長鏈非編碼RNASNHG5在卵巢癌組織中表達(dá)及對卵巢癌細(xì)胞自噬影響

沈曉萍 張金春

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院(202150)

卵巢癌是女性生殖器常見惡性腫瘤之一[1-2]。目前缺乏特異性篩查手段[3]。研究認(rèn)為卵巢癌是一個多基因、多位點(diǎn)、累積病變過程，涉及細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種途徑[4-6]。自噬是生命科學(xué)研究熱點(diǎn)之一，自噬參與卵巢癌腫瘤進(jìn)展，可能是卵巢癌潛在的治療途徑[7]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要調(diào)控作用，核仁小RNA宿主基因5(SNHG5)在胃癌、結(jié)直腸癌中異常表達(dá)[8-9]。是潛在的惡性腫瘤治療靶點(diǎn)，但在卵巢癌中還未見研究。本研究以SNHG5與細(xì)胞自噬調(diào)控關(guān)系為切入點(diǎn)，探討SNHG5在卵巢癌的作用，為卵巢癌治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取自2017年8月—2019年3月本院因卵巢囊腫/卵巢癌住院行手術(shù)者，正常卵巢組織82例(囊腫組)、卵巢癌組織73例(卵巢癌組)。73例卵巢癌組織均為上皮性腫瘤，其中漿液性58例，粘液性15例。患者均知情同意，囊腫組和卵巢癌組組織提供者年齡(35.2±4.1)歲、(35.5±4.4)歲無差異。卵巢癌細(xì)胞SKOV3購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。pcDNA3.1(+)質(zhì)粒、pcDNA3.1-SNHG5重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室制備。DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、胰酶購自美國Gibco公司；實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(DRR041A)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR047A)購自大連寶生物工程有限公司；CCK8相關(guān)試劑購于美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購自北京全式金生物公司；鼠抗人LC3-I、LC3-II、beclin 1、GAPDH一抗購及二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG)購自美國Santa Cruz公司；單丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverin，MDC)染色試劑盒購自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司。其余試劑購自國藥集團(tuán)，均為分析純。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1lncRNA-SNHG5表達(dá)參照Trizol說明書提取兩組組織總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)體系為10ul(2 μl 5x Reaction mix/1 μl Random primer/0.5 μl逆轉(zhuǎn)錄酶/5 μl RNA樣品)，25℃ 5min，42℃30 min，85℃ 5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性，去離子水將cDNA稀釋10倍后-20℃保存。實(shí)時熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測。程序設(shè)定：95 ℃預(yù)熱3 min，95 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，上述3步驟35次循環(huán)，72℃ 5min終止反應(yīng)。其中SNHG5 以GAPDH為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見表1。采用2-ΔΔCt算法計(jì)算SNHG5相對表達(dá)量。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出凍存的SKOV3細(xì)胞，快速解凍后離心棄凍存液，用含10%完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁融合至80%時棄培養(yǎng)基，PBS清洗后加入1ml胰酶消化，待細(xì)胞分散后去除胰酶，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基2ml，混勻，按1:2的比例開始傳代，細(xì)胞傳至3代時取對數(shù)生長期細(xì)胞開始計(jì)數(shù)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)分為3組：空白組，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基;陰性對照組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+);SNHG5過表達(dá)組，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SNHG5。轉(zhuǎn)染前1天，將SKOV3以2×105/孔接種于6孔板，加2 ml培養(yǎng)基。按照lipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染：pcDNA3.1(+)質(zhì)粒、pcDNA3.1-SNHG5重組質(zhì)粒稀釋液分別與轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000稀釋液按照1:1比例轉(zhuǎn)染，并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后通過400mg/L的G418篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，穩(wěn)定細(xì)胞株以400mg/L的G418維持培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞供后續(xù)使用，按照1.2.1中方法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞SNHG5表達(dá)情況。

1.2.4CCK-8法檢測各組SKOV3增殖情況收集上述各組細(xì)胞，分別培養(yǎng)24、48、72、96h，每組設(shè)6個復(fù)孔，加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)4h后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。以未接種細(xì)胞質(zhì)加培養(yǎng)基孔的A值為空白對照調(diào)零，細(xì)胞增殖抑制率=[1-A處理組/未處理組]×100%。

1.2.5細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)收集各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，室溫離心20min，棄上清，4%戊二醛固定過夜，送本院電鏡室攝片透視電鏡技術(shù)觀察。

1.2.6觀察細(xì)胞自噬囊泡形成情況收集各組細(xì)胞，按照單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色試劑盒操作說明染色，熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)并拍照。每個樣本隨機(jī)選取6個視野，統(tǒng)計(jì)視野中MDC染色陽性細(xì)胞個數(shù)，以核周或胞漿內(nèi)出現(xiàn)3個以上高密度著色點(diǎn)的細(xì)胞即為MDC陽性細(xì)胞，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上靜置，充分裂解后通過免疫印記法(WB)檢測，蛋白提取試劑盒提取總蛋白。使用BCA蛋白試劑盒測定細(xì)胞中總蛋白濃度。用10%SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，TBST清洗3次后，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加入一抗LC3-I(1：500)、LC3-II(1：500)、beclin 1(1：1000)，以GAPDH做為內(nèi)參，24 h后吸取一抗，清洗PVDF膜后，加入相應(yīng)二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔)37℃封閉1 h，滴加ECL顯色液，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖片，用Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照對蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SNHG5在組織中的表達(dá)及臨床病理

SNHG5相對表達(dá)量卵巢癌組(0.49±0.06)低于囊腫組(1.13±0.23)(t=12.982，P=0.000)。以卵巢癌組SNHG5相對表達(dá)量將卵巢癌組分為SNHG5高表達(dá)組(31例)和低表達(dá)組(42例)，卵巢癌組織中SNHG5表達(dá)與患者年齡及是否絕經(jīng)未見差異(P>0.05)，但在組織學(xué)分級G3、FIGO分期III～I(xiàn)V期中SNHG5低表達(dá)占比高于高表達(dá)(P<0.05)。見表2。

2.2 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株內(nèi)SNHG5表達(dá)

瞬時轉(zhuǎn)染效率如圖1(1935頁)所示，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，SNHG5相對表達(dá)量， SNHG5過表達(dá)組(1.97±0.37)高于空白組(1.03±0.20)和陰性對照組(1.05±0.21)(P<0.05)，但空白組與陰性對照組無差異(P>0.05)。

表2 卵巢癌組不同SNHG5表達(dá)與患者臨床病理關(guān)系[例(%)]

2.3 lnc RNA-SNHG5過表達(dá)對SKOV3細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染24h時， SKOV3細(xì)胞增殖抑制率3組無差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染48h、72h、96h時，SNHG5過表達(dá)組SKOV3細(xì)胞增殖抑制率均高于空白組和陰性對照組(P<0.05)。見表3。

2.4 lnc RNA-SNHG5過表達(dá)對SKOV3細(xì)胞自噬的影響

透射電鏡顯示，SNHG5過表達(dá)組可觀測到較多自噬小體結(jié)構(gòu)的存在，可見細(xì)胞質(zhì)和線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器包裹于雙層膜結(jié)構(gòu)(圖2)(1935頁)。與空白組、陰性對照組相比， SNHG5過表達(dá)組MDC陽性細(xì)胞占比(42.38±7.64)大于空白組(13.17±1.13)和陰性對照組(15.49±3.57)(P<0.05)。見圖3(1935頁)。

2.5 lnc RNA-SNHG5過表達(dá)對SKOV3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

與空白組相比，陰性對照組LC3-I、LC3-II、beclin 1蛋白表達(dá)差異不顯著，SNHG5過表達(dá)組LC3-I蛋白表達(dá)量降低，LC3-II、beclin 1蛋白表達(dá)升高(均P<0.05)。見圖4(1935頁)、表4。

表3 各組不同時間SKOV3細(xì)胞增殖抑制率比較

表4 各組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

3 討論

SNHG5位于6號染色體短臂14區(qū)3帶，由染色質(zhì)基因阻斷點(diǎn)U50宿主基因的6個外顯子組成的剪切體。研究發(fā)現(xiàn)，位于基因阻斷點(diǎn)位置的基因是腫瘤候選基因的重要指標(biāo)，與多種癌癥的腫瘤惡性生物學(xué)行為緊密聯(lián)系，可通過多種方式影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。SNHG5在不同惡性腫瘤中既可發(fā)揮癌基因作用，又可發(fā)揮抑癌基因作用[11]，SNHG5在胃癌、鼻咽癌[12-13]中低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因作用；而在結(jié)直腸癌[14]中發(fā)揮促癌基因作用，提示SNHG5表達(dá)可能存在組織差異性。本研究中，卵巢癌組織中SNHG5表達(dá)顯著低于卵巢囊腫組織，提示這種異常表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。并且卵巢癌患者的組織學(xué)分級、FIGO分期也存在差異，提示SNHG5可能參與了卵巢癌病情進(jìn)展。

進(jìn)一步培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞，并構(gòu)建過表達(dá)SNHG5 SKOV3細(xì)胞。結(jié)果顯示SNHG5過表達(dá)后SKOV3細(xì)胞增殖能力降低，提示SNHG5過表達(dá)可能抑制了SKOV3細(xì)胞增殖。自噬與腫瘤關(guān)系十分密切。腫瘤形成后，由于過快的增長速度，血液供應(yīng)不協(xié)調(diào)，常導(dǎo)致部分腫瘤細(xì)胞處于缺氧或饑餓狀態(tài)，為耐受生存壓力，自噬活性增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤生長存活[15]。近年一些靶向自噬通路的藥物研究表明，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡或抑制自噬性保護(hù)是消滅腫瘤細(xì)胞的有效措施。Wang等[16]研究顯示，卵巢癌組織自噬相關(guān)蛋白beclin 1表達(dá)下調(diào)。達(dá)沙替尼是治療慢性髓細(xì)胞性白血病的二線藥物，可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞SKOV3發(fā)生自噬[17]。此外，白藜蘆醇等藥物也通過促進(jìn)細(xì)胞自噬抑制卵巢癌細(xì)胞增殖[18]。以上研究顯示，細(xì)胞自噬在卵巢癌中有發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，SNHG5過表達(dá)組SKOV3細(xì)胞中可觀測到自噬小體，且檢測到的高亮點(diǎn)狀熒光自噬泡數(shù)量高于空白組與陰性對照組，提示SNHG5過表達(dá)可促進(jìn)自噬的形成。LC3是自噬過程中標(biāo)志蛋白，外源物質(zhì)刺激細(xì)胞自噬啟動時，胞漿型的LC3-I分解轉(zhuǎn)化為LC3-II，參與自噬體膜形成[19]。Beclin 1是形成自噬體的必要分子，可介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位于吞噬泡，并調(diào)控自噬體的形成[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，SNHG5過表達(dá)組SKOV3細(xì)胞中LC3-II及Beclin 1水平明顯上調(diào)，表明胞漿中有自噬體膜及吞噬泡形成，提示SNHG5過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞自噬，推測SNHG5可能通過促進(jìn)細(xì)胞自噬來抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖過程。

綜上所述，卵巢癌組織中SNHG5低表達(dá)，且在不同卵巢癌組織學(xué)分級、FIGO分期患者中存在差異；過表達(dá)SNHG5可能通過促進(jìn)細(xì)胞自噬抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖。本研究也存在一定不足，僅選擇了典型卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，缺乏動物模型實(shí)驗(yàn)等更多證據(jù)，此外盡管自噬與凋亡在形態(tài)學(xué)上存在差別，但許多經(jīng)典凋亡信號通路與自噬調(diào)控存在交叉，下一步將研究SNHG5引起的凋亡與自噬間的互作關(guān)系。