分散液液微萃取技術(shù)及其在生物樣品分析中的研究進(jìn)展

施藝瑋, 張 寧, 操 雯, 洪戰(zhàn)英

(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室, 上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200433)

分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)是一種新型樣品前處理技術(shù),Rezaee等[1]于2006年首次提出分散液液微萃取的概念并將其應(yīng)用于測(cè)定水中有機(jī)組分的含量,DLLME技術(shù)僅使用極少量有機(jī)溶劑即可完成萃取、富集過程。DLLME技術(shù)由于其低成本、低污染、高富集等優(yōu)點(diǎn),近年來受到廣泛關(guān)注,新型萃取劑不斷涌現(xiàn),各種輔助分散模式使萃取效率明顯提高,由此衍生出DLLME的多種模式,并已應(yīng)用于生物、藥物分析[2]、環(huán)境污染[3,4]、食品安全[5]等多個(gè)領(lǐng)域。本文擬對(duì)DLLME技術(shù)的多種模式及其近5年在生物樣品分析領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 DLLME的不同模式

根據(jù)萃取劑的性質(zhì),DLLME可分為常規(guī)分散液液微萃取(normal DLLME,n-DLLME)、離子液體分散液液微萃取(ionic liquid DLLME, IL-DLLME)、低密度溶劑分散液液微萃取(low-density solvent DLLME, LDS-DLLME)和懸浮固化分散液液微萃取(DLLME based on solidification of floating organic droplet, DLLME-SFOD)。根據(jù)輔助分散方法,DLLME還可分為超聲輔助分散液液微萃取(ultrasound-assisted DLLME, UA-DLLME)、空氣輔助分散液液微萃取(air-assisted DLLME, AA-DLLME)，以及渦旋輔助分散液液微萃取(vortex-assisted DLLME, VA-DLLME)等。DLLME的分類見圖1。

圖1 分散液液微萃取的分類及其在生物樣品中的應(yīng)用Fig. 1 Classification of DLLME and application to biological samples n-DLLME: normal dispersive liquid-liquid microextraction; IL-DLLME: ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction; DLLME-SFOD: dispersive liquid-liquid microextraction based on solidification of floating organic droplet; LDS-DLLME: low density solvent dispersive liquid-liquid microextraction; UA-DLLME: ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction; VA-DLLME: vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction; AA-DLLME: air-assisted dispersive liquid-liquid microextraction.

1.1 常規(guī)分散液液微萃取

n-DLLME是將與水不相混溶的萃取劑及能與水、萃取劑互溶的分散劑混合后注入樣品溶液中,萃取劑在分散劑的作用下快速分散在樣品中對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行萃取,離心得萃取相,用微量注射器轉(zhuǎn)移后進(jìn)行處理或直接分析[6],具體流程見圖2a。n-DLLME常用的萃取劑有氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烷等,分散劑有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、異丙醇等,其中萃取劑和分散劑的種類與體積對(duì)目標(biāo)化合物的萃取和富集均有較大影響。Alcantara等[7]建立了n-DLLME與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)檢測(cè)人血漿中左乙拉西坦,分別考察了氯仿、二氯甲烷、四氯甲烷作為萃取劑時(shí)對(duì)左乙拉西坦富集因子的影響,最終選擇富集結(jié)果較好的氯仿作為萃取劑,并考察了使用不同體積(50、90、130、170 μL)的氯仿對(duì)萃取效果的影響,選擇最佳體積為130 μL,左乙拉西坦的LOD為2 μg/mL。Chen等[8]測(cè)定人尿液和血清中免疫抑制類藥物環(huán)孢菌素、依維莫司等,考察了甲醇、乙腈、丙酮作為分散劑的效果,最終選擇富集結(jié)果較好的丙酮作為分散劑,并考察了不同體積(200～260 μL)丙酮對(duì)萃取效果的影響,最終選擇200 μL丙酮,環(huán)孢菌素、依維莫司等富集因子在101～122之間,血清中的LOD為6～29 nmol/L,尿液中的LOD為9～60 nmol/L。研究發(fā)現(xiàn)隨著分散劑體積增加萃取效率逐漸提高,但超過最佳體積后萃取效率明顯降低,主要原因?yàn)榉稚w積增大導(dǎo)致萃取劑在樣品中的溶解度增加,降低萃取效率。

此外,溶液pH值、鹽濃度對(duì)n-DLLME的萃取效率也有較大影響,調(diào)節(jié)溶液pH值可以使目標(biāo)化合物形成非離子型而提高萃取效率,但是pH值過高可能導(dǎo)致部分待測(cè)物的降解;鹽的加入可通過鹽析作用提高富集效率,而鹽濃度過高會(huì)產(chǎn)生鹽溶作用導(dǎo)致富集效率下降。Gupta等[9]測(cè)定人尿液中多環(huán)芳烴類化合物(PAH)代謝物,采用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值,考察了不同pH值(2、4、6、8、10、12)下PAH的萃取效率,結(jié)果顯示pH為6時(shí)萃取效率最高,并考察了鹽的含量(0%～10%, w/v)對(duì)PAH富集因子的影響,結(jié)果顯示富集程度在鹽的含量為6%時(shí)最高,鹽的含量偏高或偏低時(shí)富集效果都有所降低。由于萃取過程極短,其余影響因素(例如萃取時(shí)間和萃取溫度等)對(duì)實(shí)驗(yàn)并沒有較大的影響。

n-DLLME的萃取效率相對(duì)于其他萃取技術(shù)而言有所提高,但其本身存在一定的局限性,主要是萃取劑揮發(fā)性高且毒性較大、人工振蕩效率較低、重現(xiàn)性較低等。

圖2 (a)n-DLLME、(b)DLLME-SFOD和(c)AA-DLLME萃取過程示意圖Fig. 2 Diagrams of the extraction processes of (a) n-DLLME, (b) DLLME-SFOD and (c) AA-DLLME

1.2 新型萃取劑DLLME

1.2.1離子液體分散液液微萃取

離子液體(ILs)是由陰離子和陽離子組成,在常溫下呈液態(tài),通過改變有機(jī)配體可調(diào)控ILs的極性,從而選擇性萃取不同極性的化合物,ILs對(duì)無機(jī)物和有機(jī)物均有較好的溶解能力且穩(wěn)定性好。n-DLLME中所用到的萃取劑大多為有毒有害的有機(jī)物,不利于實(shí)驗(yàn)操作人員的健康和環(huán)境,離子液體揮發(fā)性較低且毒性較小,近年來在微萃取領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多,是理想的綠色溶劑。離子液體既可以作為萃取劑,也可以作為分散劑,可減少有機(jī)溶劑的使用。常用的離子液體萃取劑有1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C4MIM][PF6])、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C6MIM][PF6])和1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C8MIM][PF6])[10]等。

Gong等[10]采用IL-DLLME結(jié)合高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)測(cè)定小鼠血清中達(dá)那唑,對(duì)萃取劑離子液體的種類和體積、pH、鹽濃度以及萃取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,考察了[C4MIM][PF6]、[C6MIM][PF6]、[C8MIM][PF6] 3種離子液體分別作為萃取劑的萃取效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者中疏水性最強(qiáng)的[C8MIM][PF6]萃取結(jié)果最好,因此選擇[C8MIM][PF6]作為萃取劑;在血清樣品中加入30 μL[C8MIM][PF6], 100 μL 2 mol/L NH3-NH4Cl緩沖溶液(pH=8), 50 μL 1 mol/L NaCl溶液,將混合溶液在兩個(gè)頭部相連的注射器中來回注射7次,樣品經(jīng)離心處理后,取底部萃取相進(jìn)樣分析,該方法得到了較好的萃取效果,達(dá)那唑的LOD為0.054 μg/mL,提取回收率為90.5%～103.4%。Arain等[11]測(cè)定了人血清中銅的含量,首先加入500 μL 5×10-2mol/L金屬離子螯合劑羥基喹啉與銅離子發(fā)生螯合作用,調(diào)節(jié)pH至7.0,加入1 000 μL萃取劑(100 μL [C4MIM][PF6]與200 μL TX-100混合后5 mL水稀釋),離心后分離萃取相加入50 μL 1%Triton X-114, 55 ℃恒溫水浴2～5 min,離心得到底部黏稠的萃取相,除去上層液體,用0.5 mL酸性乙醇(含0.1 mol/L HNO3)稀釋萃取相后采用火焰原子吸收光譜儀(flame atomic absorption spectrophotometer, FAAS)分析,結(jié)果顯示銅離子的LOD為0.132 μg/L,富集因子為70。

IL-DLLME的優(yōu)點(diǎn)在于此法中萃取劑離子液體為綠色溶劑,減少環(huán)境污染。但也存在不足,如合成離子液體的成本高、離子液體的低揮發(fā)性導(dǎo)致其不適用于氣相色譜等[12]。

1.2.2低密度溶劑分散液液微萃取

n-DLLME和IL-DLLME中所用萃取劑密度均大于水,離心后萃取相在溶液底部,且萃取相體積較小導(dǎo)致相分離困難,LDS-DLLME采用密度低于水且低毒的萃取劑辛醇、甲苯等,離心后萃取相漂浮于樣品上層易分離,操作方法如下:將萃取劑及分散劑的混合溶液注入樣品溶液中,將樣品離心處理后,由于萃取劑密度小于水,萃取相漂浮于液體上層,進(jìn)樣器定量吸出后直接或經(jīng)處理后進(jìn)行分析。

Mollahosseini等[13]采用毒性小且符合色譜條件的1-辛醇作為萃取劑并結(jié)合RP-HPLC測(cè)定人血清中25-羥基膽鈣化醇,分散劑選擇650 μL甲醇,萃取時(shí)間為1 min, 25-羥基膽鈣化醇的富集因子為180,提取回收率為85%～97%,該方法中萃取相分離簡(jiǎn)便,雜質(zhì)干擾低。Barfi等[14]采用LDS-DLLME法萃取人尿液中水楊酸,雙氯芬酸和布洛芬,分別考察了正辛醇、正己醇、甲苯、正庚烷、正己烷5種低密度萃取劑的萃取效果,正己烷和正辛醇的提取效率遠(yuǎn)大于其余3種萃取劑,最終選擇具有較好色譜行為的正辛醇作為萃取劑,萃取劑體積為55 μL,分散劑選擇350 μL丙酮,水楊酸、雙氯芬酸和布洛芬的提取回收率為56%～65%,富集因子為51～59,萃取效果較好。

LDS-DLLME的優(yōu)點(diǎn)在于此法中萃取劑的毒性較低且大多數(shù)適用于色譜分析,萃取相處于樣品上層易于分離,可避免常規(guī)模式中由于萃取有機(jī)相體積過小,導(dǎo)致采集萃取相過程中會(huì)混入少量水樣而可能縮短氣相色譜儀器使用壽命[15]的情況發(fā)生。

1.2.3懸浮固化分散液液微萃取

n-DLLME中所用到的萃取劑大多為沸點(diǎn)較低的有機(jī)物,有機(jī)物揮發(fā)對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)操作人員的健康具有不利影響,DLLME-SFOD采用熔點(diǎn)略低于室溫(10～25 ℃)的萃取劑,如正十一醇、十二醇等,密度低于水且毒性較小。操作方法如下:將萃取劑及分散劑混合后注入樣品溶液中,將樣品離心后低溫處理,樣品上層漂浮著凝固的萃取相,取出后經(jīng)處理進(jìn)行分析,具體流程見圖2b。

Shirinnejad等[16]采用DLLME-SFOD對(duì)血漿樣品中的萘普生進(jìn)行提取和預(yù)富集,在最佳條件下(120 μL十一烷醇與1 mL乙醇分別作為萃取劑和分散劑,pH=3.5, 2 mL 10%(w/v)KCl鹽溶液),在10.0～120.0 ng/mL范圍內(nèi)呈線性,萘普生的LOD為2.4 ng/mL。Iqbal等[17]采用n-DLLME聯(lián)合超聲輔助反萃取技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)法測(cè)定人尿中蘇沃雷生(suvorexant), 20 μL 1-十一烷醇和200 μL乙腈分別作為萃取劑和分散劑,經(jīng)過離心相分離、低溫相凝固過程,得到漂浮的凝固液滴,在超聲輔助反萃取下得到待測(cè)物,結(jié)果顯示,該方法在0.27～1 000 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性,蘇沃雷生檢出限和定量限分別為0.10 ng/mL和0.27 ng/mL。DLLME-SFOD過程中溫度控制對(duì)待測(cè)物的萃取效果具有較大的影響,升高溫度可以增加待測(cè)物與萃取劑接觸面積,提高萃取效率。Wu等[18]建立一種DLLME-SFOD快速高效萃取6種鄰苯二甲酸酯的方法。通過對(duì)影響萃取效率因素的優(yōu)化,選擇十二烷醇作為萃取劑,并考察萃取溫度對(duì)十二烷醇萃取效率的影響,結(jié)果顯示,萃取效率在溫度從30 ℃升高至60 ℃的過程中逐漸增長(zhǎng),當(dāng)萃取溫度超過60 ℃,萃取效率不再明顯增加,因此選擇60 ℃作為最佳萃取溫度。

DLLME-SFOD最大的優(yōu)點(diǎn)在于此法中萃取相的分離十分簡(jiǎn)便,但由于對(duì)萃取劑的物理性質(zhì)要求,萃取溶劑的選擇范圍較小,限制了該法的應(yīng)用[15];萃取過程中可以通過引入AA-DLLME, VA-DLLME和UA-DLLME等技術(shù)來減少分散劑的用量,并縮短分析時(shí)間和離心時(shí)間,但對(duì)富集因子和回收率影響不大[19]。

1.3 輔助分散DLLME

1.3.1超聲輔助分散液液微萃取

UA-DLLME模式中,超聲輔助使萃取劑與分散劑快速地分散在樣品中,形成乳狀小液滴,可代替n-DLLME中的人工振蕩,分散程度更高。Fernández等[20]用UA-DLLME法萃取人血漿中米氮平、文拉法辛、艾司西酞普蘭、氟伏沙明、氟西汀和舍曲林6種抗抑郁藥,采用200 μL氯仿作為萃取劑,2.5 mL乙腈作為分散劑,超聲3 min, pH調(diào)至9.8,萃取結(jié)果較好,提取回收率為95%～110%, LOD為4～5 ng/mL;與常用方法液相萃取(liquid-liquid extraction, LLE)相比,UA-DLLME所耗有機(jī)溶劑更少,準(zhǔn)確度、精密度以及LOD均較好。Malaei等[21]建立了UA-DLLME法聯(lián)合氣相色譜-火焰離子化檢測(cè)器法測(cè)定人血清中丙二醛,選擇80 μL 1,2-二溴乙烷作為萃取劑,5 mL乙腈作為分散劑,考察了超聲0～7 min對(duì)萃取效果的影響,在無超聲輔助下,萃取效率較低,超聲時(shí)間延長(zhǎng)至3 min,萃取效率明顯增加,3 min后無明顯改變,在超聲時(shí)間4 min、pH為4的條件下萃取效果最佳,丙二醛的富集因子為79.8,提取回收率為95.8%, LOD為0.75 ng/mL,該法相比前期實(shí)驗(yàn)所用LLE、固相萃取(solid-phase extraction, SPE)兩種方法,萃取效果好,富集因子明顯提高且使用有機(jī)溶劑量明顯減少。

UA-DLLME的優(yōu)點(diǎn)在于該方法采用超聲輔助萃取,提高了振蕩效率,加快萃取劑在樣品中分散,相對(duì)n-DLLME而言,萃取效率明顯提高。但也有文獻(xiàn)報(bào)道,超聲輔助乳化時(shí)間過久會(huì)導(dǎo)致待測(cè)物的分解,縮短乳化時(shí)間或者人工振搖可以避免分解[22]。UA-LDS-DLLME可減少分散劑的使用量,其通過超聲輔助的方法使萃取劑分散在樣品中,可以大大提高實(shí)驗(yàn)的環(huán)境友好性[23]。

1.3.2渦旋輔助分散液液微萃取

VA-DLLME是利用渦旋原理對(duì)樣品及萃取劑進(jìn)行混合,在渦旋條件下,萃取劑可以更加快速地分散在樣品中,渦旋有助于萃取劑形成小液滴,可以減少分散劑的用量[24]。VA-DLLME具有萃取時(shí)間短、環(huán)境污染小、成本較低等優(yōu)點(diǎn),但該法的萃取效率相較于n-DLLME并沒有明顯改善。

Zhang等[24]使用疏水性共晶溶劑作為萃取劑,VA-DLLME聯(lián)合HPLC富集,間接測(cè)定尿液和唾液中痕量亞硝酸鹽,該方法基于亞硝酸鹽與對(duì)硝基苯胺和二苯胺在酸性水中的重氮化偶聯(lián)反應(yīng),通過測(cè)定偶氮化合物間接定量亞硝酸鹽。萃取劑為150 mg三辛基甲基氯化銨-油酸(摩爾比為1∶2)油狀液體,混合溶液渦旋100 s,通過離心得到萃取相,結(jié)果顯示,該方法的線性范圍為1～300 μg/L, LOD為0.2 μg/L, LOQ為1 μg/L,在生物樣品中的提取回收率為90.5%～115.2%。Akramipour等[25]采用1-十一烷醇和離子液體1-辛基-3-甲基咪唑氯化物的混合溶劑萃取人尿液中各種存在形式的汞,將混合溶劑與樣品混合置于50 ℃的水浴中,加入350 mg NaCl破乳,渦旋3 min后離心,冰浴后得到樣品上層凝固的萃取相,其中渦旋步驟可以輔助萃取相與樣品充分接觸,提高破乳過程中目標(biāo)物質(zhì)的萃取效率,實(shí)驗(yàn)考察了不同渦旋時(shí)間(0～5 min)的萃取效果,發(fā)現(xiàn)0～3 min內(nèi),汞的萃取效果隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸變好,3 min后沒有明顯提高,最終選擇渦旋3 min,此時(shí)汞的富集因子為112, LOD為0.1 μg/L。

1.3.3空氣輔助分散液液微萃取

AA-DLLME是將樣品與萃取劑混合后通過注射器多次吸入、排出,形成均勻分散的狀態(tài),萃取后通過離心相分離,具體流程見圖2c。該法不需要分散劑,通過注射器多次吸入排出可達(dá)到分散的效果。Rocha等[26]采用AA-DLLME聯(lián)合LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定人尿液中7種雙酚類化合物、7種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物、5種二苯甲酮類化合物和2種抗菌藥,將5 mL尿液樣品用20%(w/v)NaCl水溶液稀釋至10 mL,萃取劑750 μL 1,2-二氯乙烷與樣品混合后采用玻璃注射器將混合液抽吸3次,使兩者充分混勻,形成均勻的乳狀液體,萃取時(shí)間為30 s,結(jié)果顯示LOD為0.01～0.30 ng/mL, LOQ為0.03～1.0 ng/mL,所有待測(cè)物在1.0～20.0 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,萃取時(shí)間短且萃取富集效果較好。

AA-DLLME的優(yōu)點(diǎn)在于此法采用空氣輔助萃取,代替了常規(guī)的人工振蕩,縮短了萃取時(shí)間,但是一些研究發(fā)現(xiàn),萃取效率并未明顯提高[27],目前空氣輔助液相微萃取結(jié)合新型萃取劑的方法提高了萃取效率。Ferrone等[19]建立了AA-DLLME-SFOD測(cè)定醫(yī)院獲得性肺炎患者血漿中抗生素美羅培南、甲硝唑等5種藥物的含量,采用30 μL 1-十二烷醇為萃取劑,經(jīng)過離心、冰浴,得到了凝固的萃取相,萃取時(shí)間不超過1 min, 5種藥物的富集因子為87～121, LOD為0.001～0.08 μg/mL,萃取效果較好且時(shí)間短。除此,共晶溶劑(deep eutectic solvent, DES)等作為萃取劑可與AA-DLLME聯(lián)用,共晶試劑具有環(huán)境友好、萃取效率高等優(yōu)點(diǎn)[28-30]。

2 分散液液微萃取在生物樣品中的應(yīng)用

生物樣品由于待測(cè)物含量低且內(nèi)源性物質(zhì)干擾多,使得其中的藥物定量檢測(cè)難度大,因此生物樣品的前處理至關(guān)重要。相對(duì)于常規(guī)萃取方法LLE、SPE等,DLLME利用少量的萃取劑與分散劑混合萃取,具有較好的富集效果,大大減少了有毒有害的有機(jī)溶劑用量,并且發(fā)展出不同模式的DLLME,在生物樣品前處理中的應(yīng)用越來越廣泛。以下將針對(duì)血液、尿液、唾液、臟器組織、頭發(fā)5種常見的生物樣品介紹DLLME在生物樣品中的應(yīng)用。

2.1 血液

血液是由血漿和血細(xì)胞組成的,血液中的藥物通常指血漿或血清中的藥物,藥物在血液中有兩種存在方式,一是以游離藥物形式存在,二是以蛋白結(jié)合藥物形式存在,目前大多是研究血漿內(nèi)藥物。Taheri等[31]采用DLLME-SFOD法萃取人血漿中的阿托伐他汀,萃取劑為30 μL 1-十一烷醇,分散劑為200 μL乙腈,將兩者混合液體迅速注入樣品中,形成均勻的小液滴,離心相分離,冰浴相凝固,分離萃取相待其在常溫下融化后進(jìn)樣分析。將此法應(yīng)用于一名服用阿托伐他汀的22歲男性的血樣分析,結(jié)果顯示,血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)影響較小,靈敏度較高。血液樣品中基質(zhì)干擾較多,為了提高萃取效率,可將多種萃取方法結(jié)合使用。Mashayekhi等[32]將SPE與DLLME聯(lián)合使用測(cè)定人血漿中苯二氮卓類藥物含量,實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了SPE、DLLME、SPE-DLLME 3種前處理方法,結(jié)果顯示SPE法的LOD為8.8～167 μg/L, DLLME法的LOD為0.3～0.7 μg/L, SPE-DLLME的LOD為0.07～0.7 μg/L,可觀察到不同的萃取方法聯(lián)合使用對(duì)實(shí)驗(yàn)靈敏度有極大的改善。

2.2 尿液

藥物代謝后主要是通過尿液排出體外,尿液中不僅含有被排泄的藥物,還有相關(guān)的藥物代謝產(chǎn)物,因此,尿樣常被用于測(cè)定藥物及其主要代謝產(chǎn)物,進(jìn)而研究藥物代謝速率與代謝途徑等。Zacharis等[33]建立了n-DLLME聯(lián)合液相色譜-柱后衍生化測(cè)定尿液樣品中抗病毒藥物金剛烷胺,800 μL乙腈和100 μL氯仿分別作為分散劑和萃取劑,對(duì)分析物進(jìn)行在線柱后衍生化處理,通過熒光光譜法測(cè)定衍生物含量,結(jié)果顯示,金剛烷胺富集因子為58, LOD為0.5 μg/L,加標(biāo)樣品回收率為87.5%～113.9%。Farahmand等[34]采用AA-DLLME-SFOD萃取結(jié)合紫外-可見光分光光度法測(cè)定尿樣中的阿替洛爾、卡維地洛和普萘洛爾,在樣品中迅速加入125 μL 1-十二烷醇和160 μL 1 000 mg/L Triton X-100水溶液,用注射器迅速吸入、排出此樣品混合液10次,經(jīng)過離心、冰浴,收集凝固的萃取相,放入400 μL 0.01 mol/L鹽酸溶液中進(jìn)行空氣輔助液液微萃取(air-assisted liquid-liquid microextraction, AALLME),注射器迅速吸入、排出混合液體,經(jīng)過離心和冰浴操作后,棄去凝固于液體表面的1-十二烷醇,取下層水相適量進(jìn)樣分析,步驟見圖3,結(jié)果顯示阿替洛爾、卡維地洛、普萘洛爾的富集因子分別為11.24、16.55、14.90, LOD分別為0.09、0.10、0.08 μg/mL。

2.3 唾液

研究表明唾液中藥物濃度與血漿中游離藥物濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性,且唾液樣品采集方便,不會(huì)引起患者不適,因此,可用唾液藥物濃度測(cè)定代替血藥測(cè)定。唾液樣本基質(zhì)比較簡(jiǎn)單,適合用DLLME進(jìn)行前處理。Abujaber等[35]采用IL-DLLME處理人唾液樣品,并結(jié)合LC-UV-Vis建立了一種測(cè)定唾液中可的松和氫化可的松含量的分析方法。選擇[C4MIM][PF6]作為萃取劑,甲醇作為分散劑,耗時(shí)短且環(huán)境友好,可的松和氫化可的松的LOD分別為0.11 μg/L和0.16 μg/L,富集因子分別為6.3和5.0。de Oliveira等[36]建立了n-DLLME結(jié)合LC-MS/MS法測(cè)定人唾液中17種內(nèi)分泌干擾物含量的分析方法。采用2 mL丙酮(分散劑)和三氯甲烷(萃取劑)混合物(3∶1, v/v)萃取待測(cè)的內(nèi)分泌干擾物,結(jié)果顯示LOD為0.01～0.15 ng/mL, LOQ為0.05～0.40 ng/mL,該萃取方法已應(yīng)用于10例人唾液樣本分析,萃取效果較好、靈敏度較高。

2.4 組織

組織中藥物含量的測(cè)定通常應(yīng)用于考察藥物在組織中的分布情況。Shen等[37]采用UA-LDS-DLLME萃取并結(jié)合GC-MS法測(cè)定人乳腺腫瘤和周圍脂肪組織中的對(duì)羥基苯甲酸酯。組織樣本勻漿后加入5 mL乙腈-水-15%(w/v)硫酸鋅緩沖液(2∶2∶1, v/v/v)進(jìn)行蛋白沉淀處理,離心后取出上清液,調(diào)節(jié)pH至7.0,鹽濃度至0.2%(w/v),將93 μL 1-癸醇和500 μL甲醇的混合液快速注入樣品中,156 W超聲44 s,離心3 min,得到位于上層的萃取相,進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示對(duì)羥基苯甲酸酯的富集因子為44.9～60.5,樣品回收率為79.6%～113.6%, LOD為0.5～1.0 ng/g。He等[38]采用原位衍生化超聲輔助液液微萃取結(jié)合UHPLC-MS/MS方法測(cè)定帕金森大鼠腦透析液中多種神經(jīng)遞質(zhì)含量,加入低毒性萃取劑溴苯、分散劑乙腈和衍生化試劑賴氨酸羅丹明B磺酰氯(lissaminerhodamine B sulfonyl chloride, LRSC)后進(jìn)行UA-DLLME,結(jié)果顯示神經(jīng)遞質(zhì)的LOD為0.002～004 nmol/L, LOQ為0.007～0.015 nmol/L,提取回收率為94.1%～108.7%,與文獻(xiàn)報(bào)道的衍生化和不衍生化LC-MS/MS方法相比,檢測(cè)靈敏度顯著提高,且耗時(shí)明顯縮短。

2.5 頭發(fā)

通過測(cè)定頭發(fā)中的藥物含量可以分析得到患者的長(zhǎng)期用藥史,但由于樣本量少且藥物濃度較低,分析難度較大,需要靈敏度高、富集效果好的萃取方法。Vincenti等[39]采用加壓液相萃取(pressurized liquid extraction, PLE)聯(lián)合DLLME技術(shù)并結(jié)合超高效液相色譜(UHPLC)-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(high resolution tandem mass spectrometry, HRMS/MS)測(cè)定頭發(fā)中的60種濫用藥物。在處理后的頭發(fā)樣品中加入7 mL 0.15 mol/L甲酸緩沖液(pH 3.5)-2-丙醇(80/20, v/v),在150 ℃、10 000 kPa條件下處理7 min,將得到的PLE萃取物離心,分離出5 mL加入1.2 g氯化鈉,采用20 μL 1 mol/L氫氧化鈉和500 μL碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至11,將200 μL萃取劑氯仿和500 μL分散劑2-丙醇混合溶液快速加入樣品中,經(jīng)過超聲、離心得到萃取相,進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示,頭發(fā)中60種濫用藥物的LOD為0.1～5 pg/mg, LOQ為0.2～50 pg/mg。Talpur等[40]采用超聲輔助離子液體液液微萃取處理頭發(fā)樣本,結(jié)合FAAS建立了一種測(cè)定營(yíng)養(yǎng)不良兒童頭發(fā)內(nèi)鉛含量的分析方法。在0.2 g頭發(fā)樣品中加入2 mL HNO3(65%)-H2O2(30%) (2/1, v/v)混合物室溫消化10 min,樣品過濾稀釋后加入2 mL 0.1 mol/L醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液,75 μL離子液體[C4MIM][PF6],于60 ℃熱水浴中超聲3 min,離心分離得到萃取相,加入反萃取劑0.5 mL 1.5 mol/L HNO3,超聲離心后得到萃取相。分析結(jié)果顯示鉛離子的LOD為0.19 μg/L,富集因子為70,與前期報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比,富集效果較好且靈敏度高。

DLLME結(jié)合多種檢測(cè)手段提供了一種簡(jiǎn)單、快速、高效且環(huán)境友好的分析方法,在常見的生物樣品中,以尿樣的應(yīng)用最多,其次是血樣。本文總結(jié)了不同模式的DLLME在多種生物樣品分析中的應(yīng)用情況,具體見表1[6-11,13,14,19-21,23-25,31,34,41-64]?？梢钥闯?該法已應(yīng)用于免疫抑制劑[8]、非甾體類抗炎藥[14]、內(nèi)分泌干擾物[41]、生物代謝標(biāo)志物[43,47]、外界致病物[9,44,59,62]、新精神活性物質(zhì)[45,50]、磷酸二酯酶抑制劑[46]、神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物[51]、抗高血壓藥物[57]、藥物濫用[58]、抗抑郁藥等;應(yīng)用的檢測(cè)方法包括GC[9,14,23,42,43,45]、LC[41,44,46,56-61]、MS[8,9,41-46, 48]、毛細(xì)管電泳(CE)[49]、UV[47,53,56-61]等,富集因子、提取回收率與靈敏度均較高。

3 結(jié)論與展望

分散液液微萃取技術(shù)具有富集效率高、易操作、耗時(shí)短、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),在生物樣品分析領(lǐng)域中的應(yīng)用日益增多。在常規(guī)分散液液微萃取的基礎(chǔ)上,發(fā)展了一些新型的萃取劑,如環(huán)境友好的綠色溶劑離子液體,萃取相易收集的低密度溶劑,以及密度小且熔點(diǎn)低于常溫的懸浮固化萃取劑等;另一方面,為了增強(qiáng)分散效果并減少分散劑的使用,發(fā)展了一些輔助分散的手段,包括超聲輔助、空氣輔助、渦旋輔助等,大大改善了人工振搖輔助分散的效果。分散液液微萃取技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于生物樣品,如血樣、尿樣、組織等復(fù)雜基質(zhì)中藥物的提取分離。但是目前的分散液液微萃取技術(shù)仍然以有機(jī)溶劑為主,離子液體雖然更環(huán)保,但其合成成本較高,而低密度溶劑由于其多為弱極性物質(zhì),適用范圍較窄;應(yīng)用方面,對(duì)于一些基質(zhì)比較復(fù)雜的樣品,DLLME提取效率和凈化程度并不理想。預(yù)計(jì)DLLME今后的發(fā)展方向主要為:(1)繼續(xù)開發(fā)安全低毒的新型萃取劑與分散劑,減少其用量,更加綠色環(huán)保;(2)發(fā)展能夠加速分散過程的新技術(shù)新方法(如渦旋-超聲雙分散輔助、磁性泡騰分散輔助等[65,66]),應(yīng)用于生物樣品中,從而實(shí)現(xiàn)無分散劑的DLLME過程;(3)針對(duì)生物樣品分析的基質(zhì)背景復(fù)雜的問題,將DLLME與其他樣品前處理技術(shù)相結(jié)合,應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的分離分析,提高DLLME的選擇性和萃取效率;(4)針對(duì)生物樣品分析中樣品數(shù)量眾多的問題,提升DLLME自動(dòng)化程度,結(jié)合多種檢測(cè)手段構(gòu)建在線模式,實(shí)現(xiàn)采樣、萃取、進(jìn)樣、分析一體化,必將大大提高分析通量,并擴(kuò)大DLLME的應(yīng)用范圍,為復(fù)雜生物樣品的前處理提供強(qiáng)勁的技術(shù)支撐。