膠體金免疫層析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

梁才英

（欽州市欽北區(qū)那蒙鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，廣西欽州 535000）

農(nóng)藥能夠有針對(duì)性地預(yù)防、控制并消除病蟲草，主要應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、牧業(yè)以及漁業(yè)等產(chǎn)業(yè)中，保障植物、動(dòng)物的生長與繁殖，對(duì)于提高產(chǎn)量有著非常重要的作用。我國關(guān)于農(nóng)藥的使用有著十分完善的管理制度，但仍舊無法完全規(guī)避農(nóng)藥濫用、泛用等問題，不僅對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了較大的破壞，也威脅著人們的生命健康。常見的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要包括大型儀器檢測(cè)和免疫檢測(cè)，雖然前者檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率較高，但操作復(fù)雜、檢測(cè)周期較長且花費(fèi)較高，不適用于流通時(shí)間較短的果蔬。膠體金免疫層析技術(shù)屬于后者，1971 年首次出現(xiàn)，主要是利用膠體金作為示蹤標(biāo)志物，以纖維層析材料為固相反應(yīng)界面，利用抗原抗體的特異性結(jié)合原理，在毛細(xì)作用下觀察樣品溶液中膠體金產(chǎn)物的定向流動(dòng)[1-2]， 操作便捷且檢測(cè)快速，除了應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)之外，還廣泛應(yīng)用于疾病診斷、食品檢測(cè)、重金屬等環(huán)境污染物的檢測(cè)中，檢測(cè)效果理想。

1 膠體金免疫層析技術(shù)的應(yīng)用原理及特點(diǎn)

1.1 原理

膠體金也被稱為氯金酸水溶液，與白磷和檸檬酸三鈉結(jié)合能夠在還原反應(yīng)、聚合反應(yīng)作用下形成一種大小基本相等的顆粒物質(zhì)，此類顆粒物質(zhì)在受到靜電作用時(shí)還會(huì)反應(yīng)形成一種膠體溶液[3]。其電子密度極高、穩(wěn)定性極強(qiáng)，如果顆粒物質(zhì)的聚集密度超過規(guī)定閾值，其表面還會(huì)形成面積較大的紅色斑點(diǎn)，便于肉眼或儀器觀察，檢驗(yàn)人員只需要觀察被檢測(cè)物質(zhì)中的紅色斑點(diǎn)數(shù)量便可以得出結(jié)果，因此，如果將膠體金作為免疫層析檢測(cè)中的指示物，則能夠以膜為載體，完成對(duì)特殊抗原或抗體的固定，繼而實(shí)現(xiàn)毛細(xì)作用下被測(cè)物質(zhì)在層析試條上的持續(xù)運(yùn)動(dòng)[4]。此外，需要注意的是，不同還原劑所產(chǎn)生的顆粒是不同的，在檢測(cè)過程中會(huì)呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)，而膠體金能夠滿足不同物質(zhì)的檢測(cè)需要，并能最大限度確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

1.2 特點(diǎn)

膠體金免疫層析技術(shù)操作簡(jiǎn)單且具有較高的靈敏度，主要呈現(xiàn)出以下特點(diǎn)：①該檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)范圍較廣，除了能夠檢測(cè)出食品等被測(cè)物質(zhì)中的農(nóng)藥殘留，還能檢測(cè)出微生物、真菌霉素等，甚至可以同步檢測(cè)出被測(cè)物質(zhì)是否含有違禁藥品；②該檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)方法十分便捷，只需要簡(jiǎn)單處理樣品后肉眼觀察即可，不需要借助設(shè)備或儀器便能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此不要求檢測(cè)人員具有高超的知識(shí)與專業(yè)技能；③相比于傳統(tǒng)的酶標(biāo)記、放射性同位素以及熒光素等檢測(cè)技術(shù)，該檢測(cè)技術(shù)所使用的試劑安全性更高，既能夠保證檢測(cè)環(huán)境無污染，還能避免對(duì)檢測(cè)人員的身體造成傷害；④當(dāng)前市面上流通的膠體金免疫層析檢測(cè)卡靈敏度為1 ng·mL-1，相比于其他檢測(cè)方法具有更高的靈敏度，這是因?yàn)樵摍z測(cè)技術(shù)只需要標(biāo)記單克隆抗體，同時(shí)對(duì)其有特異性、親和性的只有抗原決定簇[5]；⑤該檢測(cè)技術(shù)所使用的試條具有較為穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，主要是膠體金吸附被測(cè)物質(zhì)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行吸附并標(biāo)記，且不會(huì)影響到蛋白質(zhì)活性，同時(shí)兼具質(zhì)量小的特點(diǎn)，便于檢測(cè)人員隨身攜帶并隨時(shí)展開現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工作。

2 膠體金免疫層析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用——以克百威為例

2.1 克百威介紹

克百威是一種高效殺蟲劑，屬于氨基甲酸酯類，應(yīng)用于蔬菜、糧食、水果等農(nóng)作物中能夠有效防治害蟲，應(yīng)用時(shí)會(huì)將其直接噴灑在農(nóng)作物根部，待根系吸收后隨著水分傳送至葉子、莖部，實(shí)現(xiàn)內(nèi)吸殺蟲的效果。但是，克百威具有較高的毒性，一旦暴露在空氣中，很長時(shí)間都不會(huì)消散，不僅無法在酸性土壤中降解，會(huì)污染土壤和地下水，還會(huì)威脅到周邊鳥類及水生動(dòng)植物的安全。如果在農(nóng)作物上大量使用克百威，便會(huì)形成農(nóng)藥殘留。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，克百威會(huì)影響到γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的血清活性，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致肝臟的充血性壞死。大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明克百威有著較為顯著的肝毒性作用與致突變性，如果食品中殘留有克百威，則會(huì)嚴(yán)重危及人們的生命健康[6]。

2.2 膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)克百威的具體方法

2.2.1 膠體金單克隆抗體偶聯(lián)物的制作

在膠體金懸浮液中加入0.2 mol·L-1的碳酸鉀溶 液，一邊攪拌一邊加入抗體溶液直至溶液的酸堿度達(dá)到8.2、濃度達(dá)到2 μg·mL-1，將溶液溫育30 min后加入1%濃度的牛血清白蛋白溶液，持續(xù)攪拌 20 min 以確保膠體金的穩(wěn)定性。將得到的溶液混合物在4 ℃環(huán)境中作離心處理，時(shí)間大約為15 min，結(jié)束后再用1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行溶液沉淀，通常需要洗滌3 次，沉淀后將沉淀物放入含有1%牛血清白蛋白和0.05%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液中，將其保存于4 ℃的環(huán)境中備用。整個(gè)過程需要特別注意溶液酸堿度的檢測(cè)，且將備好的膠體金抗體偶聯(lián)物用在試紙條的準(zhǔn)備中則能夠檢測(cè)出其性能。

2.2.2 膠體金試紙條的組裝

目前市面上常見的試紙條包括硝酸纖維素膜、共軛墊、吸收墊和樣品墊。當(dāng)克百威樣品溶液被加入到樣品墊時(shí)，在層析作用力下會(huì)定向流動(dòng)至吸收墊，此時(shí)樣品溶液中的抗原便會(huì)與共軛墊上的膠體金標(biāo)記結(jié)合，而后繼續(xù)移動(dòng)，與對(duì)照線上的抗原、抗體結(jié)合，此時(shí)由于膠體金標(biāo)記無法與測(cè)試線包被抗原結(jié)合，測(cè)試線上的顏色越淺，樣本溶液中的抗原濃度就越高。利用點(diǎn)樣儀（型號(hào)為BioDot Quanti3000）在硝酸纖維素膜上加入山羊抗小鼠IgG 作為對(duì)照線，加入3-琥珀酰-克百威-OVA 作為測(cè)試線，再用點(diǎn)樣儀將備好的膠體金單克隆抗體偶聯(lián)物固定到共軛墊上，組裝好膠體金條與外殼則完成試條的組裝，將其保存于4 ℃的環(huán)境中。膠體金試紙條的最小濃度以測(cè)試線完全不可見為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)試紙條中加入克百威樣品，則測(cè)試線的顏色通常比對(duì)照線的顏色淺，如果在試紙條中加入空白溶液，則測(cè)試線與對(duì)照線的顏色相同，如果加入溶液后沒有出現(xiàn)對(duì)照線，則表示樣品無效[7]。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

膠體金試紙的檢測(cè)限就是使測(cè)試線完全不可見的最小濃度，因此將一系列梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度加入試紙條中，即0 ng·mL-1、0.25 ng·mL-1、 0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.50 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1、10.00 ng·mL-1和20.00 ng·mL-1，當(dāng)膠體金測(cè)試線相比對(duì)照線明顯較弱時(shí)，得到克百威的最低檢出濃度為1 ng·mL-1。

2.3 檢測(cè)結(jié)論分析

本次研究中利用膠體金分別檢測(cè)了不同濃度的克百威試紙條，結(jié)果顯示膠體金對(duì)克百威的最低檢出濃度為1 ng·mL-1，而根據(jù)調(diào)查，如果隱形添加的克百威濃度超過2%，稀釋1 000 倍后的克百威含量仍不低于20 mg·L-1，所以應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)能夠檢測(cè)出市面上絕大多數(shù)物品中的克百威濃度超標(biāo)問題。另外，本次測(cè)試沒有特別使用緩沖液或純凈水，只需要用自來水將被測(cè)物質(zhì)進(jìn)行稀釋便可直接檢測(cè)，不需要采用特定的純凈水或緩沖液，便于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)，更加適用于稀釋條件不高的環(huán)境，可以簡(jiǎn)單快速地檢測(cè)出被測(cè)物品中是否有克百威農(nóng)藥殘留。

3 膠體金免疫層析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用發(fā)展趨勢(shì)

膠體金免疫層析技術(shù)最早應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，近幾年隨著我國對(duì)食品安全問題的重視，才逐漸延伸至安全質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域，如農(nóng)藥殘留檢測(cè)等。利用膠體金作為單一常規(guī)標(biāo)記材料，可直觀顯示被測(cè)物質(zhì)中的農(nóng)藥殘留。在未來，科技的進(jìn)步使得大量新型材料相繼問世，納米磁珠、鑭系稀土、熒光微球等新型材料均可作為標(biāo)記材料代替膠體金[8-9]。技術(shù)的革新要求相關(guān)研究人員不斷提升專業(yè)知識(shí)與技能儲(chǔ)備，充分利用多種標(biāo)記材料以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的進(jìn)一步優(yōu)化?？偟膩碚f，膠體金免疫層析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用發(fā)展趨勢(shì)主要是實(shí)現(xiàn)標(biāo)記材料的不斷升級(jí)。只有實(shí)現(xiàn)標(biāo)記材料的升級(jí)優(yōu)化，才能不斷提升檢測(cè)靈敏度與檢測(cè)效率，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性與可靠性。

當(dāng)前膠體金層析免疫技術(shù)在食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用效果良好。膠體金免疫層析技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出被測(cè)物質(zhì)中的農(nóng)藥殘留，操作簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確率高，試紙條也便于攜帶，能夠在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)完成檢測(cè)工作，其檢測(cè)原理主要是識(shí)別抗體、抗原或半抗原之間的特異性反應(yīng)，是一種以此為基礎(chǔ)所建立的生物化學(xué)分析方法，但是在檢測(cè)之外，檢測(cè)人員還需要對(duì)被測(cè)物質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單的前期處理。在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，部分被測(cè)物質(zhì)的前期處理工作十分煩瑣，且每一次檢測(cè)都需要使用一個(gè)試紙條，導(dǎo)致檢測(cè)成本增加。因此，膠體金免疫層析技術(shù)的未來發(fā)展方向要著重于高通量試紙條或檢測(cè)卡的研究，以不斷減少成本。

另外，在以往傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)中通常只能檢測(cè)出一種農(nóng)藥殘留，且屬于定性檢測(cè)，或者對(duì)被測(cè)物質(zhì)中的某種農(nóng)藥殘留進(jìn)行半定量檢測(cè)。如果被測(cè)物質(zhì)中的農(nóng)藥殘留量超過膠體金試紙條所能檢測(cè)出的最大限量，則無法準(zhǔn)確定量地檢測(cè)出實(shí)際殘留。對(duì)此，相關(guān)研究人員不斷優(yōu)化檢測(cè)試紙條與檢測(cè)方法，以期能夠不斷擴(kuò)大定量精度、檢測(cè)范圍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將單一顏色的檢測(cè)線進(jìn)行多條組合，然后將其置于同一層析膜上，則能夠大大提升膠體金試紙條的檢測(cè)效果，對(duì)單一農(nóng)藥殘留的定性或?qū)Χ喾N類農(nóng)藥殘留的定量分析，在節(jié)省檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)還能為檢測(cè)人員提供更多的關(guān)聯(lián)信息。需要注意的是，樣品墊與檢測(cè)線之間的距離越大，被測(cè)溶液層析后到達(dá)檢測(cè)線的時(shí)間就越長，加上無法避免多條檢測(cè)線之間相互干擾，因此檢測(cè)結(jié)果無法達(dá)到預(yù)期[10]。若要實(shí)現(xiàn)膠體金層析技術(shù)在多種農(nóng)藥殘留中的檢測(cè)效果，僅在單層析膜上添加多條檢測(cè)線是不夠的。應(yīng)用多條檢測(cè)線的膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，除了需要考慮到靈敏度、特異性、產(chǎn)品穩(wěn)定性等常規(guī)量之外，還應(yīng)當(dāng)充分考慮到多條檢測(cè)線之間的距離，被測(cè)物質(zhì)層析速度以及檢測(cè)時(shí)的浸提液使用量等，不斷優(yōu)化試紙條材質(zhì)，以逐步提高檢測(cè)線的顯示清晰度和均勻度，最大限度保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)語

綜上所述，在進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)，相比于需要利用大型儀器的氣相色譜、液相色譜等檢測(cè)技術(shù)，膠體金免疫層析技術(shù)操作更加簡(jiǎn)單，所獲得的檢測(cè)結(jié)果也準(zhǔn)確可靠，更加適用于快速篩查果蔬等物質(zhì)中的農(nóng)藥殘留。膠體金免疫層析技術(shù)僅僅是免疫檢測(cè)方法中的一種。已經(jīng)有研究表明，多種方式聯(lián)合檢測(cè)能夠進(jìn)一步提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，因此在未來，免疫層析的多組分檢測(cè)方法將成為一種主流應(yīng)用趨勢(shì)，農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)的選擇依據(jù)則會(huì)趨向于減少檢測(cè)成本，并同步滿足被測(cè)物質(zhì)中多種農(nóng)藥的同時(shí)檢測(cè)需求。