鏡檢、抗原檢測和核酸檢測方法在瘧疾診斷中的應(yīng)用比較

王加志,李希尚,尹授欽,王興娟,楊東海,李新和

及時準確的診斷是防制瘧疾的基礎(chǔ)，按照瘧疾診斷標準(WS 259-2015)，當(dāng)前確診瘧疾病例的方法包括血涂片瘧原蟲病原學(xué)檢查(鏡檢)、抗原檢測(RDT)和核酸檢測(PCR)等三種方法[1]。為分析三種檢測方法在基層醫(yī)療單位中應(yīng)用的效果，本文對2015-2018年騰沖市瘧疾病例和疑似瘧疾病例送檢血樣的檢測結(jié)果進行分析比較，評價鏡檢、RDT和PCR 三種瘧疾診斷方法的優(yōu)缺點，為基層診斷瘧疾選擇適宜檢測方法提供參考。

材料與方法

1資料來源

收集2015-2018年由騰沖市各醫(yī)療機構(gòu)實驗室送檢的發(fā)熱病人血涂片和抗凝血進行檢測。

2試劑與儀器

核酸提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)購自德國QIAGEN公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。瘧疾快速診斷卡(以下簡稱RDT)購自廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司。CX21FS1光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。A-100PCR 儀和LG2020D凝膠成像系統(tǒng)為中國杭州朗基科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

3檢測方法

3.1鏡檢制作厚、薄血涂片2張，置室溫自然干燥，甲醇固定薄血膜后，用吉氏染液染色，由持WHO鏡檢水平一級證書的檢驗人員于光學(xué)顯微鏡下鏡檢，厚血膜在油鏡下，檢查100個視野以上或整個厚血膜未查見瘧原蟲判為陰性，血膜中查到瘧原蟲為陽性，并根據(jù)薄血膜上瘧原蟲形態(tài)特征進行蟲種鑒定[2]。

3.2瘧原蟲抗原檢測采用免疫層析技術(shù)檢測特異性惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶(pfLDH)和瘧原蟲乳酸脫氫酶(panLDH)，按試劑盒操作說明書進行，取患者外周血5μL，滴加于試劑卡加樣孔A中，同時滴加4 滴裂解液于加樣孔B中，15 min內(nèi)觀察結(jié)果。

3.3瘧原蟲核酸檢測采用巢式PCR 方法，DNA提取按照試劑盒說明書操作。巢式PCR檢測瘧原蟲種類的引物及其擴增產(chǎn)物長度見表1，惡性瘧原蟲205 bp、間日瘧原蟲120 bp、三日瘧原蟲141 bp、卵形瘧原蟲800 bp。設(shè)反應(yīng)總體系20μL，巢式PCR 第1輪擴增體系包括PCR緩沖液2μL、10μmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)1.6μL、10 μmol/L 引物rPLU5和rPLU6 各1.0μL、Taq 酶0.1μL、雙蒸水13.3μL、DNA 模板1.0μL，混勻后進行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件為:95℃3min，94℃1 min，60℃1 min，72℃2 min，共30個循環(huán)；72℃6 min。巢式PCR 第2輪擴增體系包括PCR緩沖液2 μL、10μmol/L dNTP1.6μL、10μmol/L 引物RVIV1和RVIV2 各0.8μL 或其他4 種瘧原蟲特異性上下游各0.8μL、Taq 酶0.1μL、雙蒸水12.7μL、第1輪PCR 擴增產(chǎn)物2.0μL，混勻后進行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件為:95℃3 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，共30個循環(huán)；72℃6 min。同時設(shè)立空白和陽性對照，空白對照使用無菌水，陽性對照使用合成的瘧原蟲DNA片段。

4確診病例

以鏡檢、RDT 和PCR 三種方法任意一種檢測結(jié)果為陽性，且經(jīng)云南省寄生蟲病防治所復(fù)核、確認一致的陽性病例，定為確診病例。

5統(tǒng)計學(xué)分析

采用Excel 2010、SPSS 17.0軟件整理分析數(shù)據(jù)資料，計算靈敏度、特異度、假陰性率、假陽性率、符合率等指標。不同檢測方法與確診結(jié)果比較用Kappa檢驗。

結(jié)果

1檢測樣本數(shù)量及確診結(jié)果

2015-2018年，瘧疾送檢樣本共計610 份。每份樣本經(jīng)三種方法同時檢測，判定為陰性樣本295份(48.36%)，陽性樣本315份(51.64%)。其中惡性瘧67份(21.27%)、間日瘧245份(77.78%)；三日瘧1份，混合感染2份。見表2。

2三種瘧疾檢測方法的檢測效果

結(jié)果顯示，三種檢測方法中，PCR 的靈敏度和陰性預(yù)測值最高、假陰性率最低。三種方法的特異度、假陽性率和陽性預(yù)測值相同。在總符合率方面，Kappa檢驗結(jié)果顯示三種方法均與與確診結(jié)果高度一致(Kappa=0.993、0.957、0.944，P均＜0.001)。其中，對間日瘧、三日瘧和混合感染檢測的符合率，以PCR 最高，為100%(246/246)；鏡檢次之，為97.97%(241/246)，其中5例鏡檢陰性，PCR檢測為間日瘧；RDT 最低，為93.9%(231/246)，其中15例RDT 檢測陰性，PCR 檢測為間日瘧14例、三日瘧1例。但對惡性瘧單一蟲種檢測的符合率，以RDT最高，為100%(67/67)，其中2例RDT 檢測陽性，PCR 和鏡檢均為陰性；PCR 次之，為97.01%(65/67)；鏡檢最低，為88.06%(59/67)。三種檢測方法的具體檢測結(jié)果以及評價效果詳見表3、表4。

表1巢式PCR 引物和擴增產(chǎn)物長度

表2騰沖市2015-2018年瘧疾樣本檢測情況

討論

不同方法檢測結(jié)果表明，敏感性以PCR 最高，鏡檢次之，RDT 最低。對除惡性瘧以外蟲種的鑒定能力，以PCR 最高，鏡檢次之，RDT 最低；但對于惡性瘧單一蟲種的鑒定，則以RDT 最優(yōu)。以PCR 為代表的分子檢測技術(shù)是鏡檢、RDT 和PCR 等檢測方法中敏感性最高的，其檢測靈敏度達4.4個原蟲/μL 血[3]，同時，PCR 方法在基因水平進行蟲種的準確鑒定，也是特異性最高的檢測方法。巢式PCR 用于瘧疾的檢測和蟲種鑒定，有利于提高瘧疾的檢出率和準確性[4]，但由于成本高、操作較復(fù)雜、人員培訓(xùn)難、需特殊儀器及檢測的快速性等方面受限制，在基層單位實際應(yīng)用較難推廣。血涂片染色后鏡檢一直被認為是瘧疾診斷的“金標準”。目前，鏡檢仍是我國瘧疾診斷的主要方法，其具有操作簡便、敏感、價廉和可鑒別蟲種等優(yōu)點，但對檢驗人員的技術(shù)要求較高，易受主觀因素影響，不同鏡檢人員可能會得出不一樣的結(jié)果[5]，因此需要經(jīng)驗豐富的檢驗人員才能正確鑒定蟲種，以避免漏診和誤診。隨著我國消除瘧疾進程的推進[6]，基層鏡檢人員檢測瘧原蟲的機會越來越少，因此想要維持較高的鏡檢能力和水平有較大的挑戰(zhàn)。

本研究結(jié)果顯示，RDT 的靈敏度為94.60%，特異度為100%，且與確診結(jié)果的符合率高達97.21%，提示RDT 可以檢出絕大部分瘧疾陽性病例。對于RDT 檢測惡性瘧陽性、而PCR 和鏡檢均為陰性的病例，并不一定是假陽性。經(jīng)重復(fù)檢測排除操作或結(jié)果讀取方法不當(dāng)、試劑盒儲存不當(dāng)?shù)纫蛩赝?，可能是因為有些病例治療后，盡管血中原蟲被清除，但pfLDH仍會在患者體內(nèi)殘存一段時間[7]。因此，RDT 檢測惡性瘧原蟲感染樣本較PCR 和鏡檢的敏感性可能更高，與江莉等[8]研究相似。同時，RDT

表3三種檢測方法與確診病例的檢測結(jié)果比較

表4三種檢測方法的評價指標結(jié)果

檢測操作簡便，即使非專業(yè)人員按照說明書也可進行操作，15 min內(nèi)觀察結(jié)果，結(jié)果讀取快速準確，不需要特殊儀器設(shè)備，成本亦較低，基層醫(yī)療衛(wèi)生單位使用，可有效提高基層瘧疾診斷能力[9]，因此適宜現(xiàn)場和基層人員使用[10]。但需注意不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的RDT 質(zhì)量可能不同，其敏感性和特異性亦有較大差異，本研究僅選用了廣州萬孚的試劑盒，未與其他檢測試劑盒相對照，RDT 檢測結(jié)果僅代表此試劑盒的檢測結(jié)果。