基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的血清氨基酸代謝譜在尿石癥中的應(yīng)用

高 瑤, 龔思思, 張?zhí)炻? 唐敏潔, 張蓓英, 陳 敏, 歐啟水, 毛厚平

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院, 福建 福州 350004; 2. 福建省漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)中心, 福建 福州 350003; 3. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 福建 福州 350005)

尿石癥是泌尿外科最常見的疾病之一,5年復(fù)發(fā)率超過50%,發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。我國(guó)是世界上三大結(jié)石高發(fā)區(qū)之一,尿石癥發(fā)病率約為6%[2]。目前,診斷尿石癥常需借助計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和超聲波,輔助血清生化試驗(yàn)和尿液分析等手段[3,4]。這些方法價(jià)格昂貴,不僅無(wú)法實(shí)現(xiàn)早期診斷,而且具有一定輻射性或侵入性,患者常因缺乏早期預(yù)防和充分護(hù)理而受累[5]。因此,發(fā)展一種簡(jiǎn)便快捷的早期診斷尿石癥的方法尤為重要。

氨基酸是人體重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6],與氨基酸相關(guān)的各類代謝物約占人體重量的20%,在調(diào)控各項(xiàng)代謝通路中發(fā)揮重要作用[7]。氨基酸代謝譜作為代謝組學(xué)研究策略之一,近年來(lái)已應(yīng)用于乳腺癌、食管癌、帕金森病及主動(dòng)脈夾層分離等研究中[7-10]。Atanassova等[11]采用高效液相色譜法分析36例結(jié)石患者尿氨基酸排泄情況,發(fā)現(xiàn)約50%患者尿液中含有較低的絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、?；撬岷土涟彼?Leu)。Zee等[12]和Sahota等[13]利用基因敲除的Slc3a1(-/-)小鼠胱氨酸(CySS)尿癥模型均證實(shí)CySS與CySS結(jié)石的形成密切相關(guān)。Gao等[14]建立小鼠草酸鈣結(jié)晶沉積腎臟模型,發(fā)現(xiàn)了包括精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)和色氨酸(Try)在內(nèi)的30種代謝物可作為結(jié)晶性腎損害的潛在生物標(biāo)志物。這些報(bào)道表明,尿石癥患者體內(nèi)可能存在氨基酸代謝紊亂現(xiàn)象,有望通過氨基酸代謝譜篩查出標(biāo)志物,揭示結(jié)石形成機(jī)制。

氨基酸是兩性離子,其羧基、氨基以及側(cè)鏈官能團(tuán)未衍生化前并不適合進(jìn)行色譜分離,酯化、?；?、硅烷化等衍生法可增強(qiáng)其在色譜柱上的保留,提高分析靈敏度[15]。相較于氯甲酸異丁酯(IBCF)等酯化衍生試劑,四甲基硅烷(TMS)等硅烷化衍生試劑對(duì)水分子敏感性強(qiáng)[16],不適用于血清、尿液等含水量高的生物樣本。液相色譜熒光法和紫外分光光度法常存在干擾物共洗脫的問題[17],而氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)具有高靈敏度、高選擇性和高通量等優(yōu)勢(shì),在糖尿病、心肌梗死與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病研究中已有相關(guān)報(bào)道[18-20],且在尋找潛在生物標(biāo)志物時(shí),常用于檢測(cè)氨基酸、脂肪酸與花生四烯酸等天然物質(zhì)[21-24]。

目前尚無(wú)尿石癥相關(guān)氨基酸代謝譜的研究報(bào)道,且探討患者體內(nèi)氨基酸代謝異常與疾病相關(guān)性的分析仍較少。血清樣本具有方便易取和穩(wěn)定通用的優(yōu)勢(shì),是用于篩檢生物標(biāo)志物的理想樣本[25-27]。因此,本研究擬運(yùn)用GC-MS建立尿石癥的血清氨基酸代謝譜,從中篩選特征性差異氨基酸作為潛在生物標(biāo)志物,為早期診斷尿石癥提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜儀、2 mL樣品瓶(美國(guó)Agilent公司); 1.5 mL離心管(美國(guó)Corning公司);超純水儀(德國(guó)Millipore公司); 3-30K高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司); BP 211 D電子天平(德國(guó)Sartorious公司)。

17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品包括丙氨酸(Ala)、Arg、天冬氨酸(Asp)、CySS、谷氨酸(Glu)、Leu、賴氨酸(Lys)、Ser、蘇氨酸(Thr)、Tyr、纈氨酸(Val)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、蛋氨酸(Met)、Gly、苯丙氨酸(Phe)和Pro(美國(guó)Sigma-Aldrich公司),其中CySS濃度為1 250 μmol/L,其余氨基酸濃度均為2 500 μmol/L;單氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品包括Try(純度98.5%)、半胱氨酸(Cys,純度98%)和谷氨酰胺(Gln,純度99%)(加拿大Toronto Research Chemicals公司);乙腈、無(wú)水乙醇、異辛烷(色譜純,德國(guó)Merck公司);氫氧化鈉、氯苯丙氨酸(CPA,分析純)、鹽酸(優(yōu)級(jí)純)(國(guó)藥集團(tuán)有限公司);吡啶(純度99.8%,中國(guó)上海阿拉丁公司); IBCF(分析純,中國(guó)上海安譜公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣本收集

研究對(duì)象為2015～2016年福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科80例尿石癥患者(病例組)和同期體檢中心37例健康體檢者(對(duì)照組),兩組年齡與性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。所有研究對(duì)象均清晨空腹肘前靜脈采血于分離膠促凝管,并于采集后1 h內(nèi)以3 000 r/min離心10 min,取上層血清分裝入1.5 mL離心管中,于-80 ℃冰凍保存。研究所涉及血清樣本均經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審定([2014]福醫(yī)倫理審字第(106)號(hào))。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取適量Try、Cys和Gln,各加入0.1 mol/L鹽酸,配制成濃度為2 000 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

用0.1 mol/L鹽酸作為溶劑,將上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品配制成500 μmol/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(CySS濃度為250 μmol/L);再用0.1 mol/L鹽酸稀釋成1、5、10、25、50、100和250 μmol/L(CySS對(duì)應(yīng)濃度為0.5、2.5、5、12.5、25、50和125 μmol/L)的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃保存。

1.2.3樣本前處理

血清樣本于室溫復(fù)融后，以3 000 r/min離心5 min,吸取100 μL,置于1.5 mL離心管中,加入400 μL乙腈和200 μL乙醇,搖勻,于4 ℃靜置20 min,以3 000 r/min離心5 min。吸取500 μL上清液,置于2 mL樣品瓶中,依次加入100 μL 0.1 mg/mL CPA、400 μL超純水和10 μL 7 mol/L氫氧化鈉后,吹打混勻1 min,加入50 μL吡啶后,振蕩混勻1 min,加入40 μL IBCF后,混勻1 min,并在反應(yīng)過程中注意放氣,然后加入300 μL異辛烷,混勻后靜置5 min,吸取上清液100 μL,置于2 mL樣品瓶中,待GC-MS分析。

1.2.4分析條件

色譜柱:HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國(guó)Agilent公司);進(jìn)樣口溫度:260 ℃;不分流進(jìn)樣;載氣:高純氦氣(99.999%);流速:1 mL/min。升溫程序:初始溫度80 ℃,保持2 min,以10 ℃/min的速率升至140 ℃,再以4 ℃/min的速率升至240 ℃,然后以10 ℃/min的速率升至280 ℃,保持3 min。進(jìn)樣量:1 μL。

離子源:電子轟擊(EI)源;掃描模式:選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式;電子碰撞能量:70 eV;傳輸線、離子源和四極桿溫度:260、230和150 ℃;溶劑延遲時(shí)間:9.5 min。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:117例臨床血清樣本的氨基酸含量數(shù)據(jù)采用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA),用于考察病例組和對(duì)照組之間氨基酸代謝譜的差異。PCA是一種無(wú)監(jiān)督的多元變量分析,以觀測(cè)所有樣本間的分離趨勢(shì)并剔除離群值。OPLS-DA是一種有監(jiān)督多元統(tǒng)計(jì)分析方法,用Pareto量化處理兩組氨基酸代謝譜后,可清晰直觀地觀察兩組間的分離趨勢(shì),并通過設(shè)置變量重要性投影(VIP)閾值,篩選出差異氨基酸,同時(shí)利用模型交叉驗(yàn)證預(yù)測(cè)力Q2值和盲樣預(yù)測(cè)散點(diǎn)圖展示模型的預(yù)測(cè)能力。

潛在生物標(biāo)志物確定:采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行兩樣本t檢驗(yàn)分析,設(shè)置p界值為0.05,結(jié)合OPLS模型VIP閾值為1,篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異氨基酸。同時(shí),運(yùn)用邏輯回歸分析和受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)價(jià)潛在生物標(biāo)志物的臨床診斷能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

本研究?jī)?yōu)化了血清前處理方法。首先,采用不同組合和比例的甲醇、乙醇和乙腈作為蛋白質(zhì)沉淀劑進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，體積比為2∶1的乙腈-乙醇混合溶液對(duì)血清蛋白的沉淀效率最高。接著,考察了三氟乙酸酐、氯甲酸乙酯、氯甲酸丙酯和IBCF等衍生試劑,結(jié)果顯示,當(dāng)IBCF作為衍生化試劑時(shí),反應(yīng)時(shí)間較短且產(chǎn)物穩(wěn)定。最后,分別比較了氯仿、正己烷和異辛烷等萃取劑對(duì)酯化氨基酸的提取能力,結(jié)果表明異辛烷的萃取效率較高。

圖1 16種目標(biāo)氨基酸和內(nèi)標(biāo)CPA的總離子流(TIC)色譜圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of the 16 target amino acids and CPA (IS) CPA: chlorphenylalanine; Ala: alanine; Gly: glycine; CySS: cystine; Val: valine; Leu: leucine; Ile: isoleucine; Pro: proline; Ser: serine; Asp: aspartic acid; Met: methionine; Cys: cysteine; Glu: glutamate; Phe: phenylalanine; Lys: lysine; Try: tryptophan; Tyr: tyrosine.

2.2 目標(biāo)氨基酸定性結(jié)果

吸取100 μL 50 μmol/L氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(CySS的濃度為25 μmol/L),按1.2.3節(jié)血清前處理方法經(jīng)沉淀、衍生化和萃取,進(jìn)入GC-MS檢測(cè)。優(yōu)化色譜分離條件與質(zhì)譜檢測(cè)條件后,發(fā)現(xiàn)其中4種氨基酸衍生效果不理想,為保證定量準(zhǔn)確,故將目標(biāo)氨基酸確定為Ala、Gly、CySS、Val、Leu、Ile、Pro、Ser、Asp、Met、Cys、Glu、Phe、Lys、Try和Tyr,共16種。

圖1為50 μmol/L氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(CySS的濃度為25 μmol/L)和內(nèi)標(biāo)CPA的總離子流(TIC)色譜圖,可見目標(biāo)氨基酸達(dá)到了較好的分離效果;其中,通過特征質(zhì)譜圖(見圖2)確定了各氨基酸的特征碎片峰,結(jié)合保留時(shí)間進(jìn)行定性分析,在SIM模式下進(jìn)行定量。

表 1 16種目標(biāo)氨基酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area ratio of amino acid to internal standard;X: concentration, μmol/L.

2.3 方法學(xué)考察

按1.2.2節(jié)配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)衍生化后進(jìn)行GC-MS檢測(cè),以目標(biāo)氨基酸定量離子與內(nèi)標(biāo)物CPA定量離子的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)、目標(biāo)氨基酸的濃度為橫坐標(biāo)(X, μmol/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明,16種氨基酸在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均超過0.998 5。以信噪比(S/N)為3和10時(shí)分別對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),目標(biāo)氨基酸的LOD和LOQ分別為0.1～4.0 μmol/L和0.3～13.2 μmol/L。16種目標(biāo)氨基酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ見表1。

2.4 模式識(shí)別分析

根據(jù)方法學(xué)考察結(jié)果可知,大部分樣本中CySS和Cys濃度均低于其LOD值。因此,針對(duì)其余14種目標(biāo)氨基酸進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。PCA為無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別方法,能夠觀察各樣本間分布情況,以R2X表示該模型相應(yīng)主成分對(duì)整體變量的解釋能力。如圖3a所示,PCA模型參數(shù)R2X值為0.747,說(shuō)明主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到74.7%。為進(jìn)一步降低組內(nèi)差異的干擾,分析氨基酸代謝譜的診斷價(jià)值,構(gòu)建了有監(jiān)督狀態(tài)下的OPLS-DA模型(見圖3b),兩組樣本有了進(jìn)一步較明顯的分離。模型參數(shù)為R2X=0.501、R2Y=0.475和Q2=0.402。為進(jìn)一步說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)能力,在兩組中分別隨機(jī)抽取20%的樣本作為盲樣,進(jìn)行OPLS-DA模型分析。圖3c展示了該模型較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。鑒于生物樣本因生理性波動(dòng)等原因存在異質(zhì)性,個(gè)別樣本點(diǎn)落在圈外。

圖2 16種目標(biāo)氨基酸的特征質(zhì)譜圖Fig. 2 Typical mass spectra of the 16 target amino acids* Quantitative ion.

圖3 血清樣本的(a)PCA、(b)OPLS-DA得分圖和(c)T預(yù)測(cè)散點(diǎn)圖Fig. 3 (a) Principal component analysis (PCA), (b) orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) score plots , and (c)T-predicted scatter plot of the serum samples

2.5 潛在生物標(biāo)志物篩選

采用兩樣本t檢驗(yàn),比較病例組和對(duì)照組中14種目標(biāo)氨基酸的含量,結(jié)合VIP>1和p<0.05兩個(gè)條件,篩選出5種差異氨基酸,即Glu、Ser、Asp、Gly和Try,其ROC曲線下面積(AUC)值均大于0.5,差異氨基酸水平在病例組中均明顯下調(diào)(見圖4)。

圖4 差異氨基酸在病例組(紅色)和對(duì)照組(藍(lán)色)中含量的箱形圖Fig. 4 Box charts of differential amino acids between disease group (red) and control group (blue)

其中,Ser的ROC曲線上最佳診斷點(diǎn)的靈敏度和特異性分別為94.6%和66.2%, AUC值為0.819;相對(duì)于其他目標(biāo)氨基酸而言,Ser顯示出較高的診斷準(zhǔn)確性,使其有望成為尿石癥的靈敏篩查指標(biāo)。進(jìn)一步將Glu、Ser、Asp、Gly和Try聯(lián)合成為一個(gè)標(biāo)志物組,利用邏輯回歸分析結(jié)合ROC曲線評(píng)價(jià)該聯(lián)合指標(biāo),靈敏度和特異性分別為97.3%和67.5%, AUC值達(dá)0.822(見圖5),較單個(gè)Ser效果更令人滿意;提示5種氨基酸的聯(lián)合使用具有極強(qiáng)的尿石癥篩查能力。

圖5 5種差異氨基酸聯(lián)合的ROC曲線Fig. 5 Receiver operator characteristic (ROC) curve of the five differential amino acids by integratingAUC: area under the curve.

2.6 差異氨基酸與尿石癥的相關(guān)性分析

本研究采用GC-MS檢測(cè)平臺(tái),利用尿石癥患者和健康體檢者的血清樣本構(gòu)建氨基酸代謝譜,發(fā)現(xiàn)病例組血清氨基酸代謝與對(duì)照組存在差異。經(jīng)方法學(xué)考察及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后,最終篩選出5種差異氨基酸:Glu、Ser、Asp、Gly和Try。

Glu和Asp均為酸性氨基酸,在草酸鈣晶體的發(fā)展過程中具有重要作用。草酸鈣結(jié)石是尿路結(jié)石中最為常見的類型[28],多項(xiàng)研究表明,草酸鈣晶體能夠損傷腎小管上皮細(xì)胞[29-31]。Glu和Asp能夠影響草酸鈣晶體成核,抑制晶體生長(zhǎng)和聚集,修復(fù)晶體對(duì)腎細(xì)胞損傷[32]。人體具有自我調(diào)節(jié)功能,患者若存在細(xì)胞損傷,則會(huì)利用Glu和Asp修復(fù)損傷,使其含量因消耗而下降,故在本研究中觀察到病例組Glu和Asp含量均顯著下調(diào)。Glu和Asp的AUC均大于0.7,提示這兩種氨基酸與疾病進(jìn)展密切相關(guān),其含量下降程度可反映細(xì)胞受損程度。

Ser和Gly能夠相互轉(zhuǎn)化,并與結(jié)石的成因緊密相關(guān)。一方面,Ser可合成嘌呤前體,而嘌呤的最終產(chǎn)物為尿酸。Kuta等[33]研究證實(shí)結(jié)石患者平均血清尿酸水平高于非結(jié)石患者;沈欣[34]利用化學(xué)和紅外線兩種方法對(duì)200例尿路結(jié)石進(jìn)行化學(xué)成分分析,認(rèn)為血清尿酸水平與草酸鈣結(jié)石和尿酸結(jié)石的形成有關(guān),尿酸水平的升高是尿結(jié)石潛在風(fēng)險(xiǎn)因素之一。另一方面,Gly是合成草酸的原料之一,參與草酸鈣結(jié)石的形成[11]。Ser和Gly作為結(jié)石晶體的合成原料,在尿石癥患者體內(nèi)因消耗而含量下降。本研究病例組Ser和Gly含量均明顯減少,提示患者體內(nèi)可能處于高尿酸狀態(tài),并存在結(jié)石晶體形成。Ser的AUC值高達(dá)0.819,有望成為臨床上快速早診的靈敏指標(biāo)。

Try是人體內(nèi)重要的必需氨基酸[35]。Gao等[14]構(gòu)建的草酸鈣結(jié)晶腎損傷小鼠模型中,尿液中Try含量上升,推測(cè)由于患者病情加重致腎損傷而使Try濾過增加,血清中Try含量因此下降。Gao等[36]的另一研究發(fā)現(xiàn)在草酸鈣結(jié)晶腎損傷大鼠模型中,血清犬尿氨酸(Kyn)含量下降;并且,Try主要代謝轉(zhuǎn)化為Kyn,故血清Try含量下降可致Kyn減少。本研究中病例組Try含量顯著降低,提示尿石癥患者機(jī)體可能存在實(shí)質(zhì)性腎損傷。

圖6 潛在生物標(biāo)志物的代謝通路圖Fig. 6 Metabolic pathways of potential biomarkers TCA: tricarboxylic acid; acetyl-CoA: acetyl coenzyme A.

Glu、Ser、Asp、Gly和Try均為生糖氨基酸,與體內(nèi)糖酵解、三羧酸(TCA)循環(huán)、糖異生和氨基酸代謝密切相關(guān)(見圖6)。Gly在羥甲基轉(zhuǎn)移酶作用下與Ser相互轉(zhuǎn)化,Ser的前體來(lái)自糖酵解途徑中的3-磷酸甘油酸,后者先后經(jīng)磷酸甘油酸變位酶和烯醇化酶催化產(chǎn)生磷酸烯醇式丙酮酸。磷酸烯醇式丙酮酸經(jīng)以下兩種方式轉(zhuǎn)化為TCA循環(huán)的起始物質(zhì)乙酰輔酶A:一方面合成Try,后者經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化生成乙酰輔酶A;另一方面經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸,后者在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體作用下轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。TCA循環(huán)中α-酮戊二酸與氨基結(jié)合生成Glu,參與氨基酸代謝途徑。TCA循環(huán)中草酰乙酸在轉(zhuǎn)氨酶作用下,與Asp實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化。同時(shí),草酰乙酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶作用下,生成磷酸烯醇式丙酮酸,進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸進(jìn)入糖異生途徑。這5種氨基酸含量下降,提示患者體內(nèi)糖酵解、TCA循環(huán)、糖異生和氨基酸代謝多條代謝途徑出現(xiàn)異常。

3 結(jié)論

尿石癥作為高發(fā)病率和高復(fù)發(fā)率的泌尿系統(tǒng)疾病,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,但其早期診斷和提早治療尤為困難。本研究運(yùn)用GC-MS平臺(tái)和代謝組學(xué)策略分析尿石癥血清氨基酸代謝譜,篩選出Ser等5種具有臨床診斷能力的潛在生物標(biāo)志物,展示了氨基酸代謝譜在篩選尿石癥潛在生物標(biāo)志物方面的應(yīng)用前景,拓展了基于GC-MS技術(shù)的代謝組學(xué)平臺(tái)的應(yīng)用范疇,有望通過包括氨基酸在內(nèi)的代謝物群組成為疾病標(biāo)志物,以輔助臨床進(jìn)行疾病的早期診斷。