二黃益腎湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

李冬冬 田雪芬 王靜 周瑋 張丹丹

【摘 要】 目的：建立二黃益腎湯的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法（TLC）對(duì)二黃益腎湯中的丹參和黃芪進(jìn)行定性鑒別;反相-高效液相色譜法（RP-HPLC）對(duì)大黃中的大黃酸、大黃素、大黃酚進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：TLC能定性檢出丹參和黃芪，斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾;大黃酸、大黃素、大黃酚分別在41.625～666.0 μg·mL-1 （r=1.000 0）、2.663～42.6 μg·mL-1（r=0.999 9）、6.94～111.0 μg·mL-1（r=0.999 9）具有良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為97.45%（RSD=0.39%）、98.63%（RSD=1.18%）、98.15%（RSD=0.89%）（n=6）。結(jié)論：所建方法專屬性強(qiáng)，能有效檢測(cè)二黃益腎湯的質(zhì)量，可作為二黃益腎湯的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

【關(guān)鍵詞】 二黃益腎湯;薄層色譜法;反相-高效液相色譜法;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

【中圖分類號(hào)】R284.1 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）21-0050-05

Abstract：Objective To establish the quality standard of Erhuang Yishen Decoction. Methods Thin layer chromatography （TLC） was used for the qualitative identification of Salvia miltiorrhiza and Astragalus membranaceus. Reversed phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC） was used for the quantitative determination of rhein， emodin and chrysophanol in Rheum officinale. Results TLC could accurately detected the presence of Salvia miltiorrhiza and Astragalus membranaceus， the spots were clear and the blank test showed no interference. The concentration of rhein， emodin and chrysophanol showed a good linearity in the ranges of 41.625～666.0 μg·mL-1（r=1.000 0）， 2.663～42.6 μg·mL-1 （r=0.999 9） and 6.94～111.0 μg·mL-1（r=0.999 9）， respectively. Additionally， the average recovery was 97.45% （RSD=0.39%）， 98.63% （RSD=1.18%） and 98.15% （RSD=0.89%）， respectively. Conclusion The specificity of method is very good as well， and can effectively detect the quality of Erhuang Yishen decoction， and can be used as quality control detection standard.

Keywords：Erhuang Yishen Decoction; TLC; RP-HPLC; Quality Standard

二黃益腎湯是我院腎病科老中醫(yī)以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方，是由丹參、黃芪、大黃、炒白術(shù)、炙淫羊藿、莪術(shù)、砂仁、石葦?shù)?0味中藥采用傳統(tǒng)工藝結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)制成的口服液體劑型，具有補(bǔ)腎健脾、活血通絡(luò)、清熱泄?jié)嶂π?，可降低?nèi)生肌酐和尿素氮水平，臨床上主要用于氣虛濕瘀型慢性腎功能不全的治療。該方療效顯著，不良反應(yīng)小，使用安全，深受廣大患者的好評(píng)。方中大黃為君藥，性苦、寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃素能明顯減輕單側(cè)輸尿管結(jié)扎腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎組織病理學(xué)損傷程度，且大鼠腎組織PDGF-B表達(dá)明顯減少，說(shuō)明大黃素能夠減緩腎組織纖維化進(jìn)程，具有腎臟保護(hù)作用[1];大黃酸可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HBZY-1大鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖，可以降低血清肌酐、血尿素氮和24 h尿蛋白水平[2]。

二黃益腎湯現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只有【性狀】及【檢查】項(xiàng)，無(wú)【鑒別】與【含量測(cè)定】項(xiàng)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不完善。為有效控制本制劑的質(zhì)量，完善質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，保障臨床用藥的安全、有效，故對(duì)丹參和黃芪采用TLC進(jìn)行定性鑒別，對(duì)大黃中的大黃酸、大黃素和大黃酚采用RP-HPLC進(jìn)行定量測(cè)定，本研究從TLC和RP-HPLC兩方面入手，建立該產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）;AB135-S型十萬(wàn)級(jí)電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）;ZF-8暗箱三用紫外分析儀（上海一科儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑 丹參對(duì)照藥材（批號(hào)120923-201615）;黃芪對(duì)照藥材（批號(hào)120974-201612）;大黃酸（純度≥99%，批號(hào)110757-201607）;大黃素（純度≥98%，批號(hào)110756-201512）;大黃酚（純度≥99%，批號(hào)110796-201621）;黃芪甲苷（純度≥97%，批號(hào)110781-201717）均來(lái)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

二黃益腎湯（規(guī)格：每瓶150 mL，濟(jì)寧市中醫(yī)院制劑室制，批號(hào)：20181014、20181129、20181227）。

甲醇（色譜純，Avantor Performance Materials， Inc.， USA; GC≥99.9%）;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別[3]

2.1.1 丹參[4] 取本品（批號(hào)20181014）20 mL，加10%稀鹽酸調(diào)pH至2.0，再用乙酸乙酯振搖提取2次，每次50 mL，合并兩次提取液，揮干乙酸乙酯，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液。取除丹參以外的其余藥材，按二黃益腎湯的處方和工藝制成溶液，再按供試品的制備方法處理，即得陰性對(duì)照溶液。再取丹參對(duì)照藥材0.6 g，加水100 mL，加熱回流1.5 h，濾過(guò)，濾液濃縮至約20 mL，放冷，按供試品的制備方法處理，即得對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，依次吸取對(duì)照藥材溶液5 μL、供試品溶液8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（10∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴3%三氯化鐵乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。如圖1所示。

2.1.2 黃芪[5-7] 取本品（批號(hào)20181014）25 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取3次（首次輕輕振搖），每次40 mL，合并提取液，用氨液洗滌 2 次（50 mL、30 mL），棄去氨液，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次30 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液。取除黃芪外的其余藥材，按二黃益腎湯的處方和工藝制成不含黃芪的溶液，再按供試品的制備方法處理，即得陰性對(duì)照溶液。取黃芪對(duì)照藥材2.0 g，加水50 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至約20 mL，同法即得對(duì)照藥材溶液。再取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成l mg·mL-1的溶液，即得對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液各4 μL、供試品溶液8 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶[KG-*3/5]7∶[KG-*3/5]2）10℃以下放置超過(guò)6 h的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，相應(yīng)位置處陰性對(duì)照無(wú)斑點(diǎn)。如圖2所示。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品混合儲(chǔ)備液的制備 分別精密稱取大黃素對(duì)照品、大黃酸對(duì)照品和大黃酚對(duì)照品各2.13、6.66和2.22 mg，分別置于5 mL、1 mL和2 mL量瓶中，用甲醇至刻度，搖勻，各吸取1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得0.0426 mg·mL-1大黃素對(duì)照品、0.666 mg·mL-1大黃酸對(duì)照品和0.111 mg·mL-1大黃酚對(duì)照品混合儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備[3，8-10] 精密量取樣品（批號(hào)20181129）50 mL，置燒瓶中，加8%鹽酸100 mL，超聲處理3 min，再加三氯甲烷150 mL，水浴回流40 min，放冷，三氯甲烷層置分液漏斗中，再用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，上層酸液再用150 mL三氯甲烷水浴回流一次（20 min），分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次100 mL，合并提取液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙猓D(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件[11-13] Purospher star RP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱;以甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶[KG-*3/5]30）為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm;柱溫為25℃;流速1.0 mL·min-1。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品混合儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成41.625、83.25、166.5、333.0、499.5、666.0 μg·mL-1的大黃酸對(duì)照品和2.663、5.325、10.65、21.3、31.95、42.6 μg·mL-1的大黃素對(duì)照品以及6.94、13.88、27.75、55.5、83.25、111.0 μg·mL-1的大黃酚對(duì)照品混合溶液，不同濃度的對(duì)照品混合溶液各進(jìn)樣8 μL，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄對(duì)應(yīng)峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得大黃酸的回歸方程為Y=6472.816X-5364.543，r=1.000 0，線性范圍為41.625～666.0 μg·mL-1;大黃素的回歸方程為Y=27439.750X-26299.681，r=0.999 9，線性范圍為2.663～42.6 μg·mL-1;大黃酚的回歸方程為Y=13646.903X-23053.364，r=0.999 9，線性范圍為6.94～111.0 μg·mL-1。

2.2.5. 方法學(xué)驗(yàn)證[14-15]

2.2.5.1 精密度試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品混合儲(chǔ)備液6 μL，注入色譜儀中，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為1.36%、1.08%和1.44%。結(jié)果表明，儀器精密度較好。

2.2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液5 μL，注入色譜儀中，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件操作，分別于0、4、8、12、16、24 h間隔下進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為2.26%、2.98%和2.89%。由結(jié)果可知，供試品中的3種化合物在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品（批號(hào)20181129），按2.2.2項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件操作，均進(jìn)樣1次，記錄峰面積，計(jì)算大黃酸、大黃素和大黃酚RSD分別為2.29%、2.06%和2.18%。由結(jié)果可知，方法重復(fù)性良好。

2.2.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 平行取6份已知含量的同一批號(hào)樣品（批號(hào)20181129）各50 mL，分別加入含量相當(dāng)量80%、100%、120%的大黃酸、大黃素和大黃酚混合對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下的方法制備成溶液，每次進(jìn)樣5 μL，結(jié)果見(jiàn)表1。大黃酸平均回收率為97.45%，RSD為0.39%;大黃素平均回收率為98.63%，RSD為1.18%;大黃酚平均回收率為98.15%，RSD為0.89%。

2.2.6 專屬性 按處方和工藝制成不含大黃的陰性對(duì)照樣品，再按2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。標(biāo)準(zhǔn)品混合儲(chǔ)備液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品、供試品和陰性對(duì)照的HPLC圖如圖3所示。

2.2.7 定量限、檢測(cè)限 取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，取信噪比S/N為10的作為定量限，大黃酸、大黃素和大黃酚的定量限分別為4.386、5.532、9.470 ng;取信噪比S/N為3的作為檢測(cè)限，分別為2.525、4.056、6.061 ng。

2.2.8 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備兩份，分別測(cè)定，計(jì)算二黃益腎湯樣品中大黃酸、大黃素和大黃酚含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別 二黃益腎湯主要是由大黃、丹參、黃芪、炙淫羊藿、炒白術(shù)、莪術(shù)等10味中藥組成，其中大黃為君藥，丹參、黃芪等為臣藥，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)無(wú)薄層鑒別項(xiàng)，因此定性鑒別選擇方中的臣藥加以研究。

黃芪的薄層鑒別中，樣品用水飽和的正丁醇提取后再用氨水洗滌，薄層展開(kāi)時(shí)發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)較多，斑點(diǎn)相互有干擾，因此樣品處理時(shí)最后添加了正丁醇飽和的水洗滌這一步驟，可以除去樣品中極性較小的雜質(zhì);用三氯甲烷-甲醇-水（13∶[KG-*3/5]7∶[KG-*3/5]2）10℃以下放置的下層溶液為展開(kāi)劑進(jìn)行鑒別時(shí)，發(fā)現(xiàn)10℃以下放置超過(guò)6 h的展開(kāi)劑能有效降低斑點(diǎn)的拖尾，可以得到較好的展開(kāi)效果。

3.2 含量測(cè)定 大黃作為方中的君藥，具有降低尿素氮、保護(hù)殘存腎功能、延緩腎纖維化等作用，其有效成分主要以蒽醌類為主，分為結(jié)合蒽醌和游離蒽醌，游離蒽醌的成分有大黃素、大黃酸和大黃酚等，這些都是大黃發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)[16]。大黃在提取過(guò)程中，游離蒽醌的損失量遠(yuǎn)高于結(jié)合蒽醌，導(dǎo)致游離蒽醌在溶液中的含量很低;另外，游離蒽醌在口服后，易在上消化道部位吸收[17]，最終到達(dá)大腸的量極有限，因此本試驗(yàn)對(duì)總蒽醌進(jìn)行定量測(cè)定。

樣品處理時(shí)，參考2015版《中華人民共和國(guó)藥典》大黃含量測(cè)定中總蒽醌的處理方法，先用8%鹽酸進(jìn)行酸水解，再用三氯甲烷萃取。但封淑華等[18]報(bào)道酸水解時(shí)酸的濃度對(duì)大黃酸有較大影響，對(duì)其他物質(zhì)影響極小，因此本試驗(yàn)中酸的濃度直接采用2015版《中華人民共和國(guó)藥典》大黃供試品溶液的制備方法。

參考文獻(xiàn)[11-12，19]，流動(dòng)相先后嘗試了甲醇∶0.1%磷酸水溶液70∶[KG-*3/5]30、76∶[KG-*3/5]24、80∶[KG-*3/5]20、85∶[KG-*3/5]15等多種洗脫程序，其中76∶[KG-*3/5]24時(shí)大黃酸主峰與其前面的雜質(zhì)峰連在一起，隨著甲醇比例的提高，大黃酸主峰與雜質(zhì)峰近乎無(wú)法分離開(kāi)。之后將甲醇的比例在70%左右調(diào)節(jié)，綜合比較其分離度、拖尾因子、峰面積和經(jīng)濟(jì)性等指標(biāo)，最終選定甲醇∶0.1%磷酸水溶液70∶[KG-*3/5]30作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相系統(tǒng)。

本試驗(yàn)使用二極管陣列檢測(cè)器（PDA）進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（190～800 nm），結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃樣品在255 nm處3個(gè)成分具有較大的吸收，且雜質(zhì)成分干擾少，故以255 nm作為大黃的檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本研究建立的質(zhì)量控制方法，經(jīng)過(guò)對(duì)多批產(chǎn)品的驗(yàn)證，結(jié)果表明薄層色譜法中斑點(diǎn)分離效果好，陰性溶液對(duì)樣品的定性鑒別無(wú)干擾，方法的專屬性較強(qiáng)。含量測(cè)定試驗(yàn)，具有良好的重復(fù)性，加樣回收率高，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。增加的薄層色譜鑒別和含量測(cè)定項(xiàng)，能有效控制二黃益腎湯的質(zhì)量，對(duì)二黃益腎湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定有一定提高作用。

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（收稿日期：2020-06-04 編輯：程鵬飛）