液相色譜塔板高度方程的統(tǒng)一形式

戴朝政, 徐小平

(1. 中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所, 四川 成都 610041; 2. 四川大學(xué)華西藥學(xué)院, 四川 成都 610041)

色譜過程動(dòng)力學(xué)研究通常是把色譜柱簡(jiǎn)化為一維空間看待,只考慮各種縱向擴(kuò)散因素對(duì)分離效能的影響。實(shí)際上,物質(zhì)在柱內(nèi)的擴(kuò)散是在三維空間中進(jìn)行的。組分的徑向擴(kuò)散改變了分子在柱內(nèi)行進(jìn)的路線與距離,最終造成譜帶彌散。此外,液相色譜動(dòng)力學(xué)過程研究一般也沒有考慮色譜分析過程中流動(dòng)相發(fā)熱對(duì)柱效能的影響。但是隨著色譜技術(shù)的發(fā)展,吸附劑粒徑越來越小,因而所需要的色譜柱前壓力越來越高,柱壓的升高使流動(dòng)相通過擔(dān)體摩擦生熱,導(dǎo)致柱溫升高。當(dāng)前采用的UPLC的柱前壓可達(dá)100～150 MPa,在這樣高的壓力下，1 mL流動(dòng)相通過色譜柱因摩擦生熱可達(dá)100～150 J。而毛細(xì)管電色譜(CEC)以及消滯留層色譜(eliminate stagnant fluid layer chromatography, ESFLC)都要在色譜柱兩端施加電壓,電流通過流動(dòng)相也會(huì)發(fā)熱導(dǎo)致柱溫升高,發(fā)熱現(xiàn)象更加明顯。由于柱邊緣與外界接觸可以散熱,因此柱中心的溫度比柱斷面邊緣要高,可形成一個(gè)環(huán)形與中心對(duì)稱的溫度梯度。柱中心流動(dòng)相溫度高、黏度低,故流速快,柱斷面邊緣流動(dòng)相流速慢。斷面上流速的差異使得柱內(nèi)傳輸?shù)奈镔|(zhì)先后到達(dá)檢測(cè)系統(tǒng),形成縱向彌散。

20世紀(jì)70年代,Horvath和Lin[1,2]運(yùn)用間隙滯流體模型導(dǎo)出了液相色譜塔板高度方程(公式符號(hào)意義和推導(dǎo)過程請(qǐng)見參考文獻(xiàn)[3]):

(1)

公式1沒有考慮在色譜過程中物質(zhì)的徑向擴(kuò)散和流動(dòng)相發(fā)熱升溫對(duì)塔板高度的影響。但隨著色譜技術(shù)的發(fā)展,必須要考慮柱發(fā)熱與升溫以及物質(zhì)的徑向擴(kuò)散與塔板高度的關(guān)系。在此,筆者從熱傳導(dǎo)方程出發(fā),推導(dǎo)了包含徑向擴(kuò)散和流動(dòng)相發(fā)熱升溫因素在內(nèi)的液相色譜塔板高度公式。該公式既可描述傳統(tǒng)的HPLC也可以概括UPLC、CEC、ESFLC塔板高度方程，為液相色譜技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展提供指導(dǎo)意見。

1 基礎(chǔ)知識(shí)

理論上UPLC、CEC、ESFLC與HPLC除流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力的大小和方式不同,色譜過程并無實(shí)質(zhì)性差別,上述色譜過程柱發(fā)熱原理雖然有所不同,也只是熱源密度函數(shù)的表述不同。因此塔板高度統(tǒng)一公式需在公式1的基礎(chǔ)上補(bǔ)充流動(dòng)相在柱內(nèi)溫度分布場(chǎng)和徑向擴(kuò)散對(duì)柱效率的影響。

徑向擴(kuò)散與流動(dòng)相流型有關(guān),流動(dòng)相流型又與柱內(nèi)溫度分布場(chǎng)有關(guān)。如果徑向擴(kuò)散對(duì)塔板高度的貢獻(xiàn)為H徑,塔板高度公式應(yīng)是在公式1的基礎(chǔ)上加上H徑項(xiàng),而H徑項(xiàng)中概括了流動(dòng)相流型和溫度分布場(chǎng)的貢獻(xiàn)。根據(jù)色譜過程動(dòng)力學(xué)理論,H徑與相應(yīng)的徑向擴(kuò)散系數(shù)D徑關(guān)系為[3]:

(2)

其中,D徑為因徑向擴(kuò)散和溫度場(chǎng)的存在形成譜帶彌散的擴(kuò)散系數(shù),ν為譜帶在柱內(nèi)移動(dòng)的速度。

2 理論推導(dǎo)

徑向擴(kuò)散是在流動(dòng)相中進(jìn)行的,因此與流動(dòng)相流型有關(guān)。流動(dòng)相流型又與柱內(nèi)的溫度分布有關(guān)。因此首先要考慮色譜過程進(jìn)行時(shí)，柱內(nèi)溫度是如何分布的。

2.1 均勻發(fā)熱無限長(zhǎng)度圓柱體內(nèi)溫度場(chǎng)的平衡分布

通過經(jīng)典的熱傳導(dǎo)方程[4],可解得在均勻內(nèi)熱源情況下，溫度(T)沿柱截面徑向分布函數(shù)為：

(3)

式中,r0為柱內(nèi)半徑,r為離軸心的距離;T0為柱內(nèi)壁的平衡溫度;K為與熱強(qiáng)度、熱傳導(dǎo)系數(shù)有關(guān)的常數(shù)。對(duì)于液體溶劑摩擦生熱有：

(4)

(5)

K與電場(chǎng)強(qiáng)度E平方成正比,與流動(dòng)相的熱導(dǎo)效率λc、摩爾電導(dǎo)率λi、摩爾濃度ci,以及流動(dòng)相在柱斷面占有分?jǐn)?shù)κ1有關(guān)(由于擔(dān)體內(nèi)部的流動(dòng)相可導(dǎo)電,此處流動(dòng)相在柱斷面占有分?jǐn)?shù)κ1與通常理解的流動(dòng)相在柱斷面占有分?jǐn)?shù)κ1數(shù)值上略微不同)。

2.2 溫度場(chǎng)對(duì)譜帶彌散的影響

溫度的差異可以導(dǎo)致流動(dòng)相黏度產(chǎn)生變化，從而引起流動(dòng)相流速?gòu)较蚍植籍a(chǎn)生差異。在溫度差不太大的情況下,Knox[5]指出,液體的黏度與溫度的關(guān)系為:

η=η0exp(α×ΔT)

(6)

其中,η0為流動(dòng)相的溫度為T0時(shí)的黏度;α為流動(dòng)相黏度的溫度系數(shù)。由于流動(dòng)相線速度與黏度成反比,考慮到公式3,色譜柱內(nèi)流動(dòng)相線速度的徑向分布函數(shù)為:

(7)

×exp(Kr2α)=Aexp(Kr2α)

(8)

其中常數(shù)(A)為:

(9)

2.3 徑向彌散系數(shù)D徑對(duì)塔板高度的貢獻(xiàn)

|Kr2α|遠(yuǎn)小于1,因此有如下公式:

u(r)-ν(r)≈A(1+Kr2α)

(10)

以下把上式中u(r)和ν(r)簡(jiǎn)寫為u和ν,則有如下公式[6]:

(11)

(12)

(13)

進(jìn)一步解得到:

(14)

(15)

(16)

最后得到考慮到徑向擴(kuò)散和熱效應(yīng)的液相色譜塔板高度統(tǒng)一公式:

(17)

3 結(jié)果與討論

圖1 (a)塔板高度與流動(dòng)相線速度的關(guān)系和(b)Horvath和Lin曲線Fig. 1 Relationship of plate height (H) and the linear velocity of mobile phase (u)and (b) Horvath and Lin’s curve

從公式17最后一項(xiàng)可以看出,徑向擴(kuò)散項(xiàng)與柱內(nèi)徑r0密切相關(guān),在高流動(dòng)相線速度的情況下,采用細(xì)粒徑的擔(dān)體與細(xì)內(nèi)徑的色譜柱相配才會(huì)實(shí)現(xiàn)高效。這也就是隨著時(shí)代的發(fā)展,分析型色譜柱內(nèi)徑越來越細(xì)的原因。

(18)

圖2 毛細(xì)管內(nèi)半徑為(a)50 μm和(b)160 μm時(shí)流動(dòng)性線速度與塔板高度的關(guān)系[10]Fig. 2 Relationship between u and H with radius of (a) 50 μm and (b) 160 μm[10]

毛細(xì)管電色譜在柱兩端施加了較高電壓,電場(chǎng)強(qiáng)度E值較高,往往可達(dá)1 000 V/cm,因此K值較大,流動(dòng)相在柱內(nèi)發(fā)熱嚴(yán)重,導(dǎo)致毛細(xì)管電色譜只能使用內(nèi)徑較細(xì)的色譜柱才能實(shí)現(xiàn)高效。研究人員對(duì)電色譜塔板高度方程進(jìn)行了考察(見圖2)[10]。實(shí)驗(yàn)采用P/ACE5010電泳儀和Trisep-2000GV毛細(xì)管三用電泳儀,流動(dòng)相5 mmol/L磷酸水溶液(pH 9)-乙腈(20∶80, v/v),恒溫箱溫度20 ℃,自制整體柱[11,12]柱長(zhǎng)30 cm,填充長(zhǎng)度21 cm,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。實(shí)驗(yàn)采用50 μm與160 μm內(nèi)徑的色譜柱進(jìn)行比較,在相同條件下,發(fā)現(xiàn)柱效與毛細(xì)管內(nèi)徑密切相關(guān)。柱內(nèi)徑增大熱效應(yīng)明顯增加,導(dǎo)致柱效急劇下降,結(jié)論與理論相符。

以綠原酸為試樣,色譜柱采用ODS帶金屬螺帽塑料柱(35 mm×3.5 mm, 5 μm),以0.3%(v/v)甲醇水溶液-乙腈(92∶8, v/v)為流動(dòng)相,施加不同消滯留層電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)柱塔板高度見圖3。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度E=0時(shí),相當(dāng)于HPLC由于存在吸附劑顆粒表面滯留層對(duì)傳質(zhì)的影響,塔板數(shù)較低,總塔板數(shù)為1 552(塔板高度23 μm)。在柱兩端施加消滯留層電壓后,由于擔(dān)體表面電滲流的形成,滯留層消失,公式17中滯留層項(xiàng)的貢獻(xiàn)也隨之消失。當(dāng)E<10 V/cm時(shí),柱溫提高不很明顯,可以看到消滯留層的效果,最高塔板數(shù)達(dá)到1 795(塔板高度19.5 μm)。繼續(xù)升高消滯留電場(chǎng)強(qiáng)度(E>25 V/cm),電場(chǎng)的熱效應(yīng)對(duì)塔板高度的影響則有所體現(xiàn),柱效開始下降。繼續(xù)升高電壓塔板高度非線性急劇上升。因此,進(jìn)一步提高電壓會(huì)使柱效降低,以至柱效率崩潰。

圖3 消滯留層電場(chǎng)強(qiáng)度與塔板高度的關(guān)系Fig. 3 Relationships of eliminate stagnant fluid layer electric field strength and plate height

圖4是分析同一樣品時(shí)色譜柱施加消滯留層電壓與不施加消滯留層電壓的電譜圖?？梢钥闯?施加消滯留層的電壓后，目標(biāo)物峰形變狹窄,柱效增加。

圖4 施加消滯留層電壓后峰形寬度的變化Fig. 4 Variation of peak shape width after application of residual layer voltageSample: combretastatin A4 phosphate (CA4P).

4 結(jié)論

填充柱色譜過程動(dòng)力學(xué)研究了幾十年,但研究工作者往往把色譜柱作為一維空間考慮,注意力集中在物質(zhì)輸運(yùn)過程中縱向擴(kuò)散對(duì)柱效率的影響,而沒有認(rèn)識(shí)到物質(zhì)在柱內(nèi)徑向擴(kuò)散對(duì)塔板高度的貢獻(xiàn)。實(shí)際上在色譜過程中,物質(zhì)的輸運(yùn)是在三維空間進(jìn)行的。組分在柱內(nèi)的輸運(yùn)過程中,不但會(huì)在縱向(z軸)擴(kuò)散,而且會(huì)沿徑向(x、y軸)擴(kuò)散。徑向擴(kuò)散使得不同的分子有不同的行進(jìn)路線。此外由于溫度場(chǎng)的影響,流動(dòng)相線速度在柱斷面分布的差異,最終導(dǎo)致色譜峰形的擴(kuò)張。

本文從熱傳導(dǎo)方程出發(fā)，在Horvath和Lin公式的基礎(chǔ)上推導(dǎo)了包含徑向擴(kuò)散因素及溫度場(chǎng)在內(nèi)的液相色譜塔板高度統(tǒng)一方程。此方程概括了HPLC、UPLC、CEC、ESFLC色譜過程動(dòng)力學(xué)中各種因素對(duì)塔板高度的影響。從上述公式可見,色譜過程中發(fā)生的徑向擴(kuò)散和色譜柱的發(fā)熱也是影響色譜分離效能的重要因素。液相色譜的H/u曲線并非過去認(rèn)為的V型線而是U型線;過高的流動(dòng)相線速度將導(dǎo)致柱效率崩潰;尤其是高流速、高壓情況下柱效與柱內(nèi)徑密切相關(guān)。

(19)

毛細(xì)管氣相色譜的Golay方程已經(jīng)考慮了流動(dòng)相流型對(duì)縱向擴(kuò)散的影響[6],故不再贅述。