Li+脅迫對羅布麻種子萌發(fā)、幼苗生長及離子分布的影響

高鋼，哈尼帕·哈再斯，喻春明，陳平，陳繼康，陳坤梅，劉寧，朱愛國*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長沙410205）

（伊犁州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆伊寧835000）

夾竹桃科羅布麻屬（Apocynum）的多年生宿根草本植物具有重要的經(jīng)濟價值，在紡織、醫(yī)藥、鹽堿地改良、生態(tài)修復(fù)等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用［1-3］。上世紀50年代農(nóng)業(yè)經(jīng)濟學(xué)家董正鈞在新疆羅布泊進行農(nóng)業(yè)考察時，發(fā)現(xiàn)該屬植物纖維品種優(yōu)良，為有利于產(chǎn)業(yè)化推廣，減少糧棉爭地及滿足日益增長的纖維需求，隨發(fā)現(xiàn)地命名，把全國各地的夾竹桃科紅、白野麻等羅布麻屬植物統(tǒng)一稱為羅布麻。關(guān)于這一類群植物的分類問題雖一直存在分歧，但經(jīng)過半個多世紀的科研、生產(chǎn)等實踐活動，“羅布麻（luobuma）”一詞已為國內(nèi)外各界所接受，從植物分類學(xué)的依據(jù)和生產(chǎn)實踐的需求考慮，我國羅布麻屬植物主要劃分為1屬2種，即羅布麻屬，羅布白麻（Apocynum hendersonii Hook.f.）和羅布紅麻（Apocynum venetum L.）［2，4-5］。

鹽漬是限制植物生長和降低作物產(chǎn)量最主要的非生物脅迫之一，目前我國土壤鹽堿化呈不斷增加的趨勢［6-10］。羅布麻類植物耐旱、耐鹽堿，抗逆性強，是鹽堿地、荒漠區(qū)生態(tài)修復(fù)和利用的首選植物。目前，對鹽脅迫下羅布麻類植物的種子萌發(fā)、生理生態(tài)響應(yīng)等情況已有相關(guān)報道。如，400 mmol/L NaCl脅迫下，羅布白麻種子的發(fā)芽率高于羅布紅麻［11］，羅布白麻種子對幾種不同類型鈉鹽的耐性強弱順序為Na2SO4＞NaCl＞Na2CO3［12］；濃度為 400 mmol/L的 NaCl等鈉鹽脅迫下，羅布紅麻仍有20%以上的發(fā)芽率，其中鈉鹽濃度越高，對羅布紅麻發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)的抑制作用越大［13，14］；此外，不同濃度海水對羅布紅麻萌發(fā)和幼苗生長的影響研究發(fā)現(xiàn)，20%濃度的海水脅迫下種子萌發(fā)率最高，發(fā)芽率隨海水濃度升高而降低［15］。

上述相關(guān)鹽漬環(huán)境下羅布麻類植物種子萌發(fā)及生長發(fā)育研究，均是以鈉鹽脅迫下的發(fā)芽率、生長勢和鈉鹽耐受性等指標為主。Li+也是動植物生長所需的微量礦質(zhì)元素之一，但高濃度Li+會對動植物造成嚴重或慢性的毒害［16］。工業(yè)領(lǐng)域廢棄Li+原料、荒漠礦區(qū)巖石風(fēng)化等均能造成環(huán)境、土壤Li+污染，間接污染到農(nóng)作物，是迫切需要解決的重大問題［17］?，F(xiàn)有的研究報道發(fā)現(xiàn)羅布紅麻對Li+具有較高的耐受性和積累吸附能力［18，19］，但對于廣泛分布于荒漠鹽堿地的羅布白麻則未有相關(guān)報道。羅布紅麻和羅布白麻在環(huán)境分布、生理生態(tài)特性上都存在一定差異，本研究擬通過比較分析羅布白麻和羅布紅麻對LiCl的耐受能力，及Li+在不同器官中的積累與亞細胞分布特征，以期為羅布白麻和羅布紅麻特異性區(qū)域種植和植物生態(tài)修復(fù)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 不同濃度LiCl溶液對羅布白麻和羅布紅麻種子的脅迫處理

試驗采用7個不同濃度梯度的LiCl溶液分別處理羅布白麻與羅布紅麻種子，以加蒸餾水為對照，每個處理三次重復(fù)。Li+濃度分別為 0、50、100、200、300、400和 500 mmol/L。選取籽粒飽滿大小均勻一致的種子，升汞消毒5 min，再用蒸餾水沖洗5～6次，然后用蒸餾水浸泡5 h，風(fēng)干后置于放有2層濾紙的內(nèi)徑為11 cm的滅菌培養(yǎng)皿中，每皿100粒，分別加入處理溶液至濾紙飽和，25℃恒溫培養(yǎng)箱光照和黑暗交替（光照時間14 h，黑暗時間10 h）條件下發(fā)芽8 d。72 h后開始記錄發(fā)芽數(shù)，以后每天觀察記錄種子發(fā)芽數(shù)，萌發(fā)以胚根大于2 mm為標準，并補充蒸餾水使培養(yǎng)皿內(nèi)的鹽濃度保持穩(wěn)定。

1.2 羅布白麻和羅布紅麻植株LiCl脅迫處理與亞細胞組分分離

挑選生長一致的幼苗（10±1）cm置于水培儀中，每2個星期更換一次培養(yǎng)液，水培培養(yǎng)4個星期后，采用100 mmol/L濃度的LiCl溶液進行脅迫處理。分別設(shè)置對照組和處理組，每個處理3個重復(fù)，脅迫處理2個星期后分別收獲根、莖、葉進行Li含量測定。

取羅布麻樣品加入提取劑（250 mM蔗糖，50 mM Tris-HCl pH＝7.5，1mM DTT）充分研磨。采用差速離心法，將勻漿樣品于4℃，3000 r/min條件下離心15min，收集沉淀部分獲得細胞壁組分；取上清液4℃，15000 r/min條件下離心30 min，收集沉淀，獲得細胞器組分；剩余的上清液為細胞可溶組分。取各組分樣品分別進行Li+含量測定。

1.3 測定方法

1.3.1 種子發(fā)芽率等指數(shù)測定

發(fā)芽率（GP）（%）＝發(fā)芽終期全部正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子粒數(shù)×100%

相對發(fā)芽率（RGP）（%）＝處理的發(fā)芽率/對照發(fā)芽率×100%

發(fā)芽勢（GV）（%）＝第四天的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

胚根長度（mm）：每皿隨機取10棵萌發(fā)的幼苗，測最長的主根長度

發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑（Gt/Dt），Gt為 t時間內(nèi)的發(fā)芽種子粒數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)

活力指數(shù)（VI）＝GI×S（S為胚根長）

耐鹽指數(shù)＝VI/VI［20］鹽水

試驗數(shù)據(jù)通過Excel繪制成表格，運用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)的差異顯著性比較。

1.3.2 羅布白麻和羅布紅麻植株及亞細胞組分中Li+含量測定

羅布麻根、莖、葉經(jīng)95℃，10min殺青后，65℃烘干24 h，然后用打粉機粉碎。稱取0.1 g粉碎后樣品，加入5 mL純HNO3溶液于180℃條件下進行測定消煮，消煮完全后的混合溶液定容至50 mL；亞細胞組分中的細胞壁及細胞器組分樣品經(jīng)烘干粉碎后加入HNO3溶液，按上述同樣方法消煮、定容。細胞可溶組分樣品中加入1 mM EDTA后直接定容。經(jīng)定容后的根、莖、葉樣品及亞細胞組分樣品均采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法進行Li+含量測定［19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度LiCl脅迫對種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)的影響

如表1所示，LiCl脅迫對羅布白麻和羅布紅麻種子的萌發(fā)存在顯著影響。隨著LiCl濃度的增大，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等均呈下降趨勢，但在不同濃度脅迫條件下，羅布白麻種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)略高于羅布紅麻；LiCl濃度高于200 mmol/L時子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)開始急劇下降；當LiCl濃度達400 mmol/L，羅布白麻種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)分別僅為5.56±1.20%，2.52±1.0%，3.38±1.30%，而羅布紅麻種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均為0；當 LiCl濃度達500 mmol/L，羅布白麻種子也未能萌發(fā)。

表1 不同濃度LiCl脅迫對羅布白麻和羅布紅麻種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of LiCl concentration on seed germination of A.venetum and A.hendersonii

2.2 不同濃度LiCl脅迫對羅布白麻和羅布紅麻胚根長度的影響

LiCl脅迫下羅布白麻和羅布紅麻幼根的生長受到了不同程度的抑制。在低濃度（50 mmol/L）脅迫條件下，羅布白麻和羅布紅麻胚根的生長便受到明顯抑制，胚根長度分別為5.92±0.83 cm和5.73±0.86 cm；隨著鹽濃度的升高，胚根長度均呈下降趨勢，鹽濃度越高，胚根生長受抑制越嚴重。

不同濃度LiCl脅迫對羅布白麻和羅布紅麻胚根生長的抑制也存在一定的差別。LiCl對羅布白麻胚根的抑制作用相對較輕。各LiCl濃度梯度條件下，羅布白麻種子胚根長度均大于羅布紅麻種子胚根長度，高濃度LiCl脅迫下（400 mmol/L）羅布白麻的胚根仍能生長，長度為0.2±0.1 cm，而在LiCl濃度為400 mmol/L時，羅布紅麻種子的胚根已不能正常生長。

表2 不同LiCl脅迫對羅布白麻和羅布紅麻種子胚根長度的影響Table 2 Effects of LiCl concentration on radicle length of A.venetum and A.hendersonii seeds

2.3 不同濃度LiCl脅迫對羅布白麻和羅布紅麻種子萌發(fā)活力指數(shù)的影響

羅布白麻和羅布紅麻種子萌發(fā)活力均隨著LiCl濃度的升高而降低，不同LiCl濃度梯度下，羅布紅麻種子萌發(fā)活力指數(shù)均低于羅布白麻種子；在LiCl濃度達400 mmol/L時，羅布紅麻種子的活力指數(shù)已為0，羅布白麻種子的活力指數(shù)也僅為0.68±0.21（表3）。從種子萌發(fā)活力指數(shù)看，LiCl脅迫對羅布白麻和羅布紅麻的作用存在顯著差異，羅布白麻種子對不同濃度梯度LiCl的耐受性強于羅布紅麻。

表3 不同濃度LiCl脅迫對羅布白麻和羅布紅麻種子活力指數(shù)的影響Table 3 Effects of LiCl concentration on vigor index of A.venetum and A.hendersonii seeds LiCl處理濃度/（mmol·L-1） 羅布白麻 羅布紅麻

2.4 不同濃度LiCl脅迫對羅布白麻和羅布紅麻種子耐鹽指數(shù)的影響

隨著鹽濃度增高，羅布白麻和羅布紅麻種子耐鹽指數(shù)呈下降趨勢，其中當LiCl濃度達200 mmol/L時，羅布白麻和羅布紅麻種子耐鹽指數(shù)均急劇下降，耐鹽指數(shù)分別均為0.06±0.01，LiCl濃度達400 mmol/L時耐鹽指數(shù)均為0。從耐鹽指數(shù)看，不同LiCl濃度梯度下，羅布白麻和羅布紅麻的耐鹽指數(shù)存在明顯差異，但在同一濃度LiCl脅迫下羅布白麻和羅布紅麻之間的耐鹽指數(shù)差異不顯著（P＜0.05，表 4）。

表4 不同濃度LiCl脅迫對羅布麻種子耐鹽指數(shù)的影響Table 4 Effects of LiCl concentration on salt tolerance index of A.venetum and A.hendersonii seeds

2.5 Li在羅布白麻和羅布紅麻植株中的積累與亞細胞分布特征

由表5可見，從羅布麻植株各部分Li+的積累量來看，兩個羅布麻品種葉中Li+的含量均明顯高于根、莖，不同器官中Li+的含量為葉＞莖＞根。比較兩個羅布麻品種發(fā)現(xiàn)，羅布白麻葉、根器官中Li+含量顯著高于羅布紅麻葉、莖，其中羅布白麻葉中Li+含量達1938.42±45.33mg/kg DW。羅布白麻莖中Li+含量略高于羅布紅麻，但差異并不顯著。

表5 羅布白麻和羅布紅麻植株不同器官中Li+含量Table 5 Li+content in different organs of A.venetum and A.hendersonii seedlings

在亞細胞水平上，羅布白麻和羅布紅麻根、莖、葉器官中Li+主要積累在細胞可溶組分。在羅布麻葉中，Li+在兩個種羅布麻細胞可溶組分的分配率分別為70.65%（羅布白麻）和65.15%（羅布紅麻）；Li+在兩個種羅布麻根、莖細胞可溶組分中所占比例（分配率為58.37-63.48%之間）低于在葉細胞可溶組分中所占比例。

表6 Li+在羅布白麻和羅布紅麻中的亞細胞分布Table 6 Subcellular distribution of Li+in A.venetum and A.hendersonii

3 討論與結(jié)論

鋰鹽LiCl脅迫條件下，羅布白麻和羅布紅麻種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均受到抑制，并且隨著鹽濃度的升高逐漸降低。LiCl濃度達200 mmol/L時，羅布紅麻和羅布白麻種子均保持有60%以上的發(fā)芽率；相對于與LiCl性質(zhì)較為接近的NaCl，以及Na2CO3等其他化學(xué)形態(tài)的鈉鹽［12，21］，羅布麻種子對LiCl具有更高的耐受性；相關(guān)的研究報道發(fā)現(xiàn)低濃度（≤50mmol/L）的鈉鹽能夠促進羅布麻種子的萌發(fā)、提高種子發(fā)芽率［14，21］。在本項研究中則發(fā)現(xiàn)在50mmol/L輕度Li+脅迫時，羅布白麻和羅布紅麻種子發(fā)芽率分別為90.1±1.57%和86.3±2.55%，均低于蒸餾水中種子的萌發(fā)率（99%以上），未發(fā)現(xiàn)低濃度LiCl脅迫對種子萌發(fā)有促進作用；不同種的羅布麻種子對鹽脅迫的敏感程度有差異，種子耐鹽性也不同。綜合現(xiàn)有的研究報道發(fā)現(xiàn)［12-14，23］：羅布白麻種子對鈉、鉀鹽脅迫的耐受性較高，并且無鹽環(huán)境更適宜于羅布麻種子的萌發(fā)。羅布麻對Li鹽的耐受特征與對Na、K鹽的耐受特征基本一致［24］，其中羅布白麻對LiCl鹽脅迫的耐受性也高于羅布紅麻。不同種的羅布麻在地理分布上的明顯差異可能也與其耐鹽能力密切相關(guān)，如羅布紅麻在西部地區(qū)、黃河沿岸、山東、江蘇、吉林等地均有廣泛分布；而羅布白麻則主要分布在新疆庫爾勒、喀什、阿克蘇等地荒漠化或鹽漬程度較為嚴重的區(qū)域。

Li被稱為21世紀的驅(qū)動力，但巨大的產(chǎn)業(yè)鏈也帶來嚴重的污染問題。植物生態(tài)修復(fù)是應(yīng)對Li等金屬污染的有效途徑之一。植物吸收的重金屬大部分分布在地上部，具有較高的地上部/根濃度比率；體內(nèi)某一元素濃度大于一定的臨界值（是普通植物在同一生長條件下的100倍）；在重金屬污染土壤上能正常生長，不會出現(xiàn)重金屬毒害現(xiàn)象，是超富集植物應(yīng)同時具備的3個基本特征［25，26］。已有的研究報道發(fā)現(xiàn)羅布紅麻是理想的Li+超富集植物［18，19］，我們通過比較試驗進一步證實羅布紅麻對Li+的強耐受能力，并且Li+主要在羅布紅麻葉器官中的超富集（1496.55 mg/kg Dw）；羅布白麻對Li+的耐受性和富集能力均要強于羅布紅麻，Li+同樣也主要富集在羅布白麻葉器官（1957.79 mg/kg Dw），與萵苣（lettuce plant）、薊屬植物 Cirsium arvense以及茄屬植物 Solanum dulcamera（1000 mg/kg Dw以上）［27，28］相比羅布麻屬的羅布紅麻和羅布白麻具有更高的 Li+富集能力。

Li+主要富集在羅布白麻和羅布紅麻的葉器官，說明植株對Li+具有較高的轉(zhuǎn)運效率。植物對元素的吸收利用中，Li+采用與K+相同的轉(zhuǎn)運載體系統(tǒng)［29］，這可能促進對Li+的吸收轉(zhuǎn)運，但羅布麻屬植物中Li+的轉(zhuǎn)運機制更有待進一步的深入研究。亞細胞區(qū)室化有助于植株應(yīng)對毒性離子危害［30，31］。與Cd等重金屬離子主要分布在植物細胞壁組分中不同［32］，羅布白麻和羅布紅麻細胞可溶性組分中Li+的含量最高。細胞壁中的果膠、多糖以及螯合蛋白等物質(zhì)能阻止重金屬離子進入細胞造成傷害，此外細胞可溶組分中的液泡等貯藏器官也能有效降低金屬離子對植株的毒害。Cd、Li等金屬離子在植株亞細胞組分中的分布不同可能與其化學(xué)性質(zhì)有關(guān)［33］。