單寧酸對(duì)小麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)的影響

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(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070;2.環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430070;3.湖北省功能食品工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430070)

食品體系中往往共存多種大分子和小分子,如蛋白質(zhì)、多糖、多酚等,它們之間難免會(huì)發(fā)生相互作用[1]。其中兩種組分之間,如蛋白質(zhì)與多糖、蛋白質(zhì)與多酚等產(chǎn)生相互作用會(huì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象,導(dǎo)致膠體結(jié)構(gòu)(如復(fù)合物、納米顆粒和微膠囊)的形成,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的物化性質(zhì),實(shí)現(xiàn)單一組分不具備的某些功能特性,擴(kuò)展了其在食品和藥品等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。例如,多糖的加入提高了蛋白質(zhì)在模擬胃液條件下的乳化性[2]。相互作用的類型可分為非共價(jià)相互作用(氫鍵、疏水相互作用和靜電力等)與共價(jià)相互作用(酶誘導(dǎo)和非酶誘導(dǎo)(堿誘導(dǎo)、自由基誘導(dǎo))),對(duì)此兩種相互作用的研究近年來取得一定的進(jìn)展。例如單寧酸與玉米醇溶蛋白非共價(jià)結(jié)合可以提高其乳化特性[3],蛋白質(zhì)與多糖間共價(jià)結(jié)合可以有效提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解度[4]。

單寧酸(Tannic Acid,TA)是一種天然多酚,屬于一種可水解單寧。它含有約25個(gè)羥基,可用來參與氫鍵、疏水鍵等非共價(jià)鍵的形成,也可通過氧化后形成醌進(jìn)行席夫堿等反應(yīng)參與共價(jià)鍵的形成[5-6]。因此,它可以與許多小分子(生物堿)和大分子(蛋白質(zhì)、多糖等)反應(yīng)[7]。由于其廣泛的來源和多種生物學(xué)特性,如抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等[8],單寧酸廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。小麥醇溶蛋白是谷類中的一種醇溶性蛋白,富含脯氨酸[9]。小麥醇溶蛋白(gliadin)由一個(gè)短的N末端,中間重復(fù)區(qū)域和C末端組成[10],可使其具有兩親特性。近年來,小麥醇溶蛋白由于生物兼容、可生物降解、可生物代謝等優(yōu)點(diǎn)經(jīng)常被作為食品添加劑使用,例如肉制品填充劑、面包改良劑等。

小麥醇溶蛋白由于其雙親性,可以自組裝形成膠體顆粒。近年來,研究者發(fā)現(xiàn)在乳液遞送系統(tǒng)中小麥醇溶蛋白納米顆?？梢宰鳛榉€(wěn)定劑來使用,但單獨(dú)的小麥醇溶蛋白具有較差的穩(wěn)定性[11],并且穩(wěn)定的Pickering乳液只能維持?jǐn)?shù)天[12]。引入單寧酸期望可以改善納米顆粒的穩(wěn)定性,增加蛋白穩(wěn)定Pickering乳液的保質(zhì)期。

相同的兩種組分在不同的處理?xiàng)l件下可能需要不同的組裝方式,從而導(dǎo)致不同理化性質(zhì)的產(chǎn)生。因此基于之前的報(bào)道[3,13],實(shí)驗(yàn)研究了小麥醇溶蛋白與單寧酸之間通過非共價(jià)與堿誘導(dǎo)的共價(jià)方式形成復(fù)合體系,采用紫外、熒光、紅外等技術(shù)手段,分析了單寧酸以不同方式結(jié)合小麥醇溶蛋白時(shí)兩者間不同的組裝機(jī)制,并探究了不同組裝機(jī)制對(duì)小麥醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)及功能特性的影響。同時(shí)比較了兩者通過不同組裝機(jī)制結(jié)合對(duì)復(fù)合物功能性質(zhì)的影響,為將兩者在乳液遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉 食品級(jí),封丘縣華豐粉業(yè)有限公司;二氯乙烷 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;單寧酸(Mw 1701) 阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;鄰苯二甲醛(OPA)、ABTS(2,2′-azino-di-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid)、DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 分析純,美國Sigma公司。

F-4600熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司;DSC-60差示掃描量熱儀、UV-1700紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司;Nexus470傅立葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小麥醇溶蛋白的提取 小麥醇溶蛋白的提取過程參考Joye等[14]的方法。在室溫下使用二氯甲烷對(duì)谷朊粉進(jìn)行脫脂2 h(谷朊粉/二氯甲烷溶液為1∶7,w/v)后,抽濾收集粉末。并將上述過程重復(fù)2次,將得到的粉末室溫下干燥12 h,至溶劑揮發(fā)完全。干燥后將粉末加入70%(v/v)乙醇-水溶液中(粉末/溶液為1∶10,w/v),攪拌3 h,然后以9000×g 4 ℃的條件離心10 min收集上清液。在40 ℃下旋蒸30 min除去乙醇,直至有少量粉末析出。最后,將所得懸濁液冷凍干燥后收集小麥醇溶蛋白,并用研缽研至粉末狀。通過氮分析儀(FP-428,Leco Corp.,St. Joseph,MI,USA)分析粉末中蛋白含量為88.86%。

1.2.2 小麥醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合物制備 小麥醇溶蛋白/單寧酸的非共價(jià)/共價(jià)復(fù)合物的制備過程參考已報(bào)道的研究方法[15]。將醇溶蛋白和單寧酸溶于70%(v/v)乙醇-水溶液中,用0.2 mol/L NaOH調(diào)至pH9.0,使其充分接觸空氣(敞口攪拌)并在室溫下攪拌24 h。得到的溶液再在室溫下靜置24 h來確保完全分散和溶解,所得溶液為小麥醇溶蛋白/單寧酸共價(jià)復(fù)合物溶液(標(biāo)記為共價(jià)復(fù)合物)。所用小麥醇溶蛋白與單寧酸的質(zhì)量比為1∶0.01～1∶0.09 (w/w),對(duì)應(yīng)圖1中小麥醇溶蛋白濃度固定時(shí),相對(duì)應(yīng)的單寧酸濃度為0.29、0.87、1.45、2.03、2.61 μmol/L。相同條件下不添加單寧酸制得堿處理后的蛋白樣品(標(biāo)記為gliadin,經(jīng)堿處理)。

非共價(jià)復(fù)合物(標(biāo)記為非共價(jià)復(fù)合物)在以上述方式但不調(diào)節(jié)pH與隔絕氧氣(閉口攪拌)的條件下制備而得,以此相同條件不添加單寧酸時(shí)制得對(duì)照蛋白溶液(標(biāo)記為gliadin)。

1.2.3 小麥醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合物的熒光光譜分析

1.2.3.1 熒光光譜的測(cè)定 室溫條件下,小麥醇溶蛋白的內(nèi)源熒光用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。小麥醇溶蛋白濃度固定為0.5 mg/mL,非共價(jià)復(fù)合物的測(cè)定中所用單寧酸濃度依次為0.005、0.015、0.025、0.035、0.045 mg/mL,共價(jià)復(fù)合物的測(cè)定中所用單寧酸濃度為0.025 mg/mL。其中激發(fā)波長設(shè)置為290 nm,發(fā)射波長為280～500 nm[16],激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。

1.2.3.2 淬滅類型分析 利用Stern-Volmer方程對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以求得淬滅類[17]。

式(1)

式中:F-有淬滅劑時(shí)小麥醇溶蛋白的熒光強(qiáng)度;F0-無淬滅劑時(shí)小麥醇溶蛋白的熒光強(qiáng)度;Kq-速率常數(shù);t0-沒有淬滅劑時(shí)生物大分子的平均熒光壽命;[Q]-淬滅劑濃度;Ksv-Stern-Volmer淬滅常數(shù)。

針對(duì)靜態(tài)淬滅與動(dòng)態(tài)淬滅同時(shí)存在的情況,利用Stern-Volmer方程修正形式進(jìn)行分析[18]。

式(2)

式中:F0、F、[Q]代表含義同上;KD-動(dòng)態(tài)淬滅常數(shù);KS-靜態(tài)淬滅常數(shù)。

1.2.3.3 結(jié)合位點(diǎn)計(jì)算 通過以下方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)[19]:

式(3)

方程中:Ka-結(jié)合常數(shù);n-結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.2.3.4 熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算 熱力學(xué)參數(shù)通過以下公式計(jì)算得到[20]:

式(4)

ΔG=ΔH-TΔS

式(5)

方程中:R-氣體常數(shù),空氣的氣體常數(shù)約為8.314 J/(mol·K);T-實(shí)驗(yàn)溫度(開氏度);Ka-與溫度T對(duì)應(yīng)的結(jié)合常數(shù)。

1.2.4 小麥醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合物的自由氨基含量測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯二甲醛(OPA)法[21]測(cè)定蛋白與復(fù)合物中自由氨基的含量。準(zhǔn)確稱取80 mg鄰苯二甲醛溶于2 mL乙醇中,然后依次加入50 mL 0.1 mol/L硼砂,200 μL巰基乙醇,和5 mL 20%(w/w)十二烷基硫酸鈉(SDS),定容至100 mL,此為OPA試劑。測(cè)定時(shí)取4 mL OPA試劑于試管中,將1.2.2中所得到的小麥醇溶蛋白或復(fù)合物溶液稀釋至適當(dāng)濃度后注入400 μL于試管中,室溫下混勻后反應(yīng)2 min,340 nm下測(cè)量吸光值。以4 mL OPA試劑中加入 400 μL 70%乙醇-水溶液為空白。以L-亮氨酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)曲線與測(cè)得的吸光度算出樣品中自由氨基的含量。

1.2.5 傅立葉變換紅外光譜分析(FTIR) 采用溴化鉀壓片法測(cè)定紅外光譜。將1.2.2中所得溶液凍干后得到小麥醇溶蛋白與復(fù)合物粉末,將凍干后的粉末與溴化鉀以1∶100 (w/w)的比例進(jìn)行混合,烘干后用瑪瑙研缽研磨至均勻粉末后壓制成片。光譜的掃描范圍是4000～400 cm-1,采用溴化鉀為空白對(duì)照。采用PeakFit v 4.12進(jìn)行處理,利用高斯去卷積和求二次導(dǎo)數(shù)的方法對(duì)酰胺I帶區(qū)域(1700～1600 cm-1)的原始光譜進(jìn)行分析。利用Thermo Scientific OMNIC軟件對(duì)FTIR光譜進(jìn)行基線校正。通過對(duì)酰胺I帶區(qū)域進(jìn)行二階求導(dǎo),蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要峰可以分為α-螺旋(1646～1664 cm-1),β-折疊(1615～1637 cm-1和1682～1700 cm-1),β-轉(zhuǎn)角(1664～1681 cm-1)和無規(guī)則卷曲(1637～1645 cm-1)。通過高斯方程計(jì)算各個(gè)峰的面積所占百分比來對(duì)比二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.6 紫外可見吸收光譜分析(UV-visible) 將1.2.2中所得樣品溶液稀釋至適當(dāng)濃度后置于1 cm比色皿中測(cè)量。波長的掃描范圍是190～400 nm,掃描速度為200 nm/min。

1.2.7 復(fù)合物熱穩(wěn)定性及抗氧化性分析

1.2.7.1 差示掃描量熱分析(DSC) 取5.0 mg 1.2.5中凍干得到的粉末,置于鋁盤中并進(jìn)行密封,以密封空鋁盤作為空白對(duì)照。升溫速率設(shè)為10 ℃/h,加熱范圍為25～150 ℃,氮?dú)饬魉贋?0 mL/min。

1.2.7.2 DPPH自由基清除活性 自由基清除活性參考Gong等[22]的方法。1 mmol/L DPPH乙醇溶液,置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)藏以備使用。使用時(shí)將DPPH用乙醇稀釋至0.1 mmol/L。試驗(yàn)中將1.2.2中所得溶液稀釋至適當(dāng)濃度后,取20 μL與3.8 mL DPPH乙醇溶液混合20 s后,暗中儲(chǔ)藏1 h,在517 nm下測(cè)量吸光值。

式中:As為樣品吸光度;Ac為空白對(duì)照的吸光度。

1.2.7.3 ABTS自由基清除活性 ABTS自由基清除活性參考Pellegrini等[23]的方法。將5 mL ABTS(7 mmol/L)母液與5 mL 過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)混合,并避光靜置12 h以上,制備成ABTS工作液。實(shí)驗(yàn)時(shí)將工作液用乙醇稀釋至λ734=0.7±0.02。將1.2.2中所得溶液稀釋至適當(dāng)濃度后,取0.1 mL與3.9 mL ABTS工作液充分混合后并在黑暗環(huán)境下靜置8 min,734 nm下測(cè)量吸光值。通過以下方程計(jì)算ABTS自由基清除活性:

式中:As是樣品吸光度,Ac是空白對(duì)照的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn),顯著水平為0.05。所有測(cè)試至少進(jìn)行3次,數(shù)據(jù)為三次測(cè)定的平均值,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酸與小麥醇溶蛋白反應(yīng)作用力探究

圖1 小麥醇溶蛋白/單寧酸非共價(jià)復(fù)合物熒光發(fā)射圖譜Fig.1 Fluorescence emission scans ofgliadin/TA non-covalent complex注:A到F分別表示不同單寧酸濃度下小麥醇溶蛋白的內(nèi)源熒光。

2.1.1 熒光光譜分析 圖1為小麥醇溶蛋白/單寧酸非共價(jià)復(fù)合物的熒光發(fā)射圖譜。小麥醇溶蛋白的最大發(fā)射波長約在340 nm,這與醇溶蛋白之前報(bào)道過的最大發(fā)射波長相似[24]。相比于水溶液中色氨酸的最大發(fā)射波長在約355 nm處,最大發(fā)射波長有所偏移。這是由于本實(shí)驗(yàn)采用的溶劑為70%乙醇-水溶液,相對(duì)于水溶液來說,70%乙醇-水溶液的溶劑極性降低,所以造成色氨酸的最大發(fā)射波長藍(lán)移。隨著單寧酸濃度的增加,最大發(fā)射波長發(fā)生紅移,表示復(fù)合物的疏水性增加,可能是單寧酸的結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)更加舒展而使更多疏水基團(tuán)暴露出來所致。

圖2 小麥醇溶蛋白的Stern-Volmer曲線(A)及其修正曲線(B)Fig.2 Stern-Vlommer curve(A)and the modifiedform of Stern-Volmer equation(B)of gliadin

根據(jù)式1分析熒光淬滅類型。圖2A代表三個(gè)溫度下Stern-Volmer方程的分析結(jié)果,不同溫度下的Stern-Volmer圖均表現(xiàn)了向上曲率,且向y軸凹。此結(jié)果表明單寧酸對(duì)醇溶蛋白的淬滅機(jī)制是靜態(tài)淬滅與動(dòng)態(tài)淬滅同時(shí)存在的[16]?；诖私Y(jié)果,引入式(2)分析熒光淬滅數(shù)據(jù)。

表1 小麥醇溶蛋白/單寧酸非共價(jià)相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters of the non-covalent interaction of gliadin and TA

圖2B顯示了不同溫度下單寧酸對(duì)醇溶蛋白的淬滅曲線,單寧酸與醇溶蛋白間的Stern-Volmer淬滅常數(shù)Ksv(Ksv=KD+KS)在30、35、40 ℃三個(gè)溫度下分別為0.2600×106、0.4515×106和1.1433×106M-1。根據(jù)已知的Ksv和色氨酸的t0為3 ns[25]可以算出速率常數(shù)Kq(Kq=Ksv/t0)分別為8.67×1012、1.51×1013和3.81×1013M-1s-1。在動(dòng)態(tài)淬滅中,最大碰撞淬滅常數(shù)為 2.0×1010M-1s-1,本研究中得到的淬滅速率常數(shù)遠(yuǎn)大于2.0×1010M-1s-1。單寧酸的加入引起了醇溶蛋白熒光分子吸收光譜的紅移,可以推測(cè)單寧酸與醇溶蛋白的淬滅機(jī)制中靜態(tài)淬滅占主導(dǎo)地位,并且兩者之間形成了復(fù)合物。

利用式(3)分析小麥醇溶蛋白與單寧酸的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)與結(jié)合常數(shù)。如圖3為單寧酸淬滅醇溶蛋白的雙對(duì)數(shù)曲線,在30、35、40 ℃時(shí),單寧酸與醇溶蛋白之間的結(jié)合常數(shù)Ka分別為6.74×109M-1(lg(F0-F)/F=9.8289+1.5987 lg[Q])、6.24×109M-1(lg(F0-F)/F=9.7953+1.5875 lg[Q])和1.42×108M-1(lg(F0-F)/F=8.1546+1.2905 lg[Q])。數(shù)據(jù)表明從30 ℃到40 ℃,單寧酸與小麥醇溶蛋白的結(jié)合常數(shù)Ka較大,說明兩者間具有較強(qiáng)的結(jié)合力。隨著溫度升高,表觀結(jié)合常數(shù)降低,表明溫度升高對(duì)兩者間的結(jié)合不利,復(fù)合物變的相對(duì)不穩(wěn)定。結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為1.5987、1.5875和1.2905,說明兩者大約是以1∶1(摩爾比)的比例結(jié)合[16]。

圖3 單寧酸與小麥醇溶蛋白相互作用的雙對(duì)數(shù)曲線Fig.3 Double-lg plots of interactionbetween TA and gliadin at different temperatures

根據(jù)式(4)、式(5),焓變(ΔH)和熵變(ΔS)可以通過lnK對(duì)1/T曲線的斜率與橫坐標(biāo)估算得到。據(jù)圖4和表1可知,ΔG<0表明兩者間為自發(fā)的反應(yīng)。并且單寧酸與醇溶蛋白反應(yīng)的ΔH<0,且ΔS<0,故可推斷兩者間主要是通過氫鍵相結(jié)合[26]。

圖4 單寧酸與小麥醇溶蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Fig.4 Thermodynamic parameters for interactionbetween TA and gliadin at different temperatures

2.1.2 自由氨基的變化 本研究采用鄰苯二甲醛(OPA)法檢測(cè)蛋白質(zhì)中的自由氨基含量,可以用來反應(yīng)賴氨酸側(cè)鏈的相關(guān)信息[27]。由表2可知,相同單寧酸含量下,共價(jià)復(fù)合物中自由氨基含量比非共價(jià)復(fù)合物中的自由氨基含量低。因加入的SDS可以破壞非共價(jià)鍵,所以自由氨基含量的降低說明了堿處理會(huì)使醇溶蛋白中的自由氨基-NH2與氧化后的單寧酸發(fā)生席夫堿反應(yīng)[28],生成C-N鍵,醇溶蛋白與單寧酸形成共價(jià)復(fù)合物。與此同時(shí),體系內(nèi)隨著單寧酸含量的增加,同一復(fù)合物體系中自由氨基含量也隨之增加,其原因可能是由于單寧酸的結(jié)合,蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生去折疊,導(dǎo)致更多的氨基暴露出來,因此會(huì)使得自由氨基含量增加。

表2 小麥醇溶蛋白和小麥醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合物的自由氨基含量Table 2 Free amino groups of gliadinand gliadin/TA complexes

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 結(jié)構(gòu)的變化

2.2.1 三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

2.2.1.1 紫外光譜的測(cè)定 通過紫外可見光譜來探究單寧酸對(duì)于小麥醇溶蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。圖5A的紫外吸收光譜可清晰的觀察到280 nm附近存在一個(gè)吸收峰,此吸收峰主要由色氨酸和酪氨酸殘基產(chǎn)生。引入單寧酸后該吸收峰的強(qiáng)度增加說明小麥醇溶蛋白與單寧酸間形成了復(fù)合物并進(jìn)一步改變了蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。非共價(jià)與共價(jià)兩種復(fù)合物的吸光度分別比小麥醇溶蛋白與經(jīng)堿處理的小麥醇溶蛋白的吸光度高,說明單寧酸的結(jié)合導(dǎo)致蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)展開,使得芳香雜環(huán)疏水基團(tuán)周邊的微環(huán)境極性增大[29-30]。此外,共價(jià)復(fù)合物的吸光度明顯高于非共價(jià)復(fù)合物的吸光度,表明共價(jià)交聯(lián)方式使得小麥醇溶蛋白分子更加伸展,導(dǎo)致更多的芳香雜環(huán)疏水基團(tuán)暴露。

2.2.1.2 內(nèi)源熒光的測(cè)定 通過內(nèi)源熒光光譜來探究單寧酸對(duì)于小麥醇溶蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。圖5B可以看出經(jīng)過堿處理后,醇溶蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度增強(qiáng),可能是由于堿處理改變了蛋白質(zhì)中色氨酸的內(nèi)環(huán)境所致?；谙惹暗难芯拷Y(jié)果,多酚的芳環(huán)可以與蛋白質(zhì)的色氨酸或酪氨酸反應(yīng),造成蛋白內(nèi)源熒光淬滅[31]。因此,復(fù)合物的熒光淬滅也進(jìn)一步表明醇溶蛋白與單寧酸之間發(fā)生了相互作用。與非共價(jià)復(fù)合物相比,共價(jià)復(fù)合物中醇溶蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度更低,說明共價(jià)相互作用更強(qiáng),單寧酸會(huì)與色氨酸側(cè)鏈上的自由氨基不可逆交聯(lián)。最大發(fā)射波長發(fā)生藍(lán)移,說明色氨酸處于非極性環(huán)境下;而當(dāng)?shù)鞍追肿尤?jí)結(jié)構(gòu)開始伸展,色氨酸更多的暴露在極性環(huán)境下時(shí),最大發(fā)射波長會(huì)發(fā)生紅移[32]。與醇溶蛋白相比,復(fù)合物的最大發(fā)射波長發(fā)生紅移,說明形成復(fù)合物時(shí)蛋白分子發(fā)生去折疊,使色氨酸暴露在更加親水的環(huán)境中。與非共價(jià)復(fù)合物相比,共價(jià)復(fù)合物的最大發(fā)射波長紅移的程度更深,說明共價(jià)交聯(lián)對(duì)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)影響更多。

圖5 小麥醇溶蛋白和小麥醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合物的紫外可見圖譜(A)與熒光發(fā)射圖譜(B)(gliadin∶TA=1∶0.05,w/w)Fig.5 UV-visible spectra(A)and fluorescence spectra(B)ofgliadin and gliadin-TA complexes(preparedwith a gliadin/TA ratio of 1∶0.05,w/w)

圖7 小麥醇溶蛋白和小麥醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)酰胺I帶擬合曲線Fig.7 Curve-fitted amide I region with secondary structure determination 注:A:醇溶蛋白;B:非共價(jià)復(fù)合物;C:醇溶蛋白(經(jīng)堿處理);D:共價(jià)復(fù)合物;醇溶蛋白∶TA=1∶0.05 (w/w)。

2.2.2 傅立葉變換紅外光譜分析 圖6為凍干并烘干去除水分后小麥醇溶蛋白和小麥醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合物的紅外光譜圖。如圖6A單寧酸在3385 cm-1處的特征峰代表酚基或羥基的伸縮振動(dòng)[33],該峰在單寧酸如圖6A,單寧酸在3385 cm-1處的特征峰代表酚基或羥基的伸縮振動(dòng)[33],該峰在單寧酸與小麥醇溶蛋白反應(yīng)之后發(fā)生右移,說明單寧酸的羥基或酚基參與了兩者間的反應(yīng)。與小麥醇溶蛋白反應(yīng)之后發(fā)生右移,說明單寧酸的羥基或酚基參與了兩者間的反應(yīng)。1716 cm-1是酯鍵基團(tuán)的特征峰,1613、1533、1448 cm-1是由于苯環(huán)的骨架振動(dòng)產(chǎn)生[34]。小麥醇溶蛋白的光譜表現(xiàn)出的主要峰值為3312(酰胺A帶,N-H的伸縮振動(dòng))、1659(酰胺I帶,C=O的伸縮振動(dòng))和1540 cm-1(酰胺II帶,C-N的伸縮振動(dòng)和N-H的平面彎曲振動(dòng))。在與單寧酸形成復(fù)合物后,主要峰分別移動(dòng)到3215、1662和1537 cm-1,說明了氫鍵相互作用的存在,與之前非共價(jià)復(fù)合物熒光結(jié)果一致(圖1D)。圖6B中所示兩條線段a和b代表一樣的長度,可看出隨著單寧酸含量的增加,1540 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度明顯變?nèi)?說明兩者間發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)[35-36]。1258 cm-1代表OC-NH伸縮振動(dòng),引入單寧酸后,該峰吸收明顯增強(qiáng),說明反應(yīng)過程中有C-N鍵的形成[37]。1540 與1258 cm-1處吸收峰強(qiáng)度分別變?nèi)鹾驮鰪?qiáng),共同說明了單寧酸與小麥醇溶蛋白在堿誘導(dǎo)過程中發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。

表3 小麥醇溶蛋白和小麥醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量(%)Table 3 Secondary structure content of gliadin and gliadin/TA complexes(%)

圖6 小麥醇溶蛋白和小麥醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合物的紅外光譜Fig.6 FTIR spectra of gliadin and gliadin/TA complexes注:A:非共價(jià)復(fù)合物;B:共價(jià)復(fù)合物,圖中所示比例為醇溶蛋白∶TA(w/w)。

由于蛋白質(zhì)的紅外光譜通常伴隨著二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變,本研究進(jìn)一步采用傅立葉自解卷積的方法對(duì)1600～1700 cm-1區(qū)域的紅外光譜進(jìn)行高斯線性擬合,得到蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。如圖7和表3所示,經(jīng)過堿處理后小麥醇溶蛋白中α-螺旋含量從32.46%增加到38.03%,β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量均有不同程度的下降。形成非共價(jià)復(fù)合物時(shí)的小麥醇溶蛋白分子中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量比未與單寧酸結(jié)合時(shí)的小麥醇溶蛋白分別降低3.34%和1.43%,β-折疊和無規(guī)則卷曲的含量分別增加1.12%和1.65%。形成共價(jià)復(fù)合物時(shí)的小麥醇溶蛋白中α-螺旋的含量比經(jīng)過堿處理的小麥醇溶蛋白降低9.31%,β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量分別增加5.43%、2.26%和1.62%。結(jié)果表明單寧酸的結(jié)合會(huì)使蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變的更加無序,同時(shí)以共價(jià)交聯(lián)方式形成復(fù)合物會(huì)使蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變更多。這可以用來解釋表2中非共價(jià)復(fù)合物和共價(jià)復(fù)合物中的自由氨基隨著復(fù)合物中單寧酸含量的增加分別增多的現(xiàn)象,單寧酸的加入使蛋白去折疊,游離氨基更多的暴露了出來。

2.3 功能特性的變化

2.3.1 熱穩(wěn)定性 通過差示掃描量熱(DSC)可以反應(yīng)單寧酸的結(jié)合對(duì)于小麥醇溶蛋白熱穩(wěn)定性的影響。圖8可以看出小麥醇溶蛋白在 60.94 ℃存在一個(gè)吸熱峰,這代表蛋白質(zhì)的熱變性溫度。經(jīng)過堿處理后蛋白的吸熱峰變?yōu)?2.76 ℃,這表明采用堿處理的方法可以使蛋白的熱穩(wěn)定性小幅度增加。非共價(jià)復(fù)合物的熱變性溫度為55.55 ℃,共價(jià)復(fù)合物的熱變性溫度為63.78 ℃。表明單寧酸采用非共價(jià)方式與醇溶蛋白相互作用時(shí),不利于蛋白的熱穩(wěn)定性,而醇溶蛋白通過共價(jià)鍵與單寧酸結(jié)合可以提高其熱穩(wěn)定性,這與之前報(bào)道過的結(jié)果相似[38]。

圖8 小麥醇溶蛋白和小麥醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合物的差示掃描量熱圖譜Fig.8 DSC analyses of gliadin and gliadin/TA complexes

2.3.2 抗氧化活性 通過DPPH和ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)可以反應(yīng)單寧酸的結(jié)合對(duì)于小麥醇溶蛋白抗氧化活性的影響。圖9表示出了各個(gè)樣品的抗氧化活性,小麥醇溶蛋白本身不具有抗氧化活性,單寧酸的加入使復(fù)合物具有了抗氧化活性。這是由于單寧酸的羥基對(duì)于抗氧化能力有較大的貢獻(xiàn)[39],兩者形成復(fù)合物后相對(duì)于小麥醇溶蛋白引入了更多的羥基,使其抗氧化活性得到提高。相比于游離單寧酸,單寧酸與小麥醇溶蛋白結(jié)合后對(duì)其本身的抗氧化能力有一定的抑制作用,這可能是由于單寧酸上一部分羥基參與了與蛋白間的相互作用所致。共價(jià)復(fù)合物的抗氧化能力比非共價(jià)復(fù)合物的抗氧化能力小,是由于在使用堿交聯(lián)的方法形成共價(jià)復(fù)合物時(shí),單寧酸上的羥基氧化生成醌[40],導(dǎo)致了羥基數(shù)量的減少,從而造成抗氧化能力的進(jìn)一步降低。

圖9 小麥醇溶蛋白和小麥醇溶蛋白/單寧酸復(fù)合物的抗氧化性 Fig.9 Antioxidant activities of gliadinand gliadin/TA complexes

3 結(jié)論

目前,為了擴(kuò)展蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用,蛋白質(zhì)與多酚間的非共價(jià)相互作用已被研究的較為透徹。本實(shí)驗(yàn)從探究兩者間非共價(jià)與共價(jià)相互作用力出發(fā),對(duì)比了形成的兩種復(fù)合物對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性與抗氧化性方面造成的差異,為蛋白質(zhì)在食品中的應(yīng)用增加了新的可能性。實(shí)驗(yàn)采用簡單的堿處理方法,使單寧酸可以成功接枝到小麥醇溶蛋白分子上并與其側(cè)鏈上的氨基發(fā)生反應(yīng)。非共價(jià)復(fù)合時(shí),小麥醇溶蛋白與單寧酸主要通過氫鍵相互作用進(jìn)行靜態(tài)結(jié)合,并且結(jié)合常數(shù)大約為1∶1。與單寧酸復(fù)合后,蛋白中α-螺旋含量降低,β-轉(zhuǎn)角含量升高,蛋白分子結(jié)構(gòu)展開,導(dǎo)致蛋白分子中自由氨基含量升高。與非共價(jià)結(jié)合方式相比,共價(jià)交聯(lián)方式對(duì)蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)影響更大。非共價(jià)復(fù)合使小麥醇溶蛋白的熱變性溫度降低,而共價(jià)結(jié)合方式使小麥醇溶蛋白的熱變性溫度小幅度提升。單寧酸的引入使蛋白具有了抗氧化活性,非共價(jià)復(fù)合物的抗氧化性強(qiáng)于共價(jià)復(fù)合物。