白藜蘆醇對大腸桿菌誘導的大鼠膀胱粘膜損傷保護作用機制的研究

錢余,蔡茹,周恩譜,黃進寶,貢東衛(wèi)

臨床上各種原因引起的膀胱出口梗阻或神經源性膀胱等所致的尿潴留需留置導尿或膀胱造瘺處理，但長期導尿或膀胱造瘺，易繼發(fā)革蘭氏陰性細菌感染引起的膀胱急、慢性炎癥損傷，臨床處理非常棘手[1，2]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)廣泛存在于葡萄、松樹、虎杖及花生等天然植物中，化學成分為3，5，4-三羥基二苯乙烯，屬于含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，分子式C14H12O3，分子量228.25，為無色針狀結晶，具有抗氧化、抗炎、抗癌、保護心血管以及保護神經系統(tǒng)等多種生理功效[3-5]。本實驗通過向大鼠膀胱內植入導管，以大腸桿菌液灌注誘導大鼠膀胱粘膜感染損傷模型，采用白藜蘆醇溶液灌胃給藥，觀察膀胱粘膜病理、氧化-抗氧化和細胞因子變化，探討白藜蘆醇對感染性大鼠膀胱粘膜損傷的保護作用及機制。

材料與方法

1材料

1.1實驗動物雌性SD大鼠45只，個體質量(170±10)g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗學部提供，動物生產許可證號為SCXK(滬)2009-0021，獨立籠盒系統(tǒng)分籠飼養(yǎng)，室溫20 ～25℃，相對濕度40%～60%，光照和黑暗每12 h改變1次，標準飼料，自由飲水、攝食，常規(guī)飼養(yǎng)觀察1 w 無異常，體重差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.098，P＞0.05)后進行實驗(實驗經過動物保護和使用委員會批準)。

1.2藥品和試劑膀胱灌注用DH5α大腸桿菌溶液(108-9CFU/100UL，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科提供)，白藜蘆醇購自杭州瑞樹生化有限公司(29700-22-9)。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 及TNF-α 試劑盒均購自上海酶遠生物科技有限公司。TGF-β1抗體購自英國Abcam 公司。

1.3主要儀器CR21GII超高速冷凍離心機(日本日立公司)，Nanodrop2000 微量紫外分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，EGll60組織包埋機、Rm2123組織切片機、CA5030組織染色機(德國Leica 公司)，CHK 型光學顯微鏡(Olympus公司)，BI-2000 圖形圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟)，Model-680酶標儀(美國BIO-RAD公司)。

2方法

2.1動物分組、造模及給藥隨機分3組(每組15只):空白對照組、模型對照組、白藜蘆醇實驗組。除空白對照組外，其它兩組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(10%水合氯醛按0.3 mL/100 g)0.3 ～

0.5 mL，麻醉后將大鼠固定，尿道口用70%乙醇和碘酊消毒，將直徑1.4 mm的圓頭軟質金屬導絲沾上無菌甘油后經尿道插入大鼠膀胱內，導絲另一端套上長6～8 mm、直徑3 mm 聚乙烯材料的導管，再套上推管，順著導絲用推管把導管推入膀胱并留置，拔出導絲，排空膀胱內尿液，針筒吸入0.5 ml大腸桿菌溶液由推管注入膀胱后拔出推管。同等條件飼養(yǎng)5 d后，實驗組給予白藜蘆醇40 mg/kg 每天灌胃1次，模型對照組以等量的生理鹽水每日灌胃1次。

2.2指標檢測10 d后處死各組大鼠，取膀胱組織于10%甲醛溶液中固定，按常規(guī)制作石蠟切片，HE染色，鏡下觀察病理變化。同時制作膀胱組織勻漿，嚴格按照試劑盒說明書要求進行檢測。比色法檢測SOD、CAT、GSH-Px 及MDA、NO活性含量，免疫組化(ELISA法)檢測IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α的含量，Western blot 法檢測TGF-β1蛋白表達。

2.3統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0 對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)，統(tǒng)計分析用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 SD大鼠膀胱組織病理形態(tài)的改變

鏡下觀察顯示，模型對照組可見粘膜彌漫性充血、水腫，粘膜下層點狀出血或瘀血，毛細血管擴張明顯。炎性細胞浸潤延伸至肌層，可見粘膜層與肌層的纖維組織母細胞、小圓形細胞和漿細胞的浸潤。白藜蘆醇實驗組粘膜下炎性細胞浸潤明顯減少，纖維組織母細胞、小圓形細胞和漿細胞的浸潤明顯消退(圖1)。

2白藜蘆醇對大腸桿菌誘導的大鼠膀胱粘膜損傷的氧化應激影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠膀胱內SOD、CAT、GSH-Px 含量顯著降低(t=18.79、9.09、20.87，P均＜0.01)，NO、MDA含量顯著升高(t=5.16、5.68，P均＜0.01)；與模型對照組比較，白藜蘆醇組大鼠膀胱SOD、CAT、GSH-Px 含量顯著升高(t=13.62、6.3、18.38，P均＜0.01)，MDA、NO含量顯著降低(t=4.4、2.78，P均＜0.01)(表1)。

3白藜蘆醇對大腸桿菌誘導的膀胱粘膜損傷大鼠膀胱組織中各細胞因子的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠膀胱內IL-1β、IL-8、TNF-α含量均顯著升高(t=9.38、4.28、6.83，P均＜0.01)，而IL-6、IL-10含量變化不明顯(t=0.56和0.97，P均＞0.05)；與模型對照組比較，白藜蘆醇實驗組IL-1β、IL-8、TNF-α炎性細胞因子均顯著降低(t=7.22、3.02、4.80，P均＜0.01)，而抑炎細胞因子IL-6、IL-10明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(t=4.69、4.68，P均＜0.01)(表2)。

圖1三組膀胱組織病理切片對比(HE:×150)

表2白藜蘆醇對大腸桿菌誘導大鼠膀胱粘膜損傷膀胱組織中細胞因子含量比較(pg/mL)(X ±s，n=15)

4白藜蘆醇對大腸桿菌誘導的大鼠膀胱粘膜損傷后大鼠膀胱組織中上皮-間質轉化標記物TGF-β1表達的影響

大鼠膀胱組織中TGF-β1表達量，空白對照組為1.00±0.23，模型對照組為2.07±0.45，模型對照組大鼠膀胱組織中TGF-β1蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.20，P＜0.01)；白藜蘆醇實驗組TGF-β1蛋白表達量為1.24±0.31，比模型對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.88，P＜0.01)。

討 論

白藜蘆醇是植物在潮濕環(huán)境下遭到真菌侵害時自身分泌的一種抗逆物質，在葡萄和漿果表皮中Res的含量較高。1963年Nonomura 等[6]提出Res是某些中草藥治療炎癥、脂類代謝和心臟疾病的有效成分之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Res在抗氧化和誘除自由基以及影響花生四烯酸代謝方面[7，8]生物學效應明顯，劉婭等[9]通過體外研究揭示Res對酪氨酸蛋白激酶(PTK)有抑制作用，提示它有免疫調節(jié)方面的重要作用。前期，我們通過大鼠前列腺炎模型，證實Res通過抑制巨噬細胞、淋巴細胞等的轉錄因子kB(NF-kB)活化，減少炎癥過程中IL-1、IL-6和TNF-α等產生，對前列腺炎模型大鼠有明顯的抗炎治療作用[10]。

本文模擬臨床留置導尿，向大鼠膀胱內植入異物導管+大腸桿菌灌注誘導，人為制造大鼠膀胱粘膜感染損傷模型，使其膀胱內壁氧化-抗氧化平衡態(tài)被破壞，隨后以白藜蘆醇進行治療，觀察治療結果。實驗結果顯示，模型對照組大鼠感染大腸桿菌后，其膀胱SOD、CAT、GSH-Px 含量顯著降低，NO、MDA含量顯著升高，說明異物導管+大腸桿菌灌注有氧化應激反應，造成膀胱組織損傷。白藜蘆醇組感染大鼠通過白藜蘆醇液灌胃治療后，與模型對照組比較其SOD、CAT、GSH-Px含量顯著升高，NO、MDA含量顯著降低，說明白藜蘆醇清除氧自由基，恢復體內氧化-抗氧化動態(tài)平衡。

模型對照組中IL-1β、IL-8、TNF-α含量均顯著高于空白對照組，表明在大鼠膀胱組織中，氧化應激損傷會進一步促使炎性細因子水平上升，在病理上表現(xiàn)粘膜彌漫性充血、水腫，粘膜下層有點狀出血或瘀血，毛細血管明顯擴張，炎細胞向肌層浸潤，可見粘膜固有層和肌層有纖維組織母細胞、小圓形細胞和漿細胞；白藜蘆醇實驗組IL-1β、IL-8、TNF-α炎性細胞因子均明顯降低，而抑炎細胞因子IL-6、IL-10 顯著升高，表明提高了膀胱組織內IL-6、IL-10含量，抑制T 細胞、B細胞的增殖以及巨噬細胞活性，減少IL-1β、IL-8、TNF-α等炎性細胞因子生成，減弱炎細胞的黏附、滲出和浸潤，從而減輕炎癥反應，發(fā)揮了抗炎作用[10]，在病理表現(xiàn)上可見白藜蘆醇組組織炎癥情況明顯好轉。

在感染、炎癥及氧化應激損傷等病理條件下，機體會激活多種細胞信號通路誘導上皮-間質轉化通路，其中TGF-β1通路是重要的一員。TGF-β1本身也是一個強力的促纖維化因子，具調控成纖維細胞增殖功能，可使上皮細胞間失去極性并連接分離，同時間質細胞和成纖維細胞的大量產生，細胞外基質沉積，進而促進器官纖維化而喪失功能[11]。TGF-β1表達結果表明，與空白對照組比較，模型對照組表達顯著升高，與模型對照組比較，白藜蘆醇組顯著降低，進一步說明了白藜蘆醇對膀胱損傷后抗纖維化作用機制。

綜上所述，本研究揭示白藜蘆醇能顯著抑制大腸桿菌誘導的大鼠膀胱組織中MDA、NO水平，提高SOD、GSHPx、CAT 活性抗氧化應激；降低促炎細胞因子1L-1β、IL-8、TNF-α的含量，提高抑炎細胞因子IL-6、IL-10 含量而抗炎；通過降低TGF-β1表達降低纖維化，從而起到保護膀胱粘膜作用，避免對膀胱組織傷害。故白藜蘆醇有望作為潛在藥物通過口服或膀胱灌注形式，治療臨床上各種原因引起需長期留置導尿或膀胱造瘺處理的尿潴留患者。