多巴胺修飾的竹炭納米粒子的合成及其光熱控制藥物釋放的研究

劉簫,洪沙沙,張羱,雙少敏,王煜

(山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006)

0 引言

癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的一種疾病,傳統(tǒng)的癌癥治療方法主要有化療、放療和手術(shù)。這些治療方法都有不同程度的缺陷[1]。例如,化療藥物的副作用在于殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)不可避免地造成正常細(xì)胞和組織的損害[2-4]。光熱治療具有無創(chuàng)性、安全性和有效性，在癌癥治療中引起關(guān)注[5-6]。

光熱治療是利用光熱試劑在近紅外光照射下將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熱能引起局部高溫,利用癌細(xì)胞比正常細(xì)胞對熱的敏感性,從而殺死癌細(xì)胞[7-8],并且刺激藥物釋放。由于其非侵入性、對正常細(xì)胞無損害以及近紅外光的時(shí)空控制藥物釋放方式特性,研究者將光熱治療與化療結(jié)合,從而提高化療藥物治療腫瘤的效果。

近年來,具有近紅外光吸收的納米材料作為藥物載體在癌癥治療中引起人們的研究興趣。近紅外納米材料包括不同的貴金屬(例如Au、Ag、Pt)[9-12]、過渡金屬硫化物或氧化物[13-14]等,但是貴金屬材料價(jià)格昂貴,過渡金屬或氧化物材料制備工藝復(fù)雜。而竹炭納米材料是一個(gè)新型的碳納米材料,不僅無毒、價(jià)廉,而且易于制備。最初Teraoka等確定了竹炭粉的紅外特性,證明其具有近紅外光吸收。基于竹炭粉具有近紅外吸收的研究現(xiàn)狀,Zhao等[15]用竹炭粉為原料合成了竹炭納米粒子(BCNPs),在其表面修飾吐溫80來增加生物相容性,且以其作為藥物載體將抗癌藥物運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位,具有集化療與光熱協(xié)同治療于一體的特性。在此基礎(chǔ)上,通過修飾D-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸(TPGS)抑制p-gp外排蛋白改善了抗癌藥物的生物利用率,提升了納米藥物的療效,并為耐藥性腫瘤細(xì)胞的治療提供了新思路[16]。

多巴胺是一類蛋白類生物材料,具有良好的親水性和生物相容性。多巴胺幾乎可以在任何材料表面形成黏合層聚多巴胺(PDA)[17]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,PDA多修飾在二氧化硅藥物載體上,一方面可以提升載體的生物相容性;另一方面,由于PDA在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定,也可用于pH觸發(fā)的藥物釋放?；谏鲜鎏匦?我們嘗試將PDA與BCNPs結(jié)合構(gòu)筑多功能智能的藥物載體。因此,本研究中利用多巴胺在堿性條件下的自聚反應(yīng)合成PDA[18],并對竹炭納米材料表面進(jìn)行改性,形成多巴胺竹炭納米材料藥物載體系統(tǒng)。將其用于抗癌藥物阿霉素(DOX)的負(fù)載與近紅外光(NIR)觸發(fā)的藥物釋放。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和儀器

試劑:商業(yè)竹炭粉(浙江旺林生物科技有限公司);鹽酸阿霉素(麥克林,≥98%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)));鹽酸多巴胺(上海阿拉丁,分析純);0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液和0.01 mol/L PBS緩沖溶液由實(shí)驗(yàn)室配置;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

儀器:球磨機(jī)(DECO-PBM V-0.41 長沙市德科儀器設(shè)備有限公司);光纖耦合功率可調(diào)二極管激光器(MDL-Ⅲ-808nm-2.5W,長春新工業(yè)光電科技有限公司),超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(Scientz-Ⅱ D,寧波新芝生物科技股份有限公司);透射電子顯微鏡(JEM-1011,日本電子公司);紅外光譜儀(TenSor Ⅱ,德國Brukeroptics 公司);馬爾文粒度儀(英國 Nano ZS90);氣浴恒溫振蕩器(ZD-85A);真空干燥箱(上海一恒科技儀器有限公司);冷凍干燥(寧波新芝生物科技股份有限公司);磁力電熱套攪拌器(SZCL-3A型,杭州瑞佳儀器有限公司);酸度計(jì)(FE20,上海梅特勒托利多儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 竹炭納米粒子的合成

稱取商業(yè)竹炭粉250.7 mg,球磨機(jī)870 r/mim研磨10 h。將研磨后的竹炭粉與去離子水混合,靜置8～10 h后取出上清液。上清液超聲30 min后,進(jìn)一步在320 W的功率下進(jìn)行超聲處理。冰水浴中孵育6 h后得到竹炭納米粒子(BCNPs)。

1.2.2 竹炭納米粒子——阿霉素的合成

稱取制得的竹炭納米粒子50.0 mg,加入到含有濃度為0.1 mg/mL的10 mL阿霉素溶液的燒杯中,在室溫下避光攪拌24 h,通過離心的方法去除未負(fù)載的阿霉素,用去離子水洗滌3次,得到阿霉素負(fù)載的竹炭納米粒子(BCNPs-DOX)。

1.2.3 竹炭納米粒子修飾多巴胺的合成

稱取50.0 mg 多巴胺溶于含有50 mL Tris-HCl緩沖溶液(0.5 mol/L,pH=8.6)的燒杯中,緩慢加入制得的藥物負(fù)載的竹炭納米粒子(BCNPs-DOX)50.0 mg,在避光條件下攪拌6 h,然后用二次水離心洗滌3次,得到聚多巴胺修飾的納米材料(BCNPs@PDA/DOX)。

1.3 儀器表征及測試方法

1.3.1 透射電子顯微鏡(TEM)測試

將制備的BCNPs分散在二次水中配成納米懸浮液,滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上,干燥后,采用JEM-1011型透射電子顯微鏡對所制備的納米粒子的表觀形貌進(jìn)行觀察并拍照。

1.3.2 紅外吸收光譜(FTIR)測試

將制備的BCNPs和BCNPs-PDA樣品冷凍干燥,分別與溴化鉀混合研成粉末,壓片,用 TenSor Ⅱ FTIR 紅外光譜儀對樣品分別進(jìn)行掃描。掃描范圍為 4 000～500 cm-1。

1.3.3 Zeta電位測試

測試前分別將BCNPs、BCNPs-DOX以及BCNPs@PDA-DOX分散在二次水中配成納米懸浮液,采用Nano ZS90型馬爾文粒度分析儀分別表征所制備樣品的Zeta電位。

1.3.4 竹炭納米粒子光熱轉(zhuǎn)換測定

將竹炭納米粒子溶于二次水中,分別配置成濃度為1 mg/mL、2 mg/mL和4 mg/mL,用808 nm激光分別對不同濃度的竹炭納米粒子溶液進(jìn)行照射10 min,以二次水為對照,利用熱電偶溫敏計(jì)測量溶液溫度的變化,并繪制出溫度的變化曲線。

1.3.5 體外藥物釋放測定

準(zhǔn)確稱取5.0 mg的BCNPs@PDA/DOX 4份分別裝在4個(gè)棕色小瓶中,其中兩份各加入pH 5.4的PBS(0.01 mol/L)緩沖溶液10 mL,另兩份各加入pH 7.4的PBS (0.01 mol/L)緩沖溶液10 mL,將4個(gè)小瓶放在氣浴恒溫振蕩器(37℃)中。在預(yù)定的時(shí)間間隔從釋放液中取出 2 mL 釋放液, 同時(shí)加入 2 mL新鮮緩沖液;其中一份pH 5.4和一份pH 7.4的小瓶置于808 nm的近紅外光下照射5 min,然后再從中分別取出2 mL的上清液。檢測取出的釋放液熒光強(qiáng)度,使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算溶液中釋放的DOX含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 BCNPs@PDA/DOX的制備

BCNPs@PDA/DOX合成路線如圖1所示。采用物理球磨和尖端超聲法制備竹炭納米粒子,將竹炭納米粒子加入抗癌藥物阿霉素溶液中,黑暗下避光攪拌,通過π-π堆積作用將DOX分子被吸附到BCNPs。將負(fù)載阿霉素的BCNPs分散于多巴胺Tris-HCl緩沖液中,在氧氣作用下多巴胺氧化自聚到BCNPs表面,合成了BCNPs@PDA/DOX。

圖1 多巴胺修飾的竹炭納米材料的合成路線Fig.1 Synthesis routes of BCNPs@PDA/DOX

2.2 形貌分析

通過透射電鏡觀察所制備的竹炭納米材料的尺寸。從透射電鏡圖2所示,可以看到竹炭納米粒子尺寸在(42±10) nm左右,粒子形貌均一、形態(tài)良好,分散均勻,不粘連。

2.3 BCNPs的光熱轉(zhuǎn)換

使用808 nm近紅外光對BCNPs的光熱轉(zhuǎn)化情況進(jìn)行考察,如圖3所示。隨著BCNPs的濃度的增加,BCNPs水溶液的溫度明顯升高;當(dāng)BCNPs的濃度為4 mg/mL時(shí),近紅外光照射10 min內(nèi)升高的溫度可達(dá)49.7℃。二次水在照射10 min后,溫度顯示出較溫和的變化,溫度僅升高13℃。這些結(jié)果表明BCNPs具有良好的光熱性能。

2.4 電位分析

圖4是BCNPs、BCNPs-DOX以及BCNPs@PDA/DOX的電位分析。如圖所示,BCNPs的Zeta電位為-33.2 mV;載上抗癌藥物阿霉素之后,BCNPs-DOX的Zeta電位變?yōu)?18.2 mV,電位變大的原因是這主要是由于阿霉素帶有氨基的緣故;在表面上修飾多巴胺之后,BCNPs@PDA/DOX的Zeta電位變?yōu)?6.9 mV,電位變大的原因是由于多巴胺吸附于BCNPs-DOX表面,氨基增多的緣故。

2.5 紅外圖譜光譜(FTIR)分析

FTIR光譜用于表征BCNPs的表面化學(xué)基團(tuán)組成,如圖5所示。3 441 cm-1和1 596 cm-1兩個(gè)峰是BCNPs的羥基伸縮振動(dòng)峰。用聚多巴胺進(jìn)行表面修飾后出現(xiàn)了新的吸收峰,將3 420 cm-1和3 135 cm-1的吸收峰分別歸于多巴胺的羥基峰和氨基峰,1 620 cm-1處的峰是多巴胺的芳環(huán)C-C的共振振動(dòng)峰。

圖2 BCNPs(A)、BCNPs-DOX(B)和 BCNPs-DOX-PDA(C)的透射電鏡圖Fig.2 TEM pictures of BCNPs (A)、BCNPs-DOX (B) and BCNPs-DOX-PDA (C)

(1) water (2) 1 mg/mL (3) 2 mg/mL (4) 4 mg/mL圖3 不同濃度的BCNPs溶液在808 nm的激光(2 W/cm2)照射下的溫度變化曲線Fig.3 Photothermal conversion of different concentrations of BCNPs

圖4 樣品的電位圖譜Fig.4 Zeta Potential analysis of sample

圖5 樣品的紅外圖譜Fig.5 Fourier transform infrared spectra of sample

2.6 紫外可見近紅外光譜分析

圖6是BCNPs、BCNPs-DOX和BCNPs-DOX-PDA的紫外可見近紅外光譜,從圖中可以看出竹炭納米材料在可見光到近紅外區(qū)域范圍內(nèi)有廣泛的吸收,負(fù)載上抗癌藥物阿霉素以后,在480 nm附近出現(xiàn)阿霉素的紫外吸收峰,說明阿霉素成功負(fù)載在竹炭納米材料上,而且在可見近紅外范圍內(nèi)也有廣泛的吸收,并沒有影響竹炭納米材料的吸收;修飾多巴胺以后,480 nm仍然存在阿霉素的吸收峰,而且在可見近紅外范圍內(nèi)也有廣泛的吸收。

圖6 BCNPs、BCNPs-DOX和BCNPs-DOX-PDA的紫外可見近紅外吸收光譜Fig.6 UV-vis-NIR absorption spectrum of BCNPs,BCNPs-DOX and BCNPs-DOX-PDA.

圖7 BCNPs@PDA/DOX在不同pH和光照條件下的釋藥行為Fig.7 Release behavior of BCNPs@PDA/DOX under different pH and light conditions

2.7 藥物體外釋藥行為分析

在37 ℃條件下,在5.4和7.4的兩種不同的pH條件下研究BCNPs@PDA-DOX的DOX的釋放曲線,結(jié)果如圖7所示。兩種pH條件下都顯示出持續(xù)的藥物釋放模式。DOX在中性條件下(pH 7.4)中非常緩慢的釋放,在無近紅外光照射條件下8 h后僅釋放了2.1%,在有近紅外光的照射條件下,藥物釋放了6.7%。在弱酸性(pH 5.4)條件下,藥物的釋放速度比在中性條件下的釋放速度快。在pH 5.4的弱酸以及沒有近紅外光照射的條件下,在8 h內(nèi)藥物的釋放量僅為5.59%,在有近紅外光照射條件下,藥物的釋放量達(dá)到了35.19%,明顯高于沒有照射情況下的藥物釋放量,表明其可通過外部NIR光刺激刺激藥物釋放。NIR照射下DOX的快速釋放可歸因于BCNP的光熱效應(yīng),因?yàn)榫植繙囟壬呖稍黾覦OX與納米載體的解離,因此更多的DOX分子與BCNP分離。

3 結(jié)論

通過物理方法獲得竹炭納米材料(BCNPs),負(fù)載抗癌藥物阿霉素,進(jìn)一步采用聚多巴胺對BCNPs-DOX進(jìn)行表面改性,制備成功負(fù)載抗癌藥物DOX的竹炭聚多巴胺納米復(fù)合物,此制備方法簡單、易行。設(shè)計(jì)的納米復(fù)合物具有近紅外吸收的特性,能夠吸收808 nm的近紅外激發(fā)光,并轉(zhuǎn)化為熱量,可顯著提升環(huán)境溫度;此外,所合成的智能納米載體亦可用于近紅外觸發(fā)的藥物釋放,為構(gòu)建基于多巴胺修飾的竹炭納米粒子用于光熱觸發(fā)的藥物釋放和光熱治療提供了新的策略。