理沖湯對子宮肌瘤模型小鼠Th1/Th2平衡漂移的調(diào)控作用研究

王文娜 李冬華 劉 宇 邱甜甜 韋 超

子宮肌瘤(uterine fibroids)是子宮中最常見的良性平滑肌腫瘤，主要由子宮平滑肌細胞增生而成，臨床表現(xiàn)可能包括月經(jīng)過多、痛經(jīng)、不孕、骨盆疼痛和骨盆壓迫癥狀等，還可能包括尿路疾病或便秘等[1,2]。有研究發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展與患者體內(nèi)性激素水平紊亂、子宮肌瘤內(nèi)細胞外基質(zhì)的過量積累、抗凋亡基因的過表達、遺傳基因的突變、免疫因子的調(diào)控等有關(guān)，年齡、體質(zhì)、飲食習慣等也為子宮肌瘤的高危因素[3～5]。在國外，首選的治療方法為手術(shù)切除，其次為使用米非司酮、避孕藥、醋酸烏利司他等藥物治療，釋放宮內(nèi)節(jié)育器對癥治療，以及作為保守治療的肌瘤動脈栓塞術(shù)和高頻超聲治療(HIFU)等，但是由于患者年齡、體質(zhì)、病情等因素的影響，上述各種方法均存在不足之處[6]。

近年來，中藥治療逐漸成為人們優(yōu)先選擇的一種治療方法，而且筆者發(fā)現(xiàn)有研究顯示腫瘤的發(fā)生與發(fā)展與Th1/Th2平衡的變化密切相關(guān)，正常情況下人體內(nèi)處于相對平衡狀態(tài)，而且這種平衡狀態(tài)時由這兩種細胞產(chǎn)生的細胞因子來調(diào)控，當平衡向Th1漂移時則會引發(fā)抗腫瘤免疫機制[7]。因此本實驗將通過異種移植造模法制備小鼠子宮肌瘤模型，用理沖湯及陽性藥物米非司酮進行干預，采用HE染色觀測小鼠子宮平滑肌組織結(jié)構(gòu)變化，采用超敏多因子檢測法檢測各組小鼠血清中各免疫相關(guān)細胞因子的濃度變化，探討理沖湯通過調(diào)控Th1和Th2分泌的細胞因子來治療子宮肌瘤的作用機制。

材料與方法

1.實驗動物:CB-17 Scid雌性小鼠[購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0001]，未孕，6～9周齡，體質(zhì)量19～21g，共24只。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物房，飼養(yǎng)條件達到SPF級標準。

2.實驗藥物:理沖湯出自《醫(yī)學衷中參西錄》一書，組成為生黃芪9g、黨參6g、白術(shù)6g、生山藥15g、天花粉12g、知母12g、三棱9g、莪術(shù)9g、生雞內(nèi)金9g。上述中藥飲片購自北京同仁堂飲片有限責任公司。在參考并尊重原方使用方法的基礎(chǔ)上，按以下方法熬制：按上述處方量取中藥飲片，先后水提2次。第1次加藥材8倍量水浸泡0.5h，煎煮1h，煎至將成，加陳醋少許；第2次加藥材的6倍量水煎煮1h，煎至將成時加陳醋少許，合并煎液，過濾，減壓(60℃以下，真空度0.05kPa)濃縮成相對密度為1.20～1.30(60℃)的稠膏，加蒸餾水配制成含生藥1.7g/ml濃縮液，并對pH值、比重、衛(wèi)生學進行檢測，低溫(0～4℃)保存，用前搖勻。

米非司酮(北京紫竹藥業(yè)有限公司，RU-486，批號：43110911，規(guī)格：25毫克/片)，用0.5%羧甲基纖維素(美國Sigma公司，C5678)配制成懸液，濃度為0.7g/L。

黃體酮注射液(上海通用公司，130905)；苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸公司，0703121)；堿性成纖維細胞生長因子(美國SAB公司，70402)；表皮生長因子(美國SAB公司，70504)。

3.主要試劑與儀器：MSD試劑盒(優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，K15048D-1)；光學顯微鏡(日本Olympus公司，TH-200/OlympuS V-RFL-T)；MSD超敏因子電化學發(fā)光分析儀(美國MSD公司，QuickPlex SQ120)。

4.人子宮肌瘤細胞懸液的制備：準備好眼科剪、鑷子等器材，高溫高壓消毒滅菌。操作時佩戴無菌手套，在無菌操作臺上操作，用鑷子取1cm3大小新鮮子宮肌瘤組織，剔掉血管和壞死部分，在含有青鏈霉素混合液的PBS中清洗3次，然后迅速將子宮組織移至置于冰板上的燒杯中，加入適量的DMED培養(yǎng)基，用眼科剪將組織迅速剪碎至均勻細小顆粒。用無菌吸管將DMEM液吸去后，將組織顆粒移至15ml離心管中，加入10ml 0.2%的Ⅰ型膠原酶進行消化，輕輕搖晃使組織顆粒與消化酶均勻接觸，再將其放入37℃水浴鍋中消化30～90min(消化時間視組織消化情況而定)直到組織塊明顯減小或成乳糜狀即可；將離心管移出水浴鍋，加入20%完全培養(yǎng)基終止消化，無菌吸管吸取上清液，用70mm細胞篩進行篩選，收集細胞濾液；12000r/min離心10min，用移液槍吸去上清液，然后加入完全培養(yǎng)基(DMEM、20%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液)進行重懸，將細胞懸液接種到25cm3培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；12～24h后對細胞進行觀察，待細胞貼壁后進行細胞換液，之后48h換液1次；當細胞融合度達到80%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA進行消化，加入完全培養(yǎng)基，配制成密度為1.5×106個/毫升子宮肌瘤細胞懸液備用。

5.子宮肌瘤小鼠模型的制備：模型組、理沖湯組、陽性藥物組在接受異種移植之前，先腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液(2mg/kg)2周，再腹腔注射黃體酮注射液(2.5mg/kg)1周，以促進子宮發(fā)育，正常組注射等量0.9%氯化鈉注射液；小鼠稱重，戊巴比妥鈉(0.15ml/10g)對小鼠進行麻醉，下腹部消毒備皮，橫切暴露腹腔，鈍性分離脂肪組織探查“Y”形子宮。提前在子宮肌瘤細胞懸液中加入伊文思藍以確保注射部位可視化，1ml無菌注射器吸取有100μl子宮肌瘤細胞懸液(細胞數(shù)約為1.5×106個)注射于小鼠子宮右側(cè)分角肌層，同時吸取10μl表皮生長因子、堿性成纖維細胞因子注射于子宮左側(cè)分角相同部位；用可吸收縫合線逐層縫合腹腔切口，并滴加適量青-鏈霉素預防感染，適當對小鼠進行保溫；定期觀察小鼠狀態(tài)，小鼠能夠進行正常生理活動等后可進行后續(xù)實驗。

6.藥物干預:提前將藥物在水浴鍋中加熱至30℃。理沖湯組每日灌服理沖湯濃縮液，用量為30.45g/kg(按照體表面積折算，用藥量為成人等效劑量的3倍)。陽性藥物組每日灌服米非司酮懸液，用藥量為2.9mg/kg(為成人的等效劑量)。正常組和模型組小鼠每日灌服等量0.9%氯化鈉注射液。連續(xù)灌服4周。

7.HE染色：光鏡下對各組小鼠子宮進行肉眼觀察，然后取子宮分角以上0.2cm相同部位一段子宮組織，約5mm3大小，10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，HE染色，于光鏡(×200)下進行組織病理學觀察。

8.MSD 超敏多因子電化學發(fā)光法：準備標準品：稀釋液45加1ml到標準品中，充分振蕩，室溫放置15～20min，作為最高的濃度點，依次做4倍稀釋，7個標準品+1個Blank；準備檢測抗體稀釋液：吸取檢測抗體30μl，并用稀釋液45補足1.5ml體積。準備清洗液：配置1×的PBS(0.05%吐溫-20)待用。準備讀板液：配置2×的讀板液；清洗MSD板3次，每次150μl的清洗液；每孔加入50μl的樣本和標準品，并用封口膜封上，室溫振蕩2h；清洗MSD板3次，每次150μl的清洗液；每孔加入配置好的25μl檢測抗體，并用封口膜封上，室溫振蕩2h；清洗MSD板3次，每次150μl的清洗液；每孔加入150μl配置好的讀板液，上機檢測。

結(jié) 果

1.HE染色觀察各組小鼠子宮平滑肌組織結(jié)果:正常組小鼠子宮平滑肌細胞整齊，外縱行肌與內(nèi)環(huán)行肌分界清晰，內(nèi)環(huán)行肌細胞呈流水狀，腺體上皮為單層柱狀上皮。模型組細胞排列紊亂且有明顯增生，膠原纖維與細胞間質(zhì)增多，細胞界限不清，細胞核多呈長桿狀，外縱行肌與內(nèi)環(huán)行肌分界不清，腺體細胞增生，基本為復層柱狀上皮或假復層柱狀上皮。理沖湯組平滑肌細胞排列較為整齊，增生情況較之于模型組大有緩解，外縱行肌與內(nèi)環(huán)行肌分界比較清晰，腺體上皮基本為單層柱狀上皮。陽性藥物組平滑肌細胞排列較為整齊，細胞增生情況較之于模型組略輕，外縱行肌與內(nèi)環(huán)行肌分界比較清晰，腺體上皮基本為單層柱狀上皮(圖1)。

圖1 各組小鼠子宮平滑肌組織的變化(HE，×200)A.正常組;B.模型組;C.理沖湯組;D.陽性藥物組

2.MSD超敏多因子電化學發(fā)光法檢測子宮肌瘤模型小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10的濃度：與正常組比較，模型組小鼠血清中的IL-2、IFN-γ的濃度顯著降低(P<0.01)，而IL-4、IL-5、IL-10的濃度顯著升高(P<0.05，P<0.01)；陽性藥物組的IL-4、IL-5、IL-10的濃度也顯著升高(P<0.05，P<0.01)，理沖湯組僅IL-5的濃度與正常組比較顯著升高(P<0.01)，詳見表1。與模型組比較，理沖湯組小鼠血清中的IL-2、IFN-γ均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，IL-4、IL-5、IL-10的濃度均顯著降低(P<0.05，P<0.01)；而陽性藥物組中的IL-2、IFN-γ均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，但IL-4、IL-5、IL-10的濃度變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10的濃度

與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

討 論

已有研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與免疫系統(tǒng)介導的免疫逃逸機制密切相關(guān)。腫瘤細胞由于表觀遺傳的改變和基因組的不穩(wěn)定性而出現(xiàn)變異，免疫原性降低，平衡階段的休眠狀態(tài)被破壞，進而變異的腫瘤細胞會在淋巴細胞和細胞因子的壓力下進入逃逸階段，并建立免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，進行無限制的生長繁殖，最終形成臨床上所見的腫瘤。而在這個免疫逃逸過程中T淋巴細胞(簡稱T細胞)和各類細胞因子發(fā)揮了重要作用[8]。

筆者觀測的細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10主要是由淋巴細胞中的T細胞的亞群——輔助性T細胞分泌，此類細胞又被稱為Th細胞，其中的Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等[9，10]。因此，IL-2、IFN-γ的表達能夠促進Th1型免疫應答，而IL-4、IL-5和IL-10的表達能夠促進Th2型免疫應答。

在正常情況下機體內(nèi)Th1/Th2細胞處于平衡狀態(tài)，當Th1細胞及其細胞因子占優(yōu)勢之時便有抗腫瘤之功能，有研究稱Th1細胞可以通過將M2巨噬細胞轉(zhuǎn)換為經(jīng)典的促炎性M1巨噬細胞來抑制腫瘤，而且IL-2具有增強B細胞殺傷效應的功能，IFN-γ更是多效細胞因子，能夠參與腫瘤免疫編輯的3個階段及炎性介導的腫瘤發(fā)生的過程，能夠防止腫瘤復發(fā)并能使其進入休眠狀態(tài)[7，11～13]；但Th2細胞及其細胞因子占優(yōu)勢之時能夠使腫瘤逃脫免疫系統(tǒng)監(jiān)視，有研究稱IL-4為Th2型細胞反應的起始物而且能夠促進M2巨噬細胞極化，還能夠?qū)⒊Ｒ?guī)自然殺傷(cNK)細胞轉(zhuǎn)化為IL4-NK細胞進而能夠分泌IL-10，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡[13～15]。而IL-5不僅自身與其受體結(jié)合后能誘導腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移還能通過MMP-9/NF-κB/AP-1等途徑來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[16]。Th2細胞占優(yōu)勢時是腫瘤免疫逃逸的機制之一，Th2細胞或其細胞因子比例升高時可促進腫瘤的生長[17]。因此在治療腫瘤時，通過調(diào)控細胞因子向Th1狀態(tài)漂移，可促進機體免疫功能的恢復，開啟機體抗腫瘤免疫應答，達到縮小腫瘤甚至使腫瘤消失的目的。

在《景岳全書》中有敘述：“凡人之氣血猶源泉也，盛則流暢，少則壅滯”，即是說人在氣血虧虛之時，血行無力，易致瘀血；《中藏經(jīng)》有言：“積聚癥瘕雜蟲者……皆五臟六腑真氣失而邪氣并，遂乃生焉”，即意為子宮肌瘤是因臟腑功能失常或元氣虛弱而致正虛，又兼邪氣作祟而發(fā)生；《婦人大全良方》中也有提到“婦人癥痞，由飲食失節(jié)，脾胃虧損，邪正相搏，積于腹中，牢不可動，有可證驗，故名曰癥”，也是說因飲食失節(jié)所指的脾胃虛弱，痰濕內(nèi)生，正虛邪盛，阻滯氣血運行而致瘀阻胞宮則子宮肌瘤發(fā)生；在《血證論》中有述：“瘀血在經(jīng)絡(luò)臟腑之間，則結(jié)為癥瘕”，也說明了子宮肌瘤的發(fā)生與瘀血停積密切相關(guān)。因此可知子宮肌瘤的基本病因病機為正虛血瘀，其治則為扶正祛瘀。

本研究所用的出自張錫純先生《醫(yī)學衷中參西錄》的理沖湯，是以扶正祛瘀法治療子宮肌瘤的代表方，方中三棱、莪術(shù)為化瘀血之要藥，能夠化血理氣，善治女子瘀血，并善消沖脈中的瘀血；方中又以黃芪、黨參等保護氣血，使瘀血去而不傷及氣血，而且參、芪得三棱、莪術(shù)流通之功更能夠使其補而不滯、元氣愈旺，而元氣旺則更能鼓勵三棱、莪術(shù)消癥之力，效果更佳；白術(shù)、山藥能健脾益氣，合黨參、黃芪補氣扶正；天花粉、知母能夠解黃芪、白術(shù)之熱，而且張錫純老先生善用知母配黃芪，黃芪溫補而知母寒潤，一陽一陰相互應和；雞內(nèi)金不僅能夠健脾消食，使其開胃進食進而扶正起衰，此藥還能化瘀血而不傷氣分，輔助消癥；全方諸藥合用能夠健脾開胃進食、益氣化血和血，共奏扶正行血、祛瘀消癥之功效。

本研究中，經(jīng)理沖湯干預后，采用MSD 超敏電化學發(fā)光技術(shù)檢測了Th1和Th2細胞中的相關(guān)細胞因子。實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中的IL-2和IFN-γ濃度顯著降低，而IL-4、IL-5、IL-10的濃度顯著升高，提示子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞因子介導的Th1/Th2平衡向Th2狀態(tài)漂移而導致腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)。與模型組比較，理沖湯組小鼠血清中的IL-2和IFN-γ濃度顯著升高，IL-4、IL-5、IL-10的濃度顯著降低，但是陽性藥物組中只有IL-2和IFN-γ顯著升高，而IL-4、IL-5、IL-10降低的幅度比較差異無統(tǒng)計學意義。而理沖湯可以通過提高Th1細胞因子的表達，降低Th2細胞因子的表達，促使機體免疫向Th1狀態(tài)漂移，防止子宮肌瘤發(fā)生免疫逃逸，抑制其發(fā)生、發(fā)展，提高機體免疫應答能力。本研究結(jié)果顯示，理沖湯通過調(diào)控Th1、Th2細胞分泌因子的含量水平，影響免疫逃逸，進而發(fā)揮抑制子宮肌瘤的作用。