氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定植物油中8種維生素E及其在芝麻油真?zhèn)舞b別方面的應(yīng)用

沈偉健, 王 紅, 陸慧媛, 余可垚, 胡國(guó)紳, 魏雪緣, 吳 斌

(南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心, 江蘇 南京 210019)

維生素E又名生育酚或抗不育維生素等,是一類具有D-α-生育酚生物活性衍生物的總稱。天然的維生素E主要由α-、β-、γ-、δ-生育酚(α-、β-、γ-、δ-T)和α-、β-、γ-、δ-生育三烯酚(α-、β-、γ-、δ-T3)等8種異構(gòu)體組成[1],其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。維生素E具有提高機(jī)體免疫力、延緩衰老、神經(jīng)保護(hù)、抑制膽固醇合成及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、預(yù)防動(dòng)脈硬化和心血管疾病等多種生理功能。植物油中富含天然維生素E,是膳食中攝取維生素E的主要來(lái)源,但不同種類植物油中維生素E的種類和含量存在差異,因此維生素E組成信息可用于食用植物油的摻偽鑒別研究。

圖1 生育酚和生育三烯酚的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structural formulas of tocopherols and tocotrienols α-, β-, γ-, δ-T: α-, β-, γ-, δ-tocopherol; α-, β-, γ-, δ-T3: α-, β-, γ-, δ-tocotrienol.

目前,食用植物油中生育酚和生育三烯酚常用的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[2-6]、液相色譜-質(zhì)譜法[7-9]、氣相色譜法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11,12]和非水毛細(xì)管電泳法等[13]。高效液相色譜法分析維生素E主要分為反相液相色譜(RPLC)[2-7, 9]和正相液相色譜(NPLC)[8]兩種,其中,RPLC一般無(wú)法有效分離β-T與γ-T、β-T3與γ-T3兩對(duì)異構(gòu)體[7],需要特殊固定相的色譜柱才能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的完全分離[2-6,9];而NPLC法雖然可實(shí)現(xiàn)8種目標(biāo)物的有效分離,但是對(duì)于檢測(cè)機(jī)構(gòu)而言，大多數(shù)日常檢測(cè)工作使用的是RPLC系統(tǒng),在進(jìn)行正反相系統(tǒng)切換時(shí)為了獲得相對(duì)穩(wěn)定的保留時(shí)間,NPLC要去除流動(dòng)相中的痕量水,因此需要平衡較長(zhǎng)時(shí)間,既浪費(fèi)流動(dòng)相,又浪費(fèi)時(shí)間;采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定8種維生素E,既能實(shí)現(xiàn)完全分離,操作簡(jiǎn)單,又能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定性。但是目前采用氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的相關(guān)文獻(xiàn),目標(biāo)物均只涉及4種生育酚,而生育三烯酚均未涉及。本文建立了氣相色譜-質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定植物油中8種維生素E(α-、β-、γ-、δ-T)和α-、β-、γ-、δ-T3)的分析方法,并對(duì)芝麻油、大豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、花生油、棕櫚油等7種常見(jiàn)食用植物油中維生素E的組成進(jìn)行了分析,并初步探索了芝麻油摻偽的鑒別方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜儀(配有EI源,美國(guó)Agilent公司); WH-861旋渦混合器(太倉(cāng)華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司); KH-500B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司); Heraeus Multifuge X1R臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

D/L-α-T(純度:99.9%)、消旋-β-T(rac-β-T,純度:99.0%)、γ-T(純度:97.3%)、δ-T(純度:95.5%)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;D-α-T3(純度:98.7%)、D-β-T3(純度:97.0%)、D-γ-T3(純度:93.1%)、D-δ-T3(純度:99.4%)均購(gòu)自美國(guó)Chroma Dex公司。甲醇(色譜純)購(gòu)自德國(guó)Merck公司。芝麻油純品(15種)、大豆油(10種)、葵花籽油(10種)、菜籽油(10種)、花生油(10種)、玉米油(10種)和棕櫚油(10種)等7種植物油均由南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心提供,植物油的品牌包括金龍魚、福臨門、多力、魯花、西王、恒大、長(zhǎng)壽花等國(guó)內(nèi)品牌和谷班婭、歌喜多、奧尼、伊甸園等國(guó)外品牌,所有的植物油在實(shí)驗(yàn)前均密封避光儲(chǔ)存,防止氧化變質(zhì)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取α-,β-,γ-,δ-T和α-,β-,γ-,δ-T3標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg(精確至0.01 mg),置于10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并定容,配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-18 ℃條件下避光保存。分別移取上述8種單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1.0 mL,置于10 mL棕色容量瓶中,加甲醇稀釋并定容,配制成100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-4 ℃避光保存。使用前用甲醇將100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋至10 mg/L和1 mg/L。

分別準(zhǔn)確吸取適量1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于進(jìn)樣瓶中,加甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱取0.10 g(精確至0.000 1 g)植物油樣品,置于50 mL塑料離心管中,加入10.0 mL甲醇,渦旋1 min,超聲提取30 min,以8 000 r/min的速率離心3 min,吸取上清液約1 mL,置于進(jìn)樣瓶中,待GC-EI-MS分析。若樣品溶液中生育酚或生育三烯酚的含量超出線性范圍,則對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再測(cè)定。

1.4 分析條件

1.4.1氣相色譜條件

色譜柱:DB-5ms石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國(guó)Agilent公司);進(jìn)樣口溫度:300 ℃;接口溫度:280 ℃;程序升溫條件:初始溫度為60 ℃,以40 ℃/min的速率升溫至300 ℃,保持8 min;載氣:高純氦氣(純度≥99.999%);柱流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:EI源;離子源溫度:230 ℃;四極桿溫度:150 ℃;電子能量:70 eV;溶劑延遲:6 min;數(shù)據(jù)采集方式:分時(shí)段選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式。具體參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 8種維生素E的保留時(shí)間及其窗口時(shí)間和監(jiān)測(cè)離子信息

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

為考察已建立的氣相色譜-電子轟擊源-質(zhì)譜法應(yīng)用于植物油中8種維生素E測(cè)定的可行性和有效性,對(duì)檢出限、定量限、線性范圍、回收率和精密度等方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

2.1.1線性范圍、檢出限和定量限

取1.2節(jié)下已配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,在1.4節(jié)色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定,1.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖見(jiàn)圖2?？梢钥闯?在所設(shè)定的程序升溫條件下,8種目標(biāo)化合物均基本實(shí)現(xiàn)基線分離。

圖2 8種維生素E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg/L)的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of the eight vitamin E (1.0 mg/L) in standard solution

采用外標(biāo)法進(jìn)行定量,以各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度(X, mg/L)為橫坐標(biāo)、定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,線性方程及相關(guān)系數(shù)(r)見(jiàn)表2。結(jié)果顯示,r為0.996 7～0.999 8,說(shuō)明8種維生素E在0.01～1 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。按S/N=3和S/N=10分別計(jì)算儀器的檢出限和定量限,分別為0.03～0.25 mg/kg和0.10～0.83 mg/kg(見(jiàn)表2)。

表 2 8種維生素E的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area of quantitative ion;X: mass concentration, mg/L.

2.1.2加標(biāo)回收率和精密度

稱取0.10 g(精確至0.000 1 g)芝麻油樣品24份,平均分成4組,第1組按1.3節(jié)樣品前處理方法直接測(cè)定,第2～4組用于加標(biāo)回收率試驗(yàn)(10、50和250 mg/kg 3個(gè)添加水平),再按1.3節(jié)樣品前處理方法測(cè)定,計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明,在3個(gè)加標(biāo)水平下,8種維生素E的平均回收率為87.5%～107.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%～7.5%(見(jiàn)表3),說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度和精密度均良好。

方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果表明,所建立的方法分離效果好,靈敏度和準(zhǔn)確度高,適用于包括芝麻油在內(nèi)的食用植物油中生育酚和生育三烯酚的測(cè)定。

表 3 芝麻油中8種維生素E的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

ND: below LOD.

表 4植物油中生育酚和生育三烯酚的含量

Table 4Contents of tocopherols and tocotrienols in vegetable oilsmg/kg

CompoundSesame oil(n=15)Soybean oil(n=10)Rapeseed oil(n=10)Sunflower oil (n=10)Peanut oil (n=10)Maize oil (n=10)Palm oil (n=10)δ-T14.54253.4216.470.6010.3132.08NDβ-T0.3125.923.1620.336.5911.231.71γ-T447.83739.42370.897.7098.50522.533.57α-T8.56167.95247.07527.70152.45180.88170.56δ-T3NDNDNDNDNDND86.62β-T3NDNDNDNDNDND15.00γ-T3NDNDNDNDND16.38337.74α-T3NDNDNDNDND11.54218.06

2.2 食用植物油中生育酚和生育三烯酚的組成

采用已建立的方法對(duì)7種植物油共75個(gè)植物油樣品中的生育酚和生育三烯酚進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)植物油樣品重復(fù)測(cè)定3次(見(jiàn)表4)。結(jié)果顯示,不同種類食用植物油中生育酚和生育三烯酚的組成和含量存在差異,芝麻油、大豆油、菜籽油、葵花籽油和花生油中不含生育三烯酚,玉米油中含有較低量的α-T3(11.54 mg/kg)和γ-T3(16.38 mg/kg),而棕櫚油中同時(shí)檢出4種T3,而且α-T3和γ-T3的平均含量均不低于200 mg/kg。芝麻油、大豆油、菜籽油、玉米油等植物油中主要為γ-T,葵花籽油和花生油中主要含有α-T,棕櫚油中主要以γ-T3為主,大豆油中δ-T含量是所有植物油中最高(253.42 mg/kg),而各種植物油中β-T含量均較低(0.31～25.92 mg/kg)。

將芝麻油與其他6種植物油中8種維生素E的組成和含量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn):①芝麻油中α-T的含量(8.56 mg/kg)遠(yuǎn)低于其他6種其他植物油(152.45～527.70 mg/kg),因此當(dāng)待測(cè)芝麻油樣品中α-T明顯高于8.56 mg/kg時(shí),待測(cè)樣品就可能摻雜有其他植物油;②芝麻油中幾乎不含β-T(0.31 mg/kg),其他6種植物油中β-T的含量也相對(duì)較低(1.71～25.92 mg/kg),因此理論上β-T這個(gè)指標(biāo)沒(méi)有鑒別價(jià)值;③芝麻油中γ-T含量(477.83 mg/kg)與大豆油(739.42 mg/kg)、菜籽油(370.89 mg/kg)和玉米油(522.53 mg/kg)相近,但明顯高于花生油(98.50 mg/kg)、葵花籽油(7.70 mg/kg)和棕櫚油(3.57 mg/kg); ④芝麻油中δ-T含量(14.54 mg/kg)與菜籽油(16.47 mg/kg)、花生油(10.31 mg/kg)和玉米油(32.08 mg/kg)相近,高于葵花籽油(0.60 mg/kg)和棕櫚油(未檢出),大豆油中δ-T的含量(253.42 mg/kg)約是芝麻油的15倍,因此當(dāng)待測(cè)芝麻油樣品中δ-T明顯提高時(shí),該樣品就很可能混入了大豆油;⑤芝麻油中不含生育三烯酚,而棕櫚油中同時(shí)含有4種生育三烯酚,α-、β-、γ-和δ-T3的含量分別為218.06、15.00、337.74和86.62 mg/kg,因此當(dāng)待測(cè)芝麻油樣品中α-、β-、γ-和δ-T3有檢出時(shí),待測(cè)樣品就可能摻雜了棕櫚油。綜上,α-T、δ-T和α-、β-、γ-及δ-T3均可以作為芝麻油真?zhèn)舞b別的標(biāo)記物,值得進(jìn)一步研究。

3 小結(jié)

本研究建立了GC-MS同時(shí)測(cè)定植物油中α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-生育三烯酚等8種維生素E的方法。方法操作簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確、可靠,靈敏度高。采用已建立的方法對(duì)芝麻油、大豆油、菜籽油、葵花籽油、花生油、玉米油和棕櫚油等7大類共75個(gè)樣品中生育酚和生育三烯酚的含量進(jìn)行了測(cè)定,并經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn),芝麻油與其他較廉價(jià)植物油中8種維生素E的組成和含量均存在一定差異,初步探索了芝麻油摻偽不同植物油的特征鑒定指標(biāo)。