-1對硝基-β-D-葡萄糖苷(pNPG),以2.5 mL的1 mol·L-1Na2CO3終止反應(yīng),于405 nm下測定吸光值。反應(yīng)前加入2.5 mL Na2CO3終止反應(yīng)為對照[17]。

1.2.2.4 酶活計(jì)算方式 參照周漢琛等[18]計(jì)算方法。內(nèi)切葡聚糖酶活性的計(jì)算根據(jù)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1),以1 mL粗酶液每10 min催化生成1 μmoL葡萄糖為1個酶活單位[U(10 min)-1·mL-1]。外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性根據(jù)對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)計(jì)算,以1 mL粗酶液每10 min催化生成1 μmol對硝基苯酚為1 個酶活單位[U(10 min)-1·mL-1]。

1.2.3 可溶性糖含量測定 稱取10 mg樣品放入試管中,加入15 mL 純水后沸水浴20 min,冷卻后過濾至100 mL容量瓶,定容。取1 mL提取液加入5 mL蒽酮,沸水浴10 min,冷卻后于620 nm下測量吸光值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)計(jì)算可溶性糖含量,每個樣品重復(fù)3次。

1.2.4 兒茶素、咖啡堿、游離氨基酸的測定 采用高效液相色譜(HPLC)測量茶樣兒茶素、咖啡堿的含量,氨基酸分析儀檢測游離氨基酸的含量,樣品前處理、氨基酸分析儀條件、HPLC條件分別參考周漢琛等[19]、雷攀登等[20]。兒茶素、咖啡堿的含量計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)、樣品各組分峰面積進(jìn)行換算。氨基酸含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品響應(yīng)面積計(jì)算[21]。每個樣品重復(fù)3次。

表1 物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curve of compounds

1.3 數(shù)據(jù)處理

內(nèi)含成分利用SPSS 19.0軟件做單因素方差分析和顯著性分析,利用Origin 6.0作圖。所有數(shù)據(jù)均為3個生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 加工過程中纖維素酶活性變化

如圖1所示,隨著萎凋時間的增加,β-葡萄糖苷酶活性整體上逐漸增強(qiáng),日光萎凋2 h后,其酶活性是鮮葉中的146%,日光萎凋4 h后活性有所下降,到6 h后,活性上升至最高;揉捻結(jié)束后活性迅速降低,是萎凋6 h的42%;發(fā)酵過程中持續(xù)下降。林方謙[22]對紅茶加工過程中β-葡萄糖苷酶的活性變化進(jìn)行研究,結(jié)果表明,β-葡萄糖苷酶在萎凋過程中活性逐漸增加,是鮮葉的2倍,而在揉捻、發(fā)酵過程中酶活性迅速下降。紅碎茶β-葡萄糖苷酶在萎凋階段活性上升至萎凋結(jié)束,揉切開始下降[8]。

圖1 紅茶加工過程中纖維素酶活性變化Fig.1 Variation of cellulase activity during black tea processing注:FL:鮮葉;S12H:攤放12 h;W2H:日光萎凋2 h;W4H:日光萎凋4 h;W6H:日光萎凋6 h;RL:揉捻葉;F30M:發(fā)酵30 min;F60M:發(fā)酵60 min;F90M:發(fā)酵90 min。圖2～圖3、表2同。EG:內(nèi)切葡聚糖酶;BG:β-葡萄糖苷酶;EXG:外切葡聚糖酶;不同字母表示相同指標(biāo)不同加工進(jìn)程差異顯著(P<0.05),圖2同。

這可能是紅茶在萎凋階段,水分逐漸減少,內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,pH下降,提高水解酶活性[18]。揉捻期間,葉片的細(xì)胞組織破碎使得酚類物質(zhì)大量析出,與蛋白質(zhì)作用形成酶的天然沉淀劑,降低β-葡萄糖苷酶活性。在發(fā)酵階段,酶底物含量減少,從而酶活性持續(xù)下降[22]。

內(nèi)切葡聚糖酶活性總體上隨著加工工序的進(jìn)行而升高,且酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于β-葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶;外切葡聚糖酶總體變化不顯著,揉捻結(jié)束后活性稍有下降,發(fā)酵進(jìn)程中先升后降,穩(wěn)定在0.012～0.022 U(10 min)-1·mL-1。

2.2 加工過程中可溶性糖含量變化

從圖2可知,可溶性糖含量總體呈波動下降趨勢,在日光萎凋開始后有回升,6 h后與鮮葉中含量一致,并達(dá)到最高值2.93%,揉捻完成后下降至2.74%,之后緩慢下降。喬小燕等[23]以丹霞2號為材料,分析紅茶萎凋和發(fā)酵過程中品質(zhì)成分變化,結(jié)果表明,隨著萎凋時間的延長,可溶性糖含量呈現(xiàn)出先降后升的趨勢;隨著發(fā)酵時間的延長,可溶性糖含量呈下降趨勢。紅茶萎凋時,葉片中所含水分減少,水解酶活性提高,促進(jìn)茶樣細(xì)胞壁多糖類的降解、可溶性糖的釋放[18]。揉捻階段葉片的細(xì)胞組織破碎使得糖類物質(zhì)進(jìn)一步分解成有機(jī)酸,到發(fā)酵階段糖類物質(zhì)持續(xù)下降[22]。

圖2 紅茶加工過程中可溶性糖含量變化趨勢Fig.2 Variation tendency of soluble sugarcontent during black tea processing

2.3 加工過程中兒茶素和咖啡堿含量變化

兒茶素和咖啡堿是茶葉苦澀味的來源,本研究采用HPLC檢測紅茶加工過程中兒茶素和咖啡堿含量變化,結(jié)果如圖3所示。

表2 紅茶加工過程中游離氨基酸含量變化(mg/g)Table 2 Content variation of amino acid during black tea processing(mg/g)

圖3 紅茶加工過程中兒茶素和咖啡堿含量變化Fig.3 Content variation of catechinsand caffeine during black tea processing注:C:兒茶素;EGC:表沒食子兒茶素;EC:表兒茶素;EGCG:表沒食子兒茶素沒食子酸酯;ECG:表兒茶素沒食子酸酯;CF:咖啡堿。

注：“-”表示未檢測到該物質(zhì);不同字母代表不同加工進(jìn)程下同一種氨基酸含量差異顯著(P<0.05)。

兒茶素總量萎凋時先增加后下降,揉捻時下降迅速,之后變緩,且兒茶素各組分間含量不同:EGCG>ECG>EGC>EC>C。各兒茶素類物質(zhì)在紅茶加工過程中參與多種反應(yīng),不同的加工過程中有明顯變化,尤其是揉捻結(jié)束后,所有兒茶素類物質(zhì)含量均有不同程度的降低,其中變化最顯著的是酯型兒茶素EGCG,含量下降至8.03 mg/g,是萎凋后的16.5%,和ECG、EGC含量相當(dāng)。已有研究表明,隨著萎凋失水程度加重,兒茶素總量呈現(xiàn)先增后減、總體減少趨勢。在揉捻階段急劇減少,發(fā)酵階段變化較小的趨勢[24-25]?？赡芤?yàn)轷r葉萎凋時,多酚氧化酶活性逐漸增加,兒茶素類物質(zhì)開始氧化,使兒茶素總量增加[26]。揉捻使得葉片的細(xì)胞組織破碎,加快兒茶素和多酚氧化酶的反應(yīng)速率,導(dǎo)致兒茶素總量在揉捻后大幅度降低[8]。發(fā)酵階段,兒茶素含量變少,氧化速率變慢[27]。咖啡堿在紅茶萎凋過程中呈增加趨勢但不顯著[28-29]?？Х葔A在鮮葉、萎凋葉、揉捻葉、發(fā)酵葉中的含量為34.05、37.05、36.08、35.60 mg/g,整個加工過程中變化不顯著。這可能與咖啡堿化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定的特性有關(guān)[1]。

2.4 加工過程中游離氨基酸含量變化

游離氨基酸是茶葉鮮味的重要呈味物質(zhì),用氨基酸分析儀檢測出24種游離氨基酸(表2),游離氨基酸總量隨著萎凋時間增加而上升,在萎凋4 h時,達(dá)到最高值38.9315 mg/g。揉捻結(jié)束后,氨基酸總量有所下降,而在發(fā)酵初期開始上升,后隨發(fā)酵進(jìn)程降低。已有學(xué)者對工夫紅茶加工過程中氨基酸含量的變化研究表明氨基酸總量在紅茶萎凋階段中明顯增加,揉捻過程稍有降低,發(fā)酵進(jìn)程進(jìn)一步減少[30-31]。萎凋過程促進(jìn)葉蛋白中的低分子蛋白質(zhì)、多肽類化合物水解,使氨基酸含量增加[32]。隨著發(fā)酵的深入,雖然蛋白質(zhì)持續(xù)水解,但游離氨基酸參與脫氨、脫羧等眾多反應(yīng),形成了相應(yīng)的醇、醛、酸等,導(dǎo)致氨基酸含量下降[33]。

游離氨基酸含量總體上呈先升后降趨勢,但各類氨基酸含量變化不一。天冬氨酸和茶氨酸含量在攤放12 h后達(dá)到頂峰,之后開始下降;從鮮葉到萎凋結(jié)束,隨著加工工序的進(jìn)行,蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β-丙氨酸、組氨酸、1-甲基組氨酸、色氨酸、賴氨酸及精氨酸的含量呈增加趨勢,揉捻階段緩慢降低;谷氨酸、蛋氨酸、α-氨基丁酸、β-氨基異丁酸、鳥氨酸在萎凋4 h含量最高;而胱氨酸和γ-氨基丁酸在發(fā)酵初期分解最多。

在以上24種氨基酸中,天冬氨酸、谷氨酸、茶氨酸等鮮爽味氨基酸占氨基酸總量比重大,含有芳香環(huán)的芳香類氨基酸[34]如精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸在萎凋結(jié)束后含量顯著(P<0.05)增加,纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等苦味氨基酸在發(fā)酵結(jié)束后含量明顯降低,說明茶葉加工工藝會影響茶葉品質(zhì),日光萎凋有利于芳香類物質(zhì)的揮發(fā),而發(fā)酵則使苦味氨基酸含量降低,對紅茶茶湯鮮爽甜醇滋味的形成有重要作用。

3 結(jié)論

茶葉品質(zhì)成分多少是決定茶葉品質(zhì)好壞的重要物質(zhì)基礎(chǔ),對紅茶加工過程中纖維素酶和品質(zhì)成分的動態(tài)變化研究顯示,在紅茶加工過程中β-葡萄糖苷酶活性、兒茶素總量、氨基酸總量呈現(xiàn)一致規(guī)律:在萎凋階段結(jié)束后達(dá)到最高值,分別是0.091 U(10 min)-1·mL-1、97.6 mg/g、38.9315 mg/g,揉捻階段迅速下降,發(fā)酵階段緩慢降低?？扇苄蕴呛靠傮w呈下降趨勢,由萎凋后2.93%降至揉捻后2.74%再至發(fā)酵后2.5%。紅茶在萎凋階段,β-葡萄糖苷酶活性強(qiáng),促進(jìn)兒茶素類物質(zhì)氧化、蛋白類化合物水解、糖類物質(zhì)的降解,使兒茶素總量、氨基酸和可溶性糖含量增加;而在揉捻和發(fā)酵階段,β-葡萄糖苷酶由于底物減少活性持續(xù)減弱,但兒茶素類物質(zhì)、蛋白類化合物、糖類物質(zhì)進(jìn)一步氧化、水解和降解,導(dǎo)致含量持續(xù)下降。咖啡堿因其穩(wěn)定性在紅茶加工過程中變化不顯著。內(nèi)切葡聚糖酶活性在萎凋至發(fā)酵階段從0.19 U(10 min)-1·mL-1增加至0.51 U(10 min)-1·mL-1,而外切葡聚糖酶活性變化不顯著。

關(guān)于纖維素酶目前研究較多的是β-葡萄糖苷酶,內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶研究較少,本文對這3種酶在紅茶加工過程中的變化趨勢做初步判斷,但其運(yùn)作機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時,如何根據(jù)品質(zhì)成分變化規(guī)律來完善紅茶加工工藝,從而提高紅茶品質(zhì)的工作需要進(jìn)一步開展。