利用在線加壓溶劑提取-超高效液相色譜-離子肼-飛行時間-質(zhì)譜法直接分析中藥草蓯蓉的化學(xué)成分組

李 婷, 許 霞, 常安琪, 劉文靜, 宋青青*, 宋月林,2*, 屠鵬飛

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥現(xiàn)代研究中心, 北京 100029;2. 中藥品質(zhì)評價北京市重點實驗室, 北京 100029)

草蓯蓉又名不老草,為列當(dāng)科草蓯蓉屬一年寄生草本植物BoschniakiarossicaFedtschetFlerov的干燥全草,多寄生于樺木科赤楊屬植物Alnus的根上[1]。草蓯蓉全草入藥,味甘、咸,性溫,具補腎壯陽、潤腸通便等功效,主治腎虛陽痿、腰膝冷痛、腸燥便秘等證[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明,草蓯蓉總提物及其有效部位具有保肝、抗炎、抗腫瘤、抗氧化及清除自由基、提高免疫及增強記憶力等多種藥理作用[3-9]。目前,前人已從草蓯蓉屬植物中分離并鑒定了120余個化合物,主要為苯丙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、三萜類、單萜類、生物堿類、甾體等[2,10]。然而,草蓯蓉的化學(xué)成分組尚未被深入闡明。鑒于中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點,全面表征中藥化學(xué)成分組,解析中藥的復(fù)雜化學(xué)物質(zhì)組,是闡明中藥藥效物質(zhì)的基礎(chǔ)環(huán)節(jié),更是保障中藥質(zhì)量以及臨床安全有效的關(guān)鍵。因此,本文通過建立快速、可靠的分析方法,對草蓯蓉化學(xué)成分組進行表征,以期為草蓯蓉的質(zhì)量控制以及深度利用開發(fā)提供有效信息。

傳統(tǒng)的中藥提取技術(shù)主要有回流法、浸入法、超聲波提取法和索氏提取法等,然而,這些提取方法需要消耗大量的樣品和有機試劑,且提取過程中不穩(wěn)定化合物在有機試劑和光照下易發(fā)生降解或異構(gòu)化[11]。本課題組[12-14]前期成功構(gòu)建了在線加壓溶劑提取模塊(online PLE):將微量樣品置于預(yù)柱套的柱芯中,以水作為提取溶劑,通過柱溫箱提供高溫以及高效液相色譜系統(tǒng)加壓的方式,實現(xiàn)了樣品的高效提取。該方法能夠減少有機溶劑和樣品的使用量,縮短提取時間,踐行了“綠色分析化學(xué)”的理念[15-17]。高分辨質(zhì)譜儀如IT-TOF-MS、Q-TOF-MS、LTQ-Orbitrap-MS等擁有分辨率高的特點,其與液相色譜系統(tǒng)聯(lián)用已被廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分表征研究。本研究通過在線加壓溶劑提取模塊在線耦連超高效液相色譜-離子肼-飛行時間質(zhì)譜(online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS),快速、直接表征草蓯蓉的化學(xué)成分組。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

島津UHPLC-IT-TOF-MS液質(zhì)聯(lián)用儀(包括2臺LC-20ADXR泵、SIL-20AC自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A紫外檢測器、DGU-20A脫氣機、CBM-20A控制器、IT-TOF MS質(zhì)譜儀,日本島津公司), Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)(美國Millipore公司); Mettler ME204型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司),超聲波清洗器(南京壘君達超聲電子設(shè)備有限公司), Phenomenex cartridge柱芯(3.0 mm×4.0 mm,貨號:AJ0-4287,飛諾美公司)去除C18填料,Phenomenex Security GuardTM預(yù)柱套(貨號:KJ0-4282,飛諾美公司)。

肉蓯蓉苷A(CAS No. 93236-42-1,純度98%)和毛蕊花糖苷(CAS No. 61276-17-3,純度98%)均購自上海源葉生物科技有限公司。色譜級和質(zhì)譜級甲醇、乙腈以及質(zhì)譜級甲酸均購自美國Thermo Fisher公司,水為實驗室自制,其余試劑均為分析純。

草蓯蓉藥材于2018年9月采自黑龍江省大興安嶺區(qū),經(jīng)北京大學(xué)屠鵬飛教授鑒定為列當(dāng)科植物草蓯蓉BoschniakiarossicaFedtschetFlerov的干燥全草。標(biāo)本存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥現(xiàn)代研究中心。

1.2 online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS條件

1.2.1提取

草蓯蓉藥材在40 ℃烘箱中干燥3天,粉碎,過24目篩。精密稱取0.5 mg草蓯蓉粉末,置于空預(yù)柱芯內(nèi),并稱取15 mg正相硅膠填充預(yù)柱芯,之后兩端用濾膜密封,構(gòu)成在線提取池(vessel)。將其裝入適配的預(yù)柱套,放入70 ℃柱溫箱中。提取溶劑為0.1%(v/v)甲酸水(流動相A),流速為0.2 mL/min,提取時間為3 min。提取液通過一根650 mm的金屬管線(0.13 mm i. d.)引入色譜柱,該管線置于柱溫箱外以確保提取液溫度快速降至室溫。online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)提取過程示意圖如圖1a所示,整個提取過程通過進樣2 μL 0.1%(v/v)甲酸水自動觸發(fā)。在提取階段,六通閥處于6-1位連接,流動相A作為提取溶劑在高溫高壓條件下直接提取樣品,各化學(xué)成分(主要為中、小極性化合物)富集于反相色譜柱前端。

圖1 在線加壓提取-超高效液相色譜-離子肼-飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)示意圖Fig. 1 Schematic diagrams of the online pressurized liquid extraction-ultrahigh-performance liquid chromatography-ion trap-time of flight mass spectrometry (online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS) system a. extraction; b. elution.

1.2.2液相色譜條件

Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國Waters公司)置于室溫下,流速0.2 mL/min, PDA檢測波長254 nm。流動相A為0.1%(v/v)甲酸水,流動相B為0.1%(v/v)甲酸乙腈。梯度洗脫程序:0～3 min, 0%B; 3～6 min, 0%B～4%B; 6～9 min, 4%B; 9～10 min, 4%B～18%B; 10～40 min, 18%B～35%B; 40～45 min, 35%B～55%B; 45～45.1 min, 55%B～0%B; 45.1～55 min, 0%B。在提取3 min后,online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)流路示意圖見圖1b。六通閥切換至1-2位連接,提取池未接入整個流路,流動相直接泵入色譜柱,將色譜柱前端富集的化學(xué)成分梯度洗脫。

1.2.3質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,掃描模式:負(fù)離子模式并自動觸發(fā)多級質(zhì)譜。MS1的掃描范圍為m/z100～1 000; MS2的掃描范圍為m/z50～1 000,碰撞誘導(dǎo)解離(CID)能量為70%; MS3的掃描范圍為m/z50～800,碰撞誘導(dǎo)解離(CID)能量為60%。噴霧室電壓為-3.5 kV;霧化氣(N2)流量為1.5 L/min;干燥氣體壓力為100 MPa;檢測電壓為1.6 kV;曲型脫溶劑管(CDL)和加熱模塊溫度均為200 ℃。碰撞室壓力為2.0×10-4Pa;離子肼壓力為3.0×10-2Pa;各級質(zhì)譜的重復(fù)次數(shù)為3,離子累積時間為10 ms。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備與分析

精密稱取適量肉蓯蓉苷A和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品,分別溶于甲醇中,配成10 mmol/L的儲備液。精密吸取各儲備液適量,用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋100倍,制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。預(yù)柱芯用正相硅膠填充,其余項同1.2節(jié),自動進樣器吸取2 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行分析。

1.4 超聲提取與分析

1.4.1供試品溶液的制備

取1 g草蓯蓉粉末,加入10 mL 50%(v/v)甲醇水溶液,超聲30 min,以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液,經(jīng)0.25 μm微孔濾膜過濾后,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.4.2液相條件

實驗裝置與圖1b一致。色譜柱、流動相及流速同1.2.2節(jié)。梯度洗脫程序:0～3 min, 0%B～4%B; 3～6 min, 4%B; 6～7 min, 4%B～18%B; 7～37 min, 18%B～35%B; 37～42 min, 35%B～55%B; 42～42.1 min, 55%B～4%B; 42.1～52 min, 0%B。進樣體積5 μL,柱溫為室溫,PDA檢測波長254 nm。質(zhì)譜條件同1.2.3節(jié)。

2 結(jié)果與討論

2.1 在線加壓溶劑提取條件的優(yōu)化

在本課題組前期建立的在線加壓溶劑提取模塊的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化。首先對色譜柱進行了考察,最終選擇Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱,并以乙腈-水系統(tǒng)作為流動相,提高色譜峰分離度。進一步優(yōu)化了流動相中甲酸體積分?jǐn)?shù)(0%、0.05%、0.1%甲酸水,以及0%、0.05%、0.1%甲酸乙腈)、金屬管線長度(550、650、750、850和1 000 mm)、提取溫度(50、60和70 ℃)、提取時間(2、3和4 min)和提取流速(0.15、0.2和0.3 mL/min)。基于色譜峰形和整體響應(yīng)的考慮,最終選擇0.1%甲酸為流動相A和B的添加劑。而管線長度、提取溫度、提取時間和提取流速的優(yōu)化值分別為650 mm、70 ℃、3 min和0.2 mL/min。在提取過程中,金屬管線和T3色譜柱為提取池提供約25 MPa壓力,實現(xiàn)了高溫、高壓提取。管線長度增長時系統(tǒng)壓力無明顯變化,為了將提取液降至室溫,最終選擇的金屬管線長度為650 mm。實驗發(fā)現(xiàn),提取時間和流速的增加并沒有增大峰的容量和響應(yīng),而0.2 mL/min、3 min即可實現(xiàn)與超聲提取方法相似的提取效率,達到較完全的提取。絕大部分中、小極性化合物在提取過程中富集在色譜柱柱頭,在洗脫過程開始后才出峰,因此3 min提取時間并不會對色譜分離產(chǎn)生顯著影響。

圖2 負(fù)離子模式下草蓯蓉的基峰色譜圖Fig. 2 Base peak chromatograms of Boschniakia rossica in negative ion modea. pressurized liquid extraction; b. ultrasonic extraction.

2.2 在線加壓溶劑提取法與超聲提取法的比較

在對應(yīng)生藥量一致的情況下,對比草蓯蓉在線加壓溶劑提取的基峰色譜圖(見圖2a)和超聲提取的基峰色譜圖(見圖2b),發(fā)現(xiàn)二者譜圖輪廓基本一致。此外,對不同保留時間范圍內(nèi)的主要色譜峰(2、3、4、6、8、9、14、17、21、22、23、35、37、38、42、43、44、45、46、47和48)進行指認(rèn),兩者化學(xué)成分組信息基本相同。加壓溶劑提取的色譜峰整體響應(yīng)值高于超聲提取。在線加壓溶劑提取法所需的樣品量少,提取時間短,提取效率高,可用于草蓯蓉化學(xué)成分組的直接、快速分析。并且,以水作為提取溶劑,符合“綠色分析化學(xué)”的理念。

2.3 草蓯蓉化學(xué)成分組的表征

利用建立的online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS采集中藥草蓯蓉在負(fù)離子模式下的MS1、MS2和MS3質(zhì)譜信息,其中MS1基峰色譜圖(BPC)如圖2a所示。從草蓯蓉中檢測到48個化合物(見表1),初步鑒定了其中的45個化學(xué)成分,包括10個苯乙醇苷類(phenylethanoid glycosides, PheGs)、14個環(huán)烯醚萜苷類(iridoids)以及21個苯丙醇苷類(phenylpropanoid glycosides, PhpGs)化合物。通過對照品指認(rèn)2個化合物(21和30);通過文獻比對[2,10,18-29]、ChemSpider和Pubmed等數(shù)據(jù)庫以及質(zhì)譜裂解規(guī)律推導(dǎo),初步鑒定了43個化合物;其余3個化合物(46、47和48)由于質(zhì)譜信息和參考文獻不足,暫無法準(zhǔn)確鑒定其結(jié)構(gòu)。

2.4 各類化合物鑒定及質(zhì)譜裂解規(guī)律的推導(dǎo)

2.4.1苯乙醇苷類的質(zhì)譜裂解規(guī)律及結(jié)構(gòu)鑒定

從草蓯蓉中共鑒定10個苯乙醇苷類化合物(見表1),其中2個通過對照品指認(rèn)(21和30), 5個是前人已從草蓯蓉中分離得到的(15、16、28、32和34), 3個根據(jù)裂解規(guī)律及特征碎片推導(dǎo)(3、31和43)。以化合物28(保留時間tR=18.582 min)為例,闡述苯乙醇苷類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律及其結(jié)構(gòu)鑒定過程。在負(fù)離子模式下,化合物28準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z785.248 4(C35H46O20,誤差-3.31×106,即-3.31 ppm)。在MS2圖譜(見圖3a)中的主要碎片為m/z623.210 3 [M-H-C9H6O3]-和m/z461.161 7 [M-H-C9H6O3-C6H10O5]-,提示該化合物會連續(xù)失去咖啡?；?162.03 Da)和葡萄糖殘基(162.05 Da)。MS3圖譜(見圖3b)中的是由m/z623.210 3產(chǎn)生的碎片m/z461.167 5、443.155 5和315.104 5,說明m/z623.210 3失去葡萄糖殘基(162.05Da)生成m/z461.161 7,進一步發(fā)生糖苷鍵斷裂失去鼠李糖殘基(146.05 Da)生成m/z315.104 5。該化合物的預(yù)測分子式和碎片信息均與草蓯蓉苷A一致[18],故推測該化合物為草蓯蓉苷A,其主要裂解途徑如圖3c所示。

由表1數(shù)據(jù)結(jié)合文獻報道[11],在負(fù)離子模式下,苯乙醇苷類化合物易產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-或加合離子峰[M-HCOO]-,進而通過糖苷鍵斷裂丟失葡萄糖基殘基(162.05 Da)或鼠李糖殘基(146.05 Da),以及酯鍵斷裂丟失咖啡?；?162.03 Da),也常發(fā)生中性丟失水分子(18.00 Da)。

2.4.2環(huán)烯醚萜苷類的質(zhì)譜裂解規(guī)律

從草蓯蓉中共鑒定14個環(huán)烯醚萜苷類化合物,其中5個是前人已從草蓯蓉中分離得到的(22、23、24、26和27),其余9個通過特征碎片和質(zhì)譜裂解規(guī)律推導(dǎo)(1、2、4、14、17、18、20、25和29)。以化合物23(tR=16.932 min)為例,闡述該類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律及解析過程。負(fù)離子模式下,其準(zhǔn)分子離子峰m/z359.134 5 [M-H]-(預(yù)測分子式C16H24O9,誤差0.28 ppm); MS2圖譜(見圖4a)中的主要碎片離子為m/z197.084 6 [M-H-C6H10O5]-、153.094 4 [M-H-C6H10O5-CO2]-、135.083 1 [M-H-C6H10O5-CO2-H2O]-,分別由母離子連續(xù)失去162.05 Da(C6H10O5)、44.00 Da(CO2)、18.00 Da(H2O)而得,推測其結(jié)構(gòu)中含有葡萄糖、羧基和羥基。對比發(fā)現(xiàn),化合物23的預(yù)測分子式和碎片信息均與7-deoxy-8-epiloganic acid相符[22],可能的裂解途徑如圖4b所示。

圖3 草蓯蓉苷A的質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑Fig. 3 Mass spectrum and proposed mass fragmentation pathways of rossicaside A a. MS2 spectrum; b. MS3 spectrum; c mass fragmentation pathways.

由表1數(shù)據(jù)結(jié)合文獻數(shù)據(jù)[11],負(fù)離子模式下,環(huán)烯醚萜苷類化合物易產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-或加合離子峰[M-HCOO]-,進而發(fā)生糖苷鍵斷裂丟失葡萄糖殘基(162.05 Da),環(huán)烯醚萜母核上如有羧基取代會丟失CO2(44.00 Da)。

2.4.3苯丙醇苷類的質(zhì)譜裂解規(guī)律

圖5 草蓯蓉苷B的質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑Fig. 5 Mass spectrum and proposed mass fragmentation pathways of rossicaside Ba. MS2 spectrum; b. MS3 spectrum; c. the proposed mass fragmentation pathways.

從草蓯蓉中共鑒定21個苯丙醇苷類化合物,其中14個是前人已從草蓯蓉中分離得到的(6、9、10、11、12、33、35、36、37、38、39、40、41和42), 7個(5、7、8、13、19、44、和45)根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律及特征碎片推導(dǎo)。以化合物37(tR=24.368 min,見圖5)為例,闡述其解析過程以及苯丙醇苷類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律。在負(fù)離子模式下,準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z781.256 1(預(yù)測分子式C36H46O19,誤差0 ppm)。在MS2圖譜中(見圖5a)的主要碎片為m/z649.199 9 [M-H-C9H8O]-、505.161 2 [M-H-C9H8O-C6H10O5+H2O]-、487.141 7 [M-H-C9H8O-C6H10O5]-和323.093 3 [M-H-C9H8O-C6H10O5-C6H10O4-H2O]-,提示該化合物會連續(xù)失去132.05 Da(C9H8O)、162.05 Da(C6H10O5)、146.05 Da(C6H10O4)和18.00 Da(H2O),推測其結(jié)構(gòu)中含有對羥基苯丙烯醇、葡萄糖、鼠李糖和羥基等結(jié)構(gòu)片段。MS3圖譜中(見圖5b)是由m/z649.199 9產(chǎn)生的碎片m/z505.161 2、487.141 7、323.093 3和305.063 6,推測m/z305.063 6為m/z323.093 3丟失18.00 Da(H2O)產(chǎn)生。推斷其主要裂解途徑如圖5c所示。比對文獻[19],該化合物的預(yù)測分子式和碎片信息與草蓯蓉苷B和I一致。但草蓯蓉苷B和I為同分異構(gòu)體,兩者區(qū)別僅是肉桂?；〈恢貌煌２萆惾剀誃結(jié)構(gòu)中,咖啡?；挥谂c苷元相連的第一個葡萄糖的4位羥基,而草蓯蓉苷I則取代于相同糖基的6位羥基,無法通過IT-TOF-MS區(qū)分二者。

由表1數(shù)據(jù)結(jié)合文獻報道[2],負(fù)離子模式下,苯丙醇苷類易產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-,主要裂解途徑包括醚鍵斷裂丟失苯丙醇苷元對羥基苯丙烯醇(132.05 Da)、糖苷鍵斷裂丟失葡萄糖殘基(162.05 Da)或鼠李糖殘基(146.05 Da)以及酯鍵斷裂丟失?；?主要為咖啡?；?62.03 Da)。

3 結(jié)論

相比傳統(tǒng)中藥樣品的提取方法,本文所構(gòu)建的在線加壓溶劑提取法所需樣品及溶劑少、提取時間短、效率高,不僅能夠直接與高效液相色譜串聯(lián),實現(xiàn)直接快速分析,同時也避免了不穩(wěn)定化合物在提取過程中發(fā)生降解的可能性,提高了化學(xué)成分分析的準(zhǔn)確性。本文同時利用高分辨質(zhì)譜采集了多級準(zhǔn)確質(zhì)譜信息,總結(jié)了草蓯蓉中苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷類和苯丙醇苷類等化學(xué)類型的質(zhì)譜裂解規(guī)律。進而,利用online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)從草蓯蓉中檢測到48個化合物,初步鑒定45個化合物,包括10個苯乙醇苷類、14個環(huán)烯醚萜苷類以及21個苯丙醇苷類化合物,實現(xiàn)了草蓯蓉化學(xué)成分的快速、直接分析,為草蓯蓉化學(xué)成分、質(zhì)量評價以及藥效物質(zhì)研究提供可靠的方法和有效數(shù)據(jù),也為其他中藥的快速、直接化學(xué)成分分析提供了可行的方案。