紅樹莓果酒發(fā)酵過程中功效成分、香氣物質(zhì)及體外降血糖功效的動態(tài)變化

饒炎炎，桑 英，唐琳琳，陳思睿，馮建文，傅茂潤，劉亞敏，王金玲,

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院園藝分院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.齊魯工業(yè)大學（山東科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353；4.西南大學資源環(huán)境學院，重慶 400716）

紅樹莓，薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus L.）， 聚合漿果，完全成熟后柔軟多汁，不耐貯運，多加工成紅樹莓果汁、果醬、果酒等，營養(yǎng)豐富，具有保健功效[1]。國內(nèi)外大都直接借鑒葡萄酒的生產(chǎn)工藝[2]，基本 解決了紅樹莓果酒發(fā)酵中的共性問題。針對紅樹莓成分的研究集中在特定成分[3-5]和揮發(fā)性物質(zhì)[6]的分析測定，而對紅樹莓果酒發(fā)酵過程的主要功效成分的綜合性研究鮮見報道。

目前對降血糖功效的研究主要采用體外酶抑制、細胞實驗和動物實驗[7]等。體外實驗法主要利用酶抑制劑降低α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的消化吸收，使用抑制率表征其在體內(nèi)的降血糖 水平[8]。李萌萌等[9]研究了樹莓籽黃酮對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性有較強的抑制作用。

本實驗通過對不同發(fā)酵階段紅樹莓果酒的活性成分、有機酸種類及含量和香氣物質(zhì)進行測定，同時以 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率為評價指標測定體外降血糖功效，利用高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分別對8 種有機酸含量和香氣物質(zhì)進行定量研究，揭示果酒發(fā)酵過程中功效成分、香氣物質(zhì)及其體外降血糖功效的動態(tài)變化，為改進發(fā)酵工藝、提高果酒品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓果（秋福）采自黑龍江省尚志市，速凍處理（-15～-20 ℃）后運回東北林業(yè)大學食品科學與工程實驗室凍藏。

葡萄酒高活性酵母BV818 安琪酵母股份有限 公司；甲醇、有機酸（草酸、酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、莽草酸）（均為色譜純）、α-葡萄糖苷酶（100 U/g）、α-淀粉酶（4 000 U/g）、 4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S電熱恒溫水浴鍋 上海森信試驗儀器有限公司；DL-6M榨汁機 湖南星科科學儀器有限公司；ELx800NB型酶標儀 美國BioTek公司；722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；KW-3000DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；1200型高效液相色譜儀（配紫外檢測器） 美國安捷倫科技有 限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅樹莓果酒制備工藝流程

紅樹莓凍果→解凍→破碎打漿→浸漬→成分調(diào)整→主發(fā)酵→分離→后發(fā)酵→倒罐→陳釀→澄清→精濾→裝瓶→殺菌

1.3.2 操作要點

將紅樹莓凍果置于室溫解凍，破碎打漿得紅樹莓果醪，4～6 ℃浸漬2 d，向紅樹莓果醪中添加一定量的白砂糖（第1天調(diào)整糖度為21 °Brix，第5天調(diào)整糖度為14 °Brix）和質(zhì)量分數(shù)0.3‰ H2SO3；按質(zhì)量分數(shù)0.25‰比例接入酵母種子液（稱取2 g葡萄酒高活性酵母BV818于20 倍質(zhì)量的0.04 g/mL蔗糖溶液中，26～30 ℃活化60 min）于紅樹莓果醪中，將發(fā)酵醪置于20～25 ℃發(fā)酵21 d，發(fā)酵過程中每12 h攪拌1 次以便完全發(fā)酵；經(jīng)發(fā)酵的紅樹莓果酒密封陳釀10～12 個月；陳釀結(jié)束后，將紅樹莓果酒經(jīng)板框過濾機過濾調(diào)配、裝瓶并進行巴氏滅菌。

取樣：紅樹莓果醪計作第0天；將酵母接入發(fā)酵醪的時間計作發(fā)酵第1天，紅樹莓果酒的發(fā)酵期為21 d左右，從而設(shè)置樣品采集時間分別為1、3、5、7、9、13、17、21 d；紅樹莓果酒的陳釀期樣品采集時間分別為50、80、130、180、240、300 d。陳釀期間紅樹莓果酒的質(zhì)量濃度在（39.20±0.01）～（43.50±0.13）mg/mL范圍內(nèi)變化。

1.3.3 乙醇體積分數(shù)和活性成分的測定

量取紅樹莓果汁和不同發(fā)酵階段的紅樹莓果酒，進行測定。

乙醇體積分數(shù)測定：參照GB/T 15038—2008《葡萄酒、果酒通用分析方法》；花色苷含量測定：采用pH示差法[10]；總酚含量測定：采用福林-酚法[10]，以沒食子酸質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標，760 nm波長處吸光度為縱坐標，得到回歸方程為y=0.077 7x-0.002 6，R2=0.999 5；黃酮含量測定：采用硝酸鋁法[11]，以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標，510 nm波長處吸光度為縱坐標，得到回歸方程為y=0.006 7x+0.001 2，R2=0.999 5；原花青素含量測定：采用鹽酸-香草醛法[12]，以兒茶素質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標，499 nm波長處吸光度為縱坐標，得到回歸方程為y=3.231 4x+0.003，R2=0.999 0。

1.3.4 有機酸含量的測定

1.3.4.1 色譜條件及標準品制備

色譜柱：Waters C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.005 g/mL磷酸二氫鉀-甲醇（97∶3，V/V）；流速0.7 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；檢測波長210 nm[13]。

分別精密準確稱取0.040 0 g草酸、0.020 0 g富馬酸、0.020 0 g莽草酸、0.200 0 g酒石酸、0.020 0 g乳酸、0.200 0 g蘋果酸、0.040 0 g檸檬酸、0.040 0 g琥珀酸，用超純水溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，得到有機酸標準母液。分別吸取有機酸標準母液配制成質(zhì)量濃度為2 μg/mL富馬酸和莽草酸，20 μg/mL乳酸，40 μg/mL草酸、檸檬酸、琥珀酸，200 μg/mL酒石酸和蘋果酸的有機酸混合標準溶液。

1.3.4.2 樣品的制備

將紅樹莓果汁和不同發(fā)酵階段紅樹莓果酒8 000 r/min離心10 min，以除去菌體和雜質(zhì)，取上清液1 mL，用純凈水定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾至進樣瓶，隨后進行液相色譜測定。在1.3.4.1節(jié)色譜條件下，根據(jù)保留時間對有機酸定性，采用外標法以有機酸對應(yīng)的峰面積與標準品的峰面積相比較定量分析樣品中有機酸含量，有機酸含量按式（1）計算：

1.3.5 香氣物質(zhì)的測定

1.3.5.1 樣品的處理

取約20 mL樣品加入40 mL樣品瓶中，將樣品瓶放入60 ℃水浴中平衡10 min，將老化好（老化時間5 min）的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取器插入樣品瓶中，將石英纖維頭暴露于樣品瓶的頂空氣體中，恒溫60 ℃萃取30 min，用手柄將纖維頭推回針頭內(nèi)拔出，插入氣相色譜-質(zhì)譜進樣器于250 ℃解吸1 min，進行測定[14]。

1.3.5.2 氣相色譜-質(zhì)譜測定條件

色譜條件：DB-5色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；載氣He，流速1.0 mL/min；采用程序升溫方式，由初始溫度升至80 ℃保持2 min，然后以 6 ℃/min升至230 ℃，保持13 min，不分流進樣。

質(zhì)譜條件：電子電離源；離子源溫度225 ℃；全掃描；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍50～500 u。

定性與定量：將采集到的質(zhì)譜圖與NIST02 MS Library圖譜庫進行檢索對比，并用氣相色譜峰面積歸一化法定量計算出各揮發(fā)性成分在紅樹莓果汁及不同發(fā)酵階段紅樹莓果酒中的相對含量。

1.3.6 體外降血糖功效的測定

1.3.6.1 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

參照Kumar等[15]的方法并加以改進。取稀釋20 倍的不同發(fā)酵階段的紅樹莓果酒100 μL于96 孔酶標板中，加入1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液（用0.1 mol/L磷酸緩沖溶液配制，pH 6.8）50 μL，37 ℃孵育15 min使酶活化后，加入10 mg/mL底物4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液（用0.1 mol/L磷酸緩沖溶液配制，pH 6.8）50 μL，充分混勻后于37 ℃水浴10 min，加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液100 μL終止反應(yīng)，于405 nm波長處測定吸光度，同時設(shè)定相同體系下的樣品對照組、空白對照組，α-葡萄糖苷酶的抑制率按式（2）計算：

式中：A樣品為待測樣品與酶參與反應(yīng)吸光度；A對照為只加待測樣品不加酶吸光度；A空白為0.1 mol/L磷酸緩沖溶液和酶反應(yīng)吸光度。

1.3.6.2 α-淀粉酶抑制率的測定

參照Jdir等[16]的方法并加以改進。取稀釋20 倍的不同發(fā)酵階段的紅樹莓果酒100 μL，加入1 U/mL的α-淀粉酶溶液（用0.1 mol/L磷酸緩沖溶液配制，pH 6.8）50 μL，37 ℃孵育15 min使酶活化后，加入0.01 g/mL可溶性淀粉溶液50 μL，充分混勻后于37 ℃水浴10 min，加入1 mol/L的DNS溶液5 μL終止反應(yīng)，沸水浴10 min后冷卻至室溫，加入10 mL蒸餾水稀釋后于540 nm波長處測定吸光度，同時設(shè)定相同體系下的樣品對照組、空白對照組，α-淀粉酶的抑制率按式（2）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進行錄入、計算實驗數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)表示為±s（n≥3），采用Origin 8.0軟件作圖，SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，Pearson相關(guān)系數(shù)進行相關(guān) 性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹莓果酒發(fā)酵過程中乙醇體積分數(shù)的動態(tài)變化

圖 1 紅樹莓果酒釀造期間乙醇體積分數(shù)的動態(tài)變化Fig. 1 Changes in total sugar and alcohol contents during the brewing of red raspberry wine

由圖1可知，紅樹莓果酒發(fā)酵過程中，乙醇體積分數(shù)呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。發(fā)酵0～3 d，乙醇體積分數(shù)顯著上升（P＜0.05），由（0.00±0.005）%升高至（6.16±0.57）%，發(fā)酵3～21 d，乙醇體積分數(shù)繼續(xù)上升至發(fā)酵期結(jié)束為（15.60±0.25）%。造成以上變化的原因主要是在果酒發(fā)酵初期，酵母代謝活動旺盛，糖類物質(zhì)被大量用于酵母的生長繁殖和乙醇發(fā)酵，從而導致乙醇體積分數(shù)迅速上升，隨著發(fā)酵進入中后期，酵母能利用的糖類物質(zhì)減少，乙醇體積分數(shù)的變化趨于平穩(wěn)[17]。

陳釀50～300 d，乙醇體積分數(shù)變化幅度較小。這是因為果酒中的糖類物質(zhì)基本被消耗殆盡，乙醇體積分數(shù)因此不再上升，最終穩(wěn)定在（18.00±0.07）%左右。

2.2 紅樹莓果酒發(fā)酵過程中活性成分的動態(tài)變化

2.2.1 紅樹莓果酒發(fā)酵過程中總酚、花色苷的動態(tài)變化

由圖2可知，紅樹莓果酒發(fā)酵過程中，花色苷、總酚呈先上升后緩慢下降的趨勢。紅樹莓果汁（發(fā)酵第0天）的花色苷質(zhì)量濃度為（165.34±5.37）mg/L，發(fā)酵1～9 d，花色苷逐漸降低，由（173.64±5.72）mg/L下降至（90.97±6.36）mg/L，前期可能是花色苷的積累及浸漬作用，后期由于酵母在乙醇發(fā)酵期間產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶能水解花色苷的糖苷鍵，造成花色苷下降。王行等[18]研究發(fā)現(xiàn)藍莓酒發(fā)酵過程花色苷在第1天達到峰值，之后逐漸降低，與本實驗研究結(jié)果相似。紅樹莓果汁（發(fā)酵第0天）的總酚為（145.16±3.10）mg/L，發(fā)酵1～9 d，總酚質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05），由（153.32± 2.26）mg/L下降至（124.66±0.04）mg/L，前期可能是浸漬作用使總酚升高，后期由于酵母產(chǎn)生大量次級代謝產(chǎn)物，多酚類化合物與蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)結(jié)合或吸附，從而導致酒液中總酚含量下降[19]。

圖 2 紅樹莓果酒釀造期間總酚、花色苷的動態(tài)變化Fig. 2 Changes in total phenols and anthocyanins contents during the brewing of red raspberry wine

陳釀50～300 d，酒液的花色苷質(zhì)量濃度繼續(xù)降低，最終維持在（54.39±4.51）mg/L左右；總酚質(zhì)量濃度穩(wěn)定在（116.53±2.36）mg/L。陳小玲等[20]研究發(fā)現(xiàn)在藍莓果酒發(fā)酵過程中，花色苷含量逐漸降低，與本實驗研究結(jié)果相似。與未發(fā)酵的紅樹莓果汁相比，陳釀300 d的果酒總酚、花色苷分別保留了約80%和33%，這表明花色苷在果酒釀造期間的穩(wěn)定性不佳，易受酸、堿、光、熱、氧氣等多種因素的影響。

2.2.2 紅樹莓果酒釀造期間黃酮、原花青素的動態(tài)變化

圖 3 紅樹莓果酒釀造期間黃酮、原花青素的動態(tài)變化Fig. 3 Changes in flavonoids and procyanidins contents during the brewing of red raspberry wine

由圖3可知，紅樹莓果酒發(fā)酵過程中，黃酮、原花青素呈先上升后下降的趨勢。發(fā)酵0～1 d，酒液的黃酮質(zhì)量濃度由（57.10±0.17） mg/L上升至（60.19±0.29） mg/L， 發(fā)酵3～9 d，黃酮質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05），由（56.72±0.74） mg/L上升至（67.03±0.30） mg/L；發(fā)酵0～5 d，原花青素質(zhì)量濃度由（5.77±0.16） mg/L達到最大值（6.38±0.04） mg/L，這可能是由于原花青素廣泛存在于樹莓籽、皮中[21]，發(fā)酵期間樹莓籽、皮中的原花青素被浸提出來，導致其含量升高。

陳釀50～300 d，酒液的黃酮質(zhì)量濃度逐漸降低，由（63.80±0.59） mg/L下降至（54.22±0.17） mg/L， 張強等[22]研究表明紅樹莓果醋在發(fā)酵過程中黃酮含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，之后趨于穩(wěn)定。陳釀50～130 d，原花青素呈下降趨勢，之后趨于穩(wěn)定，其質(zhì)量濃度由（5.40±0.06） mg/L迅速下降至（4.35±0.04） mg/L，300 d果酒的原花青素質(zhì)量濃度為（4.32±0.07） mg/L。與未發(fā)酵的紅樹莓果汁相比，陳釀300 d的果酒黃酮、原花青素分別保留了約95%和75%，這表明黃酮類物質(zhì)在果酒釀造期間損失較少。

2.3 紅樹莓果酒發(fā)酵過程中有機酸種類和含量的動態(tài)變化

有機酸是紅樹莓果酒的重要組成部分，在果實的成熟階段、果酒的加工及陳釀期間都會引起有機酸組成和含量的變化。而有機酸的種類和含量影響紅樹莓果酒的協(xié)調(diào)性、口感、色澤及生物穩(wěn)定性，與果酒的典型性、品質(zhì)關(guān)系密切[23]。通過采用高效液相色譜法對紅樹莓果汁和不同階段紅樹莓果酒中的有機酸進行測定，主要有機酸含量見表1、圖4。

表 1 紅樹莓果酒釀造期間有機酸含量的動態(tài)變化Table 1 Changes in organic acid contents in red raspberry wine during brewing

由表1可知，紅樹莓果汁（發(fā)酵第0天）中的檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸較高，草酸和L-蘋果酸較低，未檢出富馬酸和莽草酸。與紅樹莓果汁相比，紅樹莓果酒中有機酸種類增多，新生成了富馬酸和莽草酸。紅樹莓果酒發(fā)酵期間，酒石酸、草酸和莽草酸的變化規(guī)律相似，隨著發(fā)酵的進行含量均緩慢升高，在發(fā)酵第5天含量達到最高；L-蘋果酸隨著發(fā)酵時間的延長不斷積累；乳酸和琥珀酸的變化規(guī)律相似，在第5天時大量生成，在發(fā)酵第7天時含量達到最大值；檸檬酸隨著發(fā)酵時間的延長含量逐漸降低。檸檬酸、琥珀酸、乳酸、蘋果酸在發(fā)酵期間變化幅度較大，主要是由于其為碳代謝的中心物質(zhì)，是酵母菌糖降解途徑的主要中間產(chǎn)物。紅樹莓果酒陳釀期間，L-蘋果酸呈緩慢升高趨勢，在第130天時大幅增加；琥珀酸在第130天時大量生成，此后隨著陳釀的進行，琥珀酸緩慢降低；草酸、酒石酸和莽草酸呈降低趨勢；檸檬酸、乳酸隨著陳釀時間的延長其含量略微下降后逐漸穩(wěn)定。富馬酸在果酒釀造期間較少，基本穩(wěn)定在0.006 g/L。

圖 4 紅樹莓果汁與發(fā)酵300 d紅樹莓果酒中主要有機酸占比Fig. 4 Percentages of major organic acids in red raspberry juice and red raspberry wine fermented for 300 d

由圖4可知，紅樹莓果汁和果酒中的有機酸種類和含量存在明顯差異。紅樹莓果汁（發(fā)酵第0天）中的檸檬酸約占有機酸總量的95%；發(fā)酵300 d的紅樹莓果酒中的檸檬酸約占有機酸總量的79%，比發(fā)酵前降低了16%；與紅樹莓果汁相比，琥珀酸增加了8.14%，L-蘋果酸增加了5.09%，乳酸增加了3.49%，檸檬酸會產(chǎn)生一種令人愉快的兼有清香感的酸味，而乳酸的酸味柔和，有后酸味，可提供柔和的風味，增加了紅樹莓果酒的醇厚感[15]。

研究表明，紅樹莓果汁的有機酸成分與葡萄差異很大，成冰等[24]測定分析了不同品種釀酒葡萄的有機酸含量，其中釀酒白葡萄的主要有機酸以酒石酸、蘋果酸為主，釀酒紅葡萄以蘋果酸和檸檬酸為主；紅樹莓果酒的有機酸以檸檬酸、琥珀酸為主，L-蘋果酸、乳酸次之，酒石酸、草酸微量，同時因發(fā)酵代謝積累了少量莽草酸和富馬酸，與韓曉鵬等[25]的研究結(jié)果基本吻合。目前樹莓酒的釀酒酵母大多采用葡萄酒專用活性酵母，制成的果酒不能突出樹莓的獨特風味且酸度較高，今后可以考慮進行樹莓專用釀酒酵母的研制、篩選降解檸檬酸的酵母菌或在發(fā)酵前去除部分檸檬酸等研究。

2.4 紅樹莓果酒發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)的動態(tài)變化

香氣物質(zhì)是衡量果酒風味品質(zhì)的重要指標，果酒的香氣主要來自果實本身、酵母發(fā)酵及陳釀等過程，是樹莓果酒風味化學研究的重點。通過氣相色譜-質(zhì)譜得到的色譜圖，與標準質(zhì)譜庫NIST檢索匹配，選取匹配度不小于85%的物質(zhì)進行分析，主要香氣成分見表2、3。

表 2 紅樹莓果酒發(fā)酵期間香氣物質(zhì)及相對含量的動態(tài)變化Table 2 Changes in aroma components contents during fermentation of red raspberry wine

由表2可知，發(fā)酵第0天（紅樹莓果汁）鑒別出18 種香氣物質(zhì)，相對含量為83.32%，其中醇類2 種，相對含量為1.51%；酮類5 種，相對含量為63.40%，其中β-紫羅酮相對含量為40.72%，α-紫羅酮相對含量為14.60%；酯類4 種，相對含量為6.59%；烯萜類2 種，相對含量為2.77%；其他類5 種，相對含量為9.05%。α-紫羅酮和 β-紫羅酮是C13降異戊二烯類香氣物質(zhì)，在很多樹莓品種中被檢出，被認為是樹莓中的特征香氣物質(zhì)。α-紫羅酮具有一種罐藏桃子和烤蘋果香味，其香氣閾值很低，僅為0.09 μg/L；β-紫羅酮具有花香和樹莓香[26]。決定樹莓風味特征的揮發(fā)性化合物——樹莓酮，其化學名稱為對-羥基苯基-2-丁酮，由于其具有較低的揮發(fā)性，因此較難用固相微萃取方法萃取到[27]，因此果酒中并未檢出。

紅樹莓果酒發(fā)酵期間鑒別出46 種香氣物質(zhì)，其中醇類3 種、酮類5 種、酸類2 種、酯類23 種、烯萜類7 種、其他類6 種，以酯類、醇類和酮類物質(zhì)為主。香氣物質(zhì)總相對含量呈先升高后降低，之后略有上升趨勢。其中酯類物質(zhì)逐漸增加，其中鄰二甲酸二乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、甲酸異戊酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、油酸乙酯逐漸增加，月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯、油酸甲酯先增加后緩慢下降。大多數(shù)酯類具有花果香氣，如辛酸乙酯略帶有玫瑰、橙子的花果香氣，是白蘭地酒特有的香味物質(zhì)[28]；苯甲酸乙酯具有濃烈的花香，并帶有水果的清香氣味，癸酸乙酯具有似葡萄的水果香氣，是葡萄酒中的重要香氣成分[29]，這是因為釀造紅樹莓果酒使用的酵母菌是一種常用的葡萄酒釀造酵母，所以使用不同的酵母菌生產(chǎn)果酒，其香氣物質(zhì)會有很大的差別。醇類物質(zhì)先增加后降低，在發(fā)酵第5天達到最大值；酮類、酸類物質(zhì)隨著發(fā)酵的進行逐漸降低。其中酸類物質(zhì)易與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，后發(fā)酵中酵母菌的乙醇發(fā)酵作用將有機酸降解為乙醇小分子物質(zhì)[30]，因此經(jīng)過發(fā)酵后的紅樹莓果酒中的酸類物質(zhì)有所下降，與本實驗有機酸的變化趨勢一致。

由表3可知，紅樹莓果酒陳釀期間鑒別出23 種香氣物質(zhì)，其中醇類4 種、酮類2 種、酯類12 種、烯萜類4 種、其他類1 種，以酯類、醇類和酮類物質(zhì)為主。香氣成分的總相對含量呈逐漸升高的趨勢。其中酯類物質(zhì)逐漸降低，主要香氣成分有辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、甲酸異戊酯，但甲酸異戊酯在果酒釀造期間呈逐漸增加的趨勢；酮類物質(zhì)呈逐漸增加的趨勢，但仍低于紅樹莓果汁，主要香氣物質(zhì)為α-紫羅酮、β-紫羅酮，其中α-紫羅酮相對含量在陳釀第130天達到最大值0.78%，β-紫羅酮相對含量在陳釀第180天達到最大值1.66%。醇類物質(zhì)逐漸增加，異戊醇為主要香氣物質(zhì)。周立華等[30]發(fā)現(xiàn)秋福樹莓的異戊醇為醇類的主體香氣，它的存在使秋福樹莓具有草香和成熟的果香特點，與本實驗研究一致。紅樹莓果酒中醇類物質(zhì)絕大多數(shù)體現(xiàn)酵母菌發(fā)酵的發(fā)酵香，苯乙醇不僅具有一定的殺菌作用，同時具有玫瑰花香和茉莉花香等多種風味，給人以柔和愉悅的感 覺[30]，是紅樹莓果酒典型的醇類香氣物質(zhì)。

表 3 紅樹莓果酒陳釀期間香氣物質(zhì)及相對含量的動態(tài)變化Table 3 Dynamic changes in aroma components contents of red raspberry wine during aging

紅樹莓果汁的主要香氣物質(zhì)為酮類，如α-紫羅酮、 β-紫羅酮，紅樹莓果酒的主要香氣物質(zhì)為酯類，如辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、甲酸異戊酯。王麗霞等[31]在紅樹莓汁、紅樹莓汁發(fā)酵酒中共檢測出74 種香氣物質(zhì)，其中紅樹莓汁的主要香氣物質(zhì)為酮類（47.86%），經(jīng)發(fā)酵后酮類物質(zhì)減少，醇類和酯類物質(zhì)有明顯增加，發(fā)酵酒中主要香氣物質(zhì)為酯類（68.65%）。殷俊偉等[32]在紅肉火龍果酒中共檢測出34 種香氣物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)對火龍果酒的香味貢獻最大，其次是醇類和酸類，還有少量的醛類和酚類物質(zhì)，與本實驗研究結(jié)果相似。酯類、酮類物質(zhì)感官閾值較低，對果酒的主體香氣貢獻最為顯著，對紅樹莓果酒的香氣影響最大；醇類、酸類物質(zhì)感官閾值較高，對紅樹莓果酒的香氣影響有限；烯萜類組分的感官閾值較低，雖然其含量低，但香氣很明顯，香味獨特，對紅樹莓果酒的香氣組成起著不可忽視的作用。紅樹莓果酒釀造期間，隨著糖類物質(zhì)逐漸被消耗，醇類、酯類、酸類等各種物質(zhì)大量生成，且各物質(zhì)相互補充，賦予紅樹莓果酒獨特的風味。

2.5 紅樹莓果酒發(fā)酵過程中降血糖功效的動態(tài)變化

圖 5 紅樹莓果酒釀造期間α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率Fig. 5 Changes in inhibition rates of α-glucosidase and α-amylase during the brewing of red raspberry wine

由圖5 可知，紅樹莓果酒發(fā)酵過程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率呈先上升后下降的趨勢。紅樹莓果汁（發(fā)酵第0 天）的α-葡萄糖苷酶抑制率為（82.70±1.02）%。發(fā)酵1～5 d，α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸升高，由（78.92±0.65）%上升至（90.18±0.77）%。發(fā)酵0～1 d，α-淀粉酶抑制率顯著升高（P＜0.05），由（61.81±1.17）%上升至（87.93±2.10）%，從發(fā)酵第3天起，α-淀粉酶抑制率由快速降低到緩慢降低后逐漸趨于平穩(wěn)，發(fā)酵第21天后穩(wěn)定在（60.96±1.29）%，這可能與果酒釀造期間活性成分的消長規(guī)律有關(guān)。

陳釀50～300 d，α-葡萄糖苷酶抑制率變化不大，最終穩(wěn)定在（80.58±0.90）%左右。陳釀50～240 d， α-淀粉酶抑制率由（5 9.3 6±1.2 0）%下降至（54.92±1.45）%，陳釀300 d的果酒α-淀粉酶抑制率為（56.41±1.42）%。與未發(fā)酵的紅樹莓果汁相比，兩者的降血糖功效相差不大。陽性對照2 mg/mL的阿卡波糖液對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率分別為96.14%、95.65%，均高于紅樹莓果酒。

2.6 紅樹莓果酒活性成分與降血糖功效的相關(guān)性分析

表 4 紅樹莓果酒活性成分與降血糖功效的相關(guān)性Table 4 Correlation between active components and hypoglycemic effect of red raspberry wine

由表4可知，α-葡萄糖苷酶抑制率與黃酮、原花青素顯著相關(guān)，總酚、花色苷對α-葡萄糖苷酶抑制率最小。王占一等[33]研究發(fā)現(xiàn)石榴幼果總黃酮質(zhì)量濃度為 1.5 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶抑制率達到63.9%。α-葡萄糖苷酶的抑制率與總酚呈較低的正相關(guān)，可能是因為多酚、有機酸、多糖、蛋白質(zhì)等對α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，且抑制作用可能有協(xié)同作用[34]。α-淀粉酶抑制率與總酚、花色苷和原花青素極顯著相關(guān)，黃酮對α-淀粉酶抑制率的貢獻率最小。徐艷陽等[35]研究發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶具有顯著的抑制作用，且在質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL時，黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶的抑制活性（95%）強于陽性對照阿卡波糖（86%）。

3 結(jié) 論

紅樹莓果酒發(fā)酵過程中，乙醇體積分數(shù)的升高數(shù)據(jù)符合酵母菌發(fā)酵的代謝規(guī)律；活性成分均呈先上升后下降趨勢，其中總酚、花色苷在發(fā)酵第1 天達到最大值，質(zhì)量濃度分別為（153.32±2.26）、 （1 7 3.6 4±5.7 2） m g/L，最終分別穩(wěn)定在（116.53±2.36）、（54.39±4.51） mg/L，黃酮在發(fā)酵第9天達到最大值，質(zhì)量濃度為（67.03±0.30） mg/L，最終穩(wěn)定在（54.22±0.17） mg/L，原花青素在發(fā)酵第5天達到最大值，質(zhì)量濃度為（6.38±0.04） mg/L，最終穩(wěn)定在（4.32±0.07） mg/L，黃酮類物質(zhì)被很好地保留，花色苷損失最大。α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制率呈先上升后下降的趨勢，α-葡萄糖苷酶抑制率在發(fā)酵第5天達到最大值，為（90.18±0.77）%，α-淀粉酶抑制率在發(fā)酵第1天達到最大值，為（87.93±2.10）%，最終分別穩(wěn)定在（79.20±0.72）%、（55.13±0.99）%。由此可見，紅樹莓果酒具有一定的降血糖功效，但體外降血糖實驗說服力不強，今后可繼續(xù)進行果酒體內(nèi)降血糖功效研究。

紅樹莓果汁的主要香氣物質(zhì)為酮類，如α-紫羅酮、 β-紫羅酮；紅樹莓果酒的香氣物質(zhì)先上升后趨于平穩(wěn)，在發(fā)酵第3天達到最大值，相對含量為98.59%，其主要香氣物質(zhì)為酯類，如辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、甲酸異戊酯；有機酸含量逐漸降低，其中以檸檬酸、琥珀酸為主，L-蘋果酸、乳酸次之，酒石酸、草酸微量，同時因發(fā)酵代謝積累了少量莽草酸和富馬酸，其中果酒發(fā)酵期間β-苯乙醇、α-紫羅酮、β-紫羅酮、正癸酸、甲酸異戊酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯等香氣物質(zhì)變化幅度較大，琥珀酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸變化較明顯。但是獲得果酒酸度較高，仍需開展篩選降解檸檬酸的酵母菌進行發(fā)酵或在發(fā)酵前去除部分檸檬酸的研究。