吲哚美辛對骨肉瘤143B細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響

郭良煜 陶春杰 陳敬騰 龔長天 施玉博 郭衛(wèi)春

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是最常見的原發(fā)性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年，主要發(fā)生于長骨遠(yuǎn)端并且容易產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲。目前針對骨肉瘤治療的金標(biāo)準(zhǔn)是新輔助化療加手術(shù)切除，這使得骨肉瘤的5年生存率從20%提高到了60%[1]。然而，化療藥物的毒性和骨肉瘤細(xì)胞對化療藥物表現(xiàn)出的耐藥性對骨肉瘤的臨床治療和長期存活率構(gòu)成了極大挑戰(zhàn)。近幾年的研究表明誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡是消滅癌細(xì)胞的關(guān)鍵因素[2～4]。

吲哚美辛是NSAID一類的抗炎藥物，主要用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疼痛的對癥治療[5]。近年來已有相關(guān)文獻(xiàn)報道吲哚美辛可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移[6,7]同時也可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[8～11]。然而，吲哚美辛對人類OS的作用仍有待于進(jìn)一步研究。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究吲哚美辛對骨肉瘤143B細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞形態(tài)和凋亡的影響，并初步探討吲哚美辛抗骨肉瘤作用的相關(guān)分子機(jī)制，以期為吲哚美辛應(yīng)用于臨床骨肉瘤患者的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

材料與方法

1.材料:人骨肉瘤143B細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center For Type Culture Collection, CCTCC)；MEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；1%雙抗(青霉素100U/ml, 鏈霉素100μg/ml)購自吉諾公司;含EDTA的胰酶購自武漢谷歌生物科技有限公司；吲哚美辛、DMSO以及胰蛋白酶均購自美國Sigma 公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；一抗 caspase-3、caspase-9、GAPDH、Bcl-2以及Bax均購自美國CST公司；HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：人骨肉瘤143B細(xì)胞用含10%的胎牛血清和1%雙抗的MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng), 取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.細(xì)胞增殖能力檢測：將骨肉瘤143B細(xì)胞以1×105個/毫升濃度接種于96孔板上。每孔加入100μl,過夜孵育待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的吲哚美辛，陰性對照組加入等體積的MEM培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24、48、72h后每孔加入10μl的CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h后用酶標(biāo)儀(澳大利亞Tecan Sunrise公司)測量450nm波長下的吸光度(A)值。A值與細(xì)胞活力和數(shù)量呈正比，所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次。

4.形態(tài)學(xué)觀察：將骨肉瘤143B細(xì)胞以1×105個/毫升濃度接種于6孔板中。24h后分別加入不同濃度的吲哚美辛(0、400、600、800μmol/L)隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后, 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況和生長情況，并拍照。

5.細(xì)胞凋亡檢測：將骨肉瘤143B細(xì)胞以1×105個/毫升濃度接種于6孔板中。用不同濃度的吲哚美辛(0、600、800μmol/L)處理骨肉瘤143B細(xì)胞24h后，用胰酶消化細(xì)胞，離心5min后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次后用 250μl binding buffer重懸細(xì)胞，取100μl細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5μl的Annexin V/FITC和5μl的PI，混勻后避光孵育30min，最后再加入400μl binding buffer，隨即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

6.Transwell遷移實(shí)驗(yàn):將小室放入24孔板中，隨后將骨肉瘤143B細(xì)胞以每孔1×105個接種于小室的上室中。下室加入含20%血清的MEM培養(yǎng)基以建立血清濃度差。后用不同濃度的吲哚美辛(0、600、800μmol/L)處理骨肉瘤143B細(xì)胞。處理24h后用PBS清洗15min，用甲醇固定15min，吉姆薩染色10min。隨后用棉簽擦去上室的細(xì)胞，用倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

7.Western blot法：將骨肉瘤143B細(xì)胞以每孔1×105個接種于6孔板中。用吲哚美辛(800μmol/L)處理骨肉瘤143B細(xì)胞24h后用PBS洗滌2次，隨后加入RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度后用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)膜后用 5%的脫脂奶粉于室溫封閉1h，后加入相應(yīng)一抗隨后在4℃條件下過夜孵育。后用HRP標(biāo)記抗兔IgG于室溫孵育2h。TBST溶液洗 5×10min，隨后用ECL發(fā)光液顯色后分析結(jié)果以目的蛋白與GAPDH的灰度比值表示蛋白表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.吲哚美辛抑制骨肉瘤143B細(xì)胞增殖的影響:用不同的濃度分別處理143B細(xì)胞24和48h后用CCK8檢測增殖能力(圖1)。隨著吲哚美辛濃度的增加，細(xì)胞活力在不斷下降。同時相同濃度下的48h細(xì)胞活力均小于24h細(xì)胞活力，證明吲哚美辛可以抑制143B細(xì)胞的增殖，并且具有時間-劑量依賴性。

圖1 吲哚美辛對骨肉瘤143B細(xì)胞增殖的影響與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.吲哚美辛對骨肉瘤143B細(xì)胞形態(tài)的影響:用不同濃度的吲哚美辛處理骨肉瘤143B細(xì)胞24h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)顯示對照組細(xì)胞均貼壁同時生長良好，形態(tài)正常，排列規(guī)則且細(xì)胞密度高；而實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞形態(tài)異常同時細(xì)胞皺縮且排列紊亂，并且隨著吲哚美辛濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量及密度明顯減少(圖2)。

圖2 吲哚美辛對骨肉瘤143B細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)A.對照組;B.400μmol/L吲哚美辛處理組;C.600μmol/L吲哚美辛處理組;D.800μmol/L吲哚美辛處理組

3.吲哚美辛對骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡的影響:用不同濃度的吲哚美辛處理143B細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞總凋亡率詳見圖3?？偟蛲雎?%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。隨著吲哚美辛濃度的提高，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率不斷增高。

4.吲哚美辛對骨肉瘤143B細(xì)胞遷移的影響:用不同濃度的吲哚美辛處理143B細(xì)胞后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總數(shù)小于對照組細(xì)胞總數(shù)(圖4)，并且隨著吲哚美辛濃度的提高，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞總數(shù)不斷減少。

圖3 吲哚美辛對骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡的影響與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

圖4 吲哚美辛對骨肉瘤143B細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫，×100)與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

5.吲哚美辛對凋亡蛋白的影響:為了探討吲哚美辛誘導(dǎo)143B細(xì)胞的凋亡機(jī)制，檢測143B處理后的Bcl-2的表達(dá)情況(圖5)，與對照組比較，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，證明吲哚美辛通過下調(diào)Bcl-2凋亡蛋白來誘導(dǎo)143B細(xì)胞的凋亡。

圖5 吲哚美辛對凋亡蛋白的影響與對照組比較,*P<0.05

討 論

骨肉瘤是骨科中常見的原發(fā)性骨腫瘤，具有容易復(fù)發(fā)和侵襲性強(qiáng)的特點(diǎn)。而傳統(tǒng)的化療因其毒性不良反應(yīng)并且骨肉瘤容易產(chǎn)生耐藥性的原理使得骨肉瘤的臨床治療效果無明顯提高。而之前的研究中顯示抗炎藥物，例如賽來西布，可以抑制腫瘤細(xì)胞和血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等[12，13]。同時吲哚美辛對胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤有顯著作用[14]。有研究證實(shí)了吲哚美辛可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和分化，同時通過調(diào)控細(xì)胞中的溶酶體從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并且吲哚美辛也可以抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并且與基于葡聚糖的化合物相混合后可以降低乳腺癌細(xì)胞的耐藥性，其原理是減少了MDR相關(guān)蛋白所介導(dǎo)的化療藥物的排出[15，16]。

本研究通過不同濃度的吲哚美辛處理骨肉瘤143B細(xì)胞，結(jié)果顯示吲哚美辛可以抑制骨肉瘤143B細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而無論是細(xì)胞增殖還是侵襲，都與凋亡是密不可分的。凋亡的經(jīng)典途徑有兩種：線粒體途徑和Fas配體途徑，兩者都具有共同的下游通路caspase家族[17]。對于線粒體途徑，在接受死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)后，Bcl -2影響電壓依賴性陰離子通道 (VDAC)從而導(dǎo)致細(xì)胞膜電位降低，通透性增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18～20]。Western blot法檢測結(jié)果顯示Bcl-2表達(dá)下調(diào)，證實(shí)了吲哚美辛通過下調(diào)Bcl-2來誘導(dǎo)骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡。

綜上所述，吲哚美辛可以通過劑量依賴性和時間依賴性來抑制其骨肉瘤的增殖和遷移，同時通過下調(diào)Bcl-2來誘導(dǎo)骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡。這為吲哚美辛治療骨肉瘤患者提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的其他通路，例如Notch和Wnt通路等都未進(jìn)行研究，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將會研究吲哚美辛與以上兩通路之間的聯(lián)系。