乳酸菌和木糖葡萄球菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌 抑制能力分析

張 歡，李沛軍，田興壘，陳 倩，孔保華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

亞硝酸鹽是香腸等腌制肉制品中常用的添加劑，具有抑菌、抗氧化、呈色、賦予產(chǎn)品風(fēng)味等功能，其中，呈色與抑菌作用是其在肉制品中應(yīng)用的最重要原因[1-3]。 然而，亞硝酸根與肉類中的仲胺或叔胺反應(yīng)會(huì)生成致癌、致畸和致突變的亞硝基化合物，加之其本身的毒性，因而應(yīng)用受限[4-5]。為此，科研人員進(jìn)行了大量研究以期找出能夠部分或完全替代肉制品中亞硝酸鹽的天然替代物[6-7]，但到目前為止，基于各種原因鮮見此類物質(zhì)在肉制品中廣泛應(yīng)用[8]。

目前，微生物發(fā)酵法替代肉制品中的亞硝酸鹽是一個(gè)全新的研究領(lǐng)域，一些細(xì)菌可通過接種或本身存在于發(fā)酵肉制品中，除賦予發(fā)酵產(chǎn)品特殊風(fēng)味和口感外，還可有效抑制有害菌的增殖生長(zhǎng)[9-12]。還有研究發(fā)現(xiàn)一些菌株可以產(chǎn)生NO與肉中的肌紅蛋白作用形成亞硝基肌紅蛋白，使肉呈現(xiàn)鮮艷的亮紅色[13-14]。前期Li Peijun等[15]選用本實(shí)驗(yàn)室的5 株乳酸菌和1 株木糖葡萄球菌作為受試菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中1 株木糖葡萄球菌和1 株發(fā)酵乳桿菌在培養(yǎng)基體系中可將肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為氧合肌紅蛋白，在肉糜體系中將高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為亞硝基肌紅蛋白，均具有良好的呈色效果。

肉類腌制中添加亞硝酸鹽，其抑菌作用中最主要是抑制肉毒梭狀芽孢桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒素，保障肉制品 安全[16-17]?；谝陨螸i Peijun等[15]對(duì)呈色菌株的獲得，本研究擬探究這5 株乳酸菌和1 株木糖葡萄球菌體外抑制肉毒梭菌增殖的能力，獲取1 株抑菌能力強(qiáng)的菌株，與之前獲得的呈色效果好的菌株復(fù)配，制成復(fù)合呈色抑菌劑從而替代肉制品中亞硝酸鹽的添加。然而，肉毒梭菌毒性大且難以獲得，基于前人研究，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌與其具有相似的生理活性和生長(zhǎng)習(xí)性，且該菌易得，毒性相對(duì)較小，對(duì)操作環(huán)境要求不高，在實(shí)驗(yàn)過程中可以很好替代肉毒梭菌進(jìn)行相關(guān)研究[18-19]。目前，Nieto-Lozano[20]和Enan[21]等分別發(fā)現(xiàn)乳酸片球菌和能夠產(chǎn)植物乳桿菌素的植物乳桿菌UG1能夠有效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌；Enan等[22]將這種細(xì)菌素應(yīng)用到雞肉、火雞肉和牛肉樣品中，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中的有害菌得到了極好的控制。

本研究以產(chǎn)氣莢膜梭菌替代肉毒梭狀芽孢桿菌，擬以5 株乳酸菌和1 株木糖葡萄球菌作為受試菌株，通過混合培養(yǎng)以及條件培養(yǎng)，分別研究這些菌株及其發(fā)酵上清液對(duì)菌體本身生長(zhǎng)、芽孢萌發(fā)與生長(zhǎng)、芽孢形成的抑制作用，評(píng)價(jià)并篩選抑菌能力最強(qiáng)的目標(biāo)菌株，同時(shí)探究抑菌機(jī)理，以期獲得具有抑菌作用的發(fā)酵劑，為發(fā)酵肉制品的安全提供良好的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）ATCC 13124（type A）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）KLDS1.0709和清酒乳桿菌（L. sake）AS1由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供；彎曲乳桿菌（L. curvatus）、植物乳桿菌（L. plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）從哈爾濱風(fēng)干腸中分離獲得并保存于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院畜產(chǎn)品加工研究室。

MRS（de Man, Rogosa and Sharp）液體培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；mDS（medium D plus sucrose）芽孢形成培養(yǎng)基、mDS-G（medium D plus sucrose-glucose）培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、甘露醇鹽瓊脂（mannitol salt agar，MSA）培養(yǎng)基 北京陸橋生物科技有限公司；瓊脂、氯化鈉、乳酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JD500-2電子天平 沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限 公司；AL-104精密電子天平、DELTA 320 pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)用儀器廠；搖床培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；754PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；ZHJH-1109超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 受試菌株的培養(yǎng)

將發(fā)酵乳桿菌、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌和木糖葡萄球菌分別在MRS液體培養(yǎng)基，產(chǎn)氣莢膜梭菌在BHI培養(yǎng)基中活化2 代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，6 000×g離心10 min，收集各個(gè)菌體沉淀，然后取一定量的菌體沉淀分別接種到8 mL mDS-G培養(yǎng)液中，依據(jù)前期菌體濃度-OD600nm的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將木糖葡萄球菌和其他乳酸菌分別調(diào)至所需濃度對(duì)應(yīng)的OD值，使木糖葡萄球菌終濃度為6（lg（CFU/mL）），其他5 株乳酸菌終濃度各為7（lg（CFU/mL）），用于后續(xù)研究。

1.3.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢的制備

芽孢的制備參照Cevallos-Cevallos等[23]的方法，將1.3.1節(jié)活化好的產(chǎn)氣莢膜梭菌以2%的量接種到50 mL mDS培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h，80 ℃加熱30 min除去活細(xì)胞，制備得到產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢。

1.3.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的抑制

1.3.3.1 混合培養(yǎng)

參照Teo等[24]的方法，略作改動(dòng)。在1.3.1節(jié)含有不同受試菌株的mDS-G培養(yǎng)液中同時(shí)添加產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株，使其終濃度達(dá)到7（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，測(cè)定培養(yǎng)液pH值、受試菌數(shù)和產(chǎn)氣莢膜梭菌菌數(shù)。其中，乳酸菌計(jì)數(shù)采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，木糖葡萄球菌計(jì)數(shù)采用MSA瓊脂培養(yǎng)基，產(chǎn)氣莢膜梭菌計(jì)數(shù)采用BHI瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3.2 條件培養(yǎng)

參照Wrigley[25]的方法，將1.3.1節(jié)接種有各受試菌的mDS-G培養(yǎng)液于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，測(cè)定各培養(yǎng)液pH值，通過0.22 μm無菌濾膜過濾除去受試菌株，再接種產(chǎn)氣莢膜梭菌，使其終濃度達(dá)到7（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。產(chǎn)氣莢膜梭菌計(jì)數(shù)方法同上。

1.3.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)及生長(zhǎng)的抑制

1.3.4.1 混合培養(yǎng)

將1.3.2節(jié)制備的產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢添加到1.3.1節(jié)處理好的6 株受試菌株mDS-G培養(yǎng)液中，并使其終濃度達(dá) 到3（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，測(cè)定培養(yǎng)液pH值、各受試菌數(shù)和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)。

1.3.4.2 條件培養(yǎng)

將1.3.1節(jié)接種有各受試菌的mDS-G培養(yǎng)液于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，測(cè)定各培養(yǎng)液pH值，通過過濾除去受試菌株，再接種產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢，使其終濃度達(dá)到 3（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.5 產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢形成的抑制

1.3.5.1 混合培養(yǎng)

參照Wrigley[25]的方法，略作改動(dòng)。考慮到芽孢形成需要較高的pH值，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，將所用mDS產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)為6.8。將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種到8 mL mDS芽孢形成培養(yǎng)基中，使其終濃度達(dá)到7（lg（CFU/mL））；同時(shí)接種6 株受試菌體沉淀，使乳酸菌終濃度為 7（l g（C F U/m L）），木糖葡萄球菌濃度為 6（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，測(cè)定培養(yǎng)液pH值及其受試菌株菌落數(shù)和產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢數(shù)。

1.3.5.2 條件培養(yǎng)

參照Wrigley[25]的方法，先將6 株受試菌株菌體分別接種到mDS培養(yǎng)基（pH 6.8）中，調(diào)節(jié)乳酸菌終濃度為 7（l g（C F U/m L）），木糖葡萄球菌濃度為 6（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)各菌株幾乎不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)現(xiàn)象不明顯，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，測(cè)定培養(yǎng)液pH值。通過過濾除去菌體，再接種產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株，使其終濃度達(dá)到7（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，測(cè)定產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢數(shù)。

1.3.6 抑菌機(jī)理分析

1.3.6.1 pH值對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)及芽孢萌發(fā)的影響

為驗(yàn)證乳酸菌發(fā)酵引起的培養(yǎng)基pH值降低是否為抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的因素，分別用乳酸調(diào)節(jié)mDS-G培養(yǎng)基pH值至一系列值（6.8、6.6、6.4、6.2、6.0、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0和4.8），滅菌后分別接種產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株（終濃度為7（lg（CFU/mL）））或其芽孢（終濃度為3（lg（CFU/mL）））。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，測(cè)定其中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)。

1.3.6.2 抑菌物質(zhì)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的影響

在“產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的抑制”系列實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌除可以導(dǎo)致培養(yǎng)基具有較低pH值這一抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌條件外，還應(yīng)該代謝產(chǎn)生了某種抑菌物質(zhì)，而上述pH值梯度實(shí)驗(yàn)也從側(cè)面說明了這一點(diǎn)。為進(jìn)一步驗(yàn)證是否存在該抑菌物質(zhì)，將植物乳桿菌和彎曲乳桿菌（產(chǎn)酸能力基本一致）接種到mDS-G培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，發(fā)酵后調(diào)節(jié)二者pH值和對(duì)照組一致（pH 6.8），分別用80 ℃加熱30 min滅菌和0.2 μm無菌濾膜的方式除去受試菌，再分別接種產(chǎn)氣莢膜梭菌（終濃度為 7（lg（CFU/mL））），37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，測(cè)定其中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)分析

2.1.1 混合培養(yǎng)

圖 1 受試菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌混合培養(yǎng)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用Fig. 1 Inhibition of C. perfringens by LAB and S. xylosus in mixed culture

由圖1可知，各組乳酸菌數(shù)均升高至8（lg（CFU/mL）） 以上，且彼此間無顯著性差異（P＞0.05），木糖葡萄球菌數(shù)生長(zhǎng)到7.14（lg（CFU/mL））。通過對(duì)比可發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌組和清酒乳桿菌組中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)最低，經(jīng)培養(yǎng)后分別降低到5.62（lg（CFU/mL））和 5.96（lg（CFU/mL）），而對(duì)照組中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)為8.58（lg（CFU/mL）），表明這兩株菌不僅抑制了產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)，且對(duì)其有一定的殺死作用。發(fā)酵乳桿菌、戊糖片球菌和彎曲乳桿菌組中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)維持在6～7（lg（CFU/mL）），這表明這3 株乳酸菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，但對(duì)其幾乎沒有殺死能力。另外，木糖葡萄球菌組中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)最高，達(dá)到7.88（lg（CFU/mL））。Gioia等[26]將植物乳桿菌和德氏乳桿菌分別與產(chǎn)氣莢膜梭菌共培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)這兩株菌均具有很好的抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖能力，且前者抑制能力優(yōu)于后者，推測(cè)這可能與乳酸菌的產(chǎn)酸以及抑菌物質(zhì)的能力有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明乳酸菌的產(chǎn)酸能力與其抑菌能力密不可分。

2.1.2 條件培養(yǎng)

圖 2 不同受試菌株條件培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用Fig. 2 Inhibition of C. perfringens by LAB and S. xylosus in conditioned culture

由圖2可知，經(jīng)過24 h的厭氧培養(yǎng)，彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌組的發(fā)酵上清液pH值降至4.9～5.0之間，對(duì)應(yīng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制；戊糖片球菌組和木糖葡萄球菌組pH值分別降為5.18和6.27，兩組對(duì)應(yīng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞未受破壞，這表明乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸是抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖的關(guān)鍵因素，Schoster等[27]在17 株商業(yè)益生菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌和艱難梭狀芽孢桿菌的抑制研究中也證實(shí)了這一結(jié)論。另外值得注意的是，植物乳桿菌組中并未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的存在，這進(jìn)一步表明，該組中除較低的pH值這一抑菌條件外，也存在其他的抑菌物質(zhì)。

2.2 抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)及生長(zhǎng)分析

2.2.1 混合培養(yǎng)

產(chǎn)氣莢膜梭菌存活在營(yíng)養(yǎng)不良或不適合其生長(zhǎng)的外界環(huán)境時(shí)，可形成芽孢[28]。由圖3可知，經(jīng)過24 h的混合厭氧培養(yǎng)，各組受試菌株均生長(zhǎng)良好。與對(duì)照組相比，在接種乳酸菌的體系中，產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)受到明顯抑制，經(jīng)過24 h的厭氧培養(yǎng)，菌數(shù)不超過 5.89（lg（CFU/mL）），這表明僅有少量的芽孢萌發(fā)并進(jìn)行二次生長(zhǎng)，而木糖葡萄球菌組中，產(chǎn)氣莢膜梭菌的芽孢萌發(fā)并未受到抑制，其菌數(shù)達(dá)到了7.08（lg（CFU/mL））。 這可能是乳酸菌在發(fā)酵的過程中產(chǎn)生了的機(jī)酸抑制了芽孢的萌發(fā)，Lee等[29]以不添加亞硝酸鹽的乳化腸為研究模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加2%的白醋（主要成分為乙酸）可使產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢不能在2 周內(nèi)萌發(fā)。

圖 3 受試菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌混合培養(yǎng)對(duì)其芽孢萌發(fā)及生長(zhǎng)的抑制作用Fig. 3 Inhibitory effect of LAB and S. xylosus on spore germination and growth of C. perfringens in mixed culture

2.2.2 條件培養(yǎng)

圖 4 不同受試菌株條件培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)及 生長(zhǎng)的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effect of LAB and S. xylosus on spore germination and growth of C. perfringens in conditioned culture

由圖4可知，經(jīng)過24 h的厭氧培養(yǎng)，多數(shù)乳酸菌處理組pH值降為4.9～5.0，戊糖片球菌組pH值為5.16，木糖葡萄球菌組最終pH值為6.21。在所有乳酸菌發(fā)酵得到的條件培養(yǎng)基中，產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)及生長(zhǎng)受到了較強(qiáng)的抑制。木糖葡萄球菌處理組中，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)達(dá)到了6.75（lg（CFU/mL）），雖略低于對(duì)照組，但考慮到菌株間的競(jìng)爭(zhēng)作用，認(rèn)為其并未對(duì)其芽孢的萌發(fā)及生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。對(duì)比各組條件培養(yǎng)基pH值不難發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢的萌發(fā)和生長(zhǎng)，與條件培養(yǎng)基的初始pH值有很大相關(guān)性。

2.3 抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢形成分析

2.3.1 混合培養(yǎng)

由于產(chǎn)氣莢膜梭菌在形成芽孢時(shí)，會(huì)產(chǎn)生腸毒素，且其一旦形成芽孢，將更難以殺滅[30]。因此，為研究不同菌株對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢形成的抑制作用，首先將6 株受試菌株與產(chǎn)氣莢膜梭菌同時(shí)接種于mDS產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，分別測(cè)定受試菌株數(shù)和產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢數(shù)。由于mDS培養(yǎng)基中以高分子聚合物淀粉為碳源，各株受試乳酸菌對(duì)其利用效果很差，因此導(dǎo)致了乳酸菌生長(zhǎng)緩慢，而未對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢形成有效的抑制作用[31]；木糖葡萄球菌雖然有生長(zhǎng)，但亦未觀察到其對(duì)芽孢形成的抑制作用（數(shù)據(jù)未列出）。

2.3.2 條件培養(yǎng)

圖 5 不同受試菌株條件培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢形成的抑制作用Fig. 5 Inhibitory effect of LAB and S. xylosus on sporulation of C. perfringens in conditioned culture

如圖5所示，經(jīng)過48 h的厭氧培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，彎曲乳桿菌和清酒乳桿菌基本沒有顯示出生長(zhǎng)跡象，其中活菌數(shù)有所下降，這表明二者不能利用淀粉作為其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此，亦不能抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢的形成。發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌數(shù)稍有增長(zhǎng)，相應(yīng)培養(yǎng)基pH值也有所降低，其對(duì)應(yīng)的條件培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)芽孢的生成。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢形成需要較高的pH值和不存在游離單糖兩個(gè)條件[30]，因此，這也就很好地解釋了這3 株乳酸菌可以抑制其芽孢形成的現(xiàn)象。同樣，盡管木糖葡萄球菌生長(zhǎng)，但亦未觀察到其對(duì)應(yīng)條件培養(yǎng)基對(duì)芽孢形成有抑制作用。

2.4 抑菌機(jī)理分析

2.4.1 培養(yǎng)基pH值對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌和其芽孢萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響

2.4.1.1 培養(yǎng)基pH值對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的影響

表 1 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的影響Table 1 Influence of initial medium pH on C. perfringens growth（lg（CFU/mL））

由表1可知，隨著培養(yǎng)基pH值下降，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)亦呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與2.1.1節(jié)混合培養(yǎng)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的抑制能力研究結(jié)論一致，即pH值下降是乳酸菌抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的主要原因，而植物乳桿菌則可能存在其他途徑抑制該病原菌的生長(zhǎng)。隨著pH值下降至5.0以下，產(chǎn)氣莢膜梭菌顯著降低（P＜0.05），這解釋了在條件培養(yǎng)中多數(shù)乳酸菌抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)而戊糖片球菌對(duì)其抑制作用不明顯的問題，同時(shí)也表明植物乳桿菌具備分泌某種抑菌物質(zhì)的能力，可以使產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)降為0?？傊樗峋l(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸降低培養(yǎng)基pH值是決定乳酸菌抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的主要因素，這主要是因?yàn)橛袡C(jī)酸可穿過細(xì)菌細(xì)胞膜，在胞內(nèi)發(fā)生解離后釋放出無法穿過細(xì)胞膜的電荷陰離子和質(zhì)子，對(duì)必需代謝反應(yīng)的抑制進(jìn)一步造成了對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制[32]。另外，植物乳桿菌可能存在其他抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的途徑。

2.4.1.2 培養(yǎng)基pH值對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響

表 2 培養(yǎng)基不同初始pH值對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響Table 2 Influence of initial medium pH on spore germination and growth of C. perfringens （lg（CFU/mL））

由表2可知，隨著培養(yǎng)基pH值下降，產(chǎn)氣莢膜梭菌菌數(shù)下降，表明低pH值是抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)及二次生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。該結(jié)果與抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)及生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)均表明，無論是乳酸菌發(fā)酵還是直接調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，都不能殺死或破壞產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢，在混合培養(yǎng)中，植物乳桿菌處理組中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)最少（圖3）的原因可能是在混合培養(yǎng)初期，部分芽孢萌發(fā)得到的活細(xì)胞在二次生長(zhǎng)的過程中受到來自植物乳桿菌抑菌物質(zhì)的作用，抑制了其生長(zhǎng)。因此，乳酸菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸降低培養(yǎng)基pH值是決定乳酸菌抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢萌發(fā)的最主要因素，而當(dāng)芽孢一旦萌發(fā)，植物乳桿菌分泌的抑菌物質(zhì)會(huì)協(xié)同低pH值作用，抑制其二次生長(zhǎng)[33]。

2.4.2 抑菌物質(zhì)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的影響

表 3 不同處理方式對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的影響Table 3 Influence of different treatments on C. perfringens growth

經(jīng)過對(duì)植物乳桿菌和彎曲乳桿菌進(jìn)行24 h的厭氧發(fā)酵，兩組mDS-G培養(yǎng)基pH值分別降低至4.91和4.93 （表3），表明二者發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸水平總體相當(dāng)。將兩組培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)至6.80后使用兩種方式滅（除）菌，再同時(shí)向3 種培養(yǎng)基中接種產(chǎn)氣莢膜梭菌。培養(yǎng)后計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，無論是加熱殺死還是過濾除去條件菌，植物乳桿菌組均對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌均有更強(qiáng)的抑制作用（P＜0.05）。由于其pH值已經(jīng)調(diào)節(jié)和對(duì)照組一致，因此，抑菌作用只能源自其分泌的抑菌物質(zhì)，考慮到該抑菌物質(zhì)的耐熱性，推斷其為植物乳桿菌分泌的細(xì)菌素。而對(duì)于兩組彎曲乳桿菌組（加熱或過濾），產(chǎn)氣莢膜梭菌落數(shù)均達(dá)到7.8（lg（CFU/mL））以上，略低于對(duì)照組的 8.14（lg（CFU/mL）），這可能是因?yàn)殡m然處理組培養(yǎng)基pH值與對(duì)照組相同，但由于前期彎曲乳桿菌的生長(zhǎng)，消耗了部分培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分所致。此外，對(duì)比條件培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）可知，條件培養(yǎng)組中并未檢測(cè)到產(chǎn)氣莢膜梭菌活細(xì)胞，而本實(shí)驗(yàn)中將其pH值調(diào)回6.80后，測(cè)定其活細(xì)胞數(shù)為4（lg（CFU/mL））。這說明在條件培養(yǎng)中，較低pH值和細(xì)菌素的協(xié)同作用，抑制了產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)。

3 結(jié) 論

5 株乳酸菌和1 株木糖葡萄球菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖、芽孢生長(zhǎng)及萌發(fā)、芽孢形成抑制作用不同，其中，植物乳桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制能力最強(qiáng)，這是因?yàn)橹参锶闂U菌除產(chǎn)酸抑菌外，還可產(chǎn)生耐高溫的細(xì)菌素，其他4 株乳酸菌效果次之，而木糖葡萄球菌無明顯的抑制作用。研究為抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖提供了解決方法，后續(xù)可以將本實(shí)驗(yàn)中具有良好抑菌作用的植物乳桿菌與前期研究得到的呈色菌種（發(fā)酵乳桿菌或木糖葡萄球菌）進(jìn)行復(fù)配，應(yīng)用于發(fā)酵肉制品中，為微生物發(fā)酵法部分替代亞硝酸鹽提供一條很好的途徑。