γ-kokumi肽及其合成酶γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的研究進(jìn)展

伍圓明，伍倫杰，王 莉，林 璐，劉 義，孫偉峰，丁文武,

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽 421008）

隨著生活質(zhì)量水平的提高和個體飲食習(xí)慣的差異化發(fā)展，食品的味道和質(zhì)量受到了越來越多的關(guān)注，人們對食物味道的需求不再局限于單一的基本味覺體驗，還更多地追求豐富的味覺體驗及幸福愉悅的味道，而使人感到回味無窮、濃郁持久和極富層次感的濃厚味（kokumi）能極大程度地滿足這一需求。因此，在食品調(diào)味品領(lǐng)域中，kokumi已然成為了一個研究熱點。

Kokumi是繼五大基本味覺酸、甜、苦、咸、鮮之后新提出的第6種基本味覺候選之一[1]，主要代表食物味道的濃厚感（thickness）、飽滿感（mouthfulness）、持續(xù)性（continuity）及協(xié)調(diào)性（harmony of taste）[2]。kokumi物質(zhì)的特點是，當(dāng)添加到基本的味道溶液或食物中時，它們會提升5 種基本口味的協(xié)調(diào)性和呈味強度（特別是鮮味）。目前已報道的kokumi物質(zhì)多數(shù)為短肽類[3]，而在多項關(guān)于kokumi肽鑒定的研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵食物中濃厚味的主要貢獻(xiàn)者為γ-谷氨酰多肽（γ-kokumi肽）[4-11]并且與其他呈味分子，如寡糖、核苷酸等組合使用還能增強濃厚味、延長回味或提升鮮味強度，具有極大的開發(fā)價值和市場前景，因此，其生產(chǎn)應(yīng)受到更多的關(guān)注。

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT，EC 2.3.2.2）具有將γ-谷氨?；D(zhuǎn)移至受體分子上的特異性催化功能[12]，可直接催化合成γ-谷氨酰肽而受相關(guān)食品工業(yè)領(lǐng)域的廣泛重視，并且GGT已經(jīng)成功應(yīng)用于L-茶氨酸等重要γ-谷氨酰類化合物的生產(chǎn)中[13-16]，為γ-kokumi肽的酶法生產(chǎn)提供了有力的參考。

因此，本文對γ-kokumi肽結(jié)構(gòu)特征、食物來源、呈味評價方法、制備方法及食品中的應(yīng)用，以及GGT結(jié)構(gòu)特征、轉(zhuǎn)肽反應(yīng)催化機理及合成γ-kokumi肽的生產(chǎn)應(yīng)用等方面進(jìn)行了綜述，加深對γ-kokumi肽結(jié)構(gòu)與呈味的關(guān)系、GGT結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)肽活性的關(guān)系以及GGT合成γ-kokumi肽的現(xiàn)狀等科學(xué)和工程問題的認(rèn)識，以期為新型γ-kokumi肽的設(shè)計、γ-kokumi肽大規(guī)模生產(chǎn)和相關(guān)肽類增味產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的參考。

1 γ-kokumi肽概況

1.1 γ-kokumi肽的結(jié)構(gòu)及特征

γ-kokumi肽是具有kokumi特征的γ-谷氨酰肽，多為二肽或三肽。γ-谷氨酰肽分子結(jié)構(gòu)如圖1a所示，谷氨酸在α-C和γ-C上都連接有—COO-基團(tuán)，當(dāng)谷氨酸的γ-COO-與γ-谷氨?；荏w（R基團(tuán)）的NH3+脫水縮合形成γ位肽鍵時，即產(chǎn)生了γ-谷氨酰肽，其中R基團(tuán)可以為多肽或者游離氨基酸。例如最常見的γ-kokumi肽為谷胱甘肽（γ-Glu-Cys-Gly，GSH），其結(jié)構(gòu)由γ-谷氨?；c二肽-Cys-Gly組成（圖1b）。

γ-kokumi肽的結(jié)構(gòu)與其濃厚味強度密切相關(guān)。γ-kokumi肽N末端的γ-谷氨?；瞧涑蕽夂裎兜年P(guān)鍵基團(tuán)，Yusuke等[18]篩選二肽庫發(fā)現(xiàn)大多數(shù)γ-谷氨?；模é?Glu-X）具有濃厚味活性，而α-Glu-X幾乎都無濃厚味活性，三肽中也有類似的結(jié)論。γ-kokumi肽中間殘基和C-末端同樣對其濃厚味具有重要影響，當(dāng)中間殘基為中等大小的不帶電、非極性脂肪族殘基時（如Val、Leu等），表現(xiàn)出更高的濃厚味強度；C-末端殘基的結(jié)構(gòu)對其呈味影響相對較小，但其優(yōu)選為無側(cè)鏈的Gly時，可進(jìn)一步提升γ-kokumi肽濃厚味[18-19]。此外，殘基的側(cè)鏈中有含硫基團(tuán)也有助于提升γ-kokumi肽濃厚味強度[19]。這些關(guān)于肽結(jié)構(gòu)與呈味的關(guān)系的結(jié)論將為新型γ-kokumi肽的設(shè)計提供新的思路。

圖 1 γ-谷氨酰肽（a）及谷胱甘肽（b）[17]分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Molecular structures of γ-glutamyl peptides (a) and glutathione (b)[17]

1.2 γ-kokumi肽的來源

目前，大多數(shù)的γ-kokumi肽都是從常見的發(fā)酵食品、調(diào)味品或海鮮產(chǎn)品中分離鑒定獲得（表1）。1990年，Ueda等[20]從大蒜中分離獲得賦予濃厚味的物質(zhì)，鑒定結(jié)果表明大蒜中濃厚味的主要貢獻(xiàn)者為γ-谷氨酰肽，包括GSH和γ-谷氨?；?S-烯丙基-L-半胱氨酸（γ-Glu-S-allyl-Cys）等。隨后，Ueda等[21]又從洋蔥中分離鑒定出新的濃厚味物質(zhì)γ-谷氨?；?S-(1-丙烯基)-半胱氨酸亞砜。近年來，對菜豆[4]、Gouda干酪[22]等存在kokumi味道的成分分析發(fā)現(xiàn)，γ-kokumi肽物質(zhì)是其主要的味道提供者。Kuroda[6,23-24]和Miyamura[7,25-26]等陸續(xù)在商業(yè)魚醬、加工扇貝、醬油、釀造酒精飲料等食品中檢測鑒定獲得一種典型的γ-kokumi肽——γ-Glu-Val-Gly，并指出該肽對發(fā)酵食品感官品質(zhì)具有顯著影響[27]；后續(xù)的食品增味實驗結(jié)果也表明，γ-Glu-Val-Gly添加到低脂食品或雞肉清湯中能明顯提升其味道的飽滿感和持續(xù)性[9,27]。Zhao等[28]也在發(fā)酵的酸面團(tuán)中鑒定出6 種γ-kokumi肽（表1），這些肽是面團(tuán)濃厚感味的關(guān)鍵成分。最近，研究人員逐漸開始關(guān)注γ-kokumi肽的酶法合成，Yang Juan等[29-30]通過生物酶催化方法合成了多種系列的γ-kokumi肽，分別有γ-[Glu](n=1,2,3,4,5)-Phe、γ-[Glu](n=2,3,4)-Val和γ-[Glu](n=2,3,4)-Met，這些γ-kokumi肽都展現(xiàn)出濃厚的味道，并且能有效增強醬油的鮮味和連續(xù)性，以及雞肉清湯的濃厚感和飽滿感。

越來越多的γ-kokumi肽從不同的風(fēng)味食物中被鑒定獲得，并陸續(xù)地被驗證能賦予食物濃厚感、飽滿感、持續(xù)性等口感特性，展現(xiàn)出非常強的增味能力；因此，γ-kokumi肽具有進(jìn)一步開發(fā)成相關(guān)肽類食品風(fēng)味增強劑的巨大潛力。

表 1 γ-kokumi肽的序列及來源Table 1 Sequences and sources of γ-kokumi peptides

1.3 γ-kokumi肽的呈味評價方法

目前對γ-kokumi肽的呈味評價方法通常為感官評價法和鈣敏感受體（calcium-sensing receptor，CaSR）活性檢測法。

感官評價法因簡便、迅速、準(zhǔn)確分析樣品的優(yōu)點，被廣泛用作于呈味肽呈味效果的測定[36]。γ-kokumi肽的感官評價測定不同于基本味覺酸、甜、苦、咸、鮮肽的測定方式，原因在于自身的水溶液基本上不存在味道或者呈味效果較低，但是只需要少量添加至鮮味物質(zhì)（如谷氨酸鈉）中，即可顯著降低其鮮味閾值并提升鮮味溶液的連續(xù)性和口感。因此在采用感官評價法評價γ-kokumi肽的閾值時，將實驗品按照一定濃度梯度稀釋添加到基本的酸、甜、苦、咸、鮮的感官標(biāo)準(zhǔn)的單一溶液或者是混合液，按照一定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分，再根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析得出最終的感官評價結(jié)果。但是由于kokumi味物質(zhì)的呈味的復(fù)雜性，使用感官評價法難以滿足定量準(zhǔn)確的檢測，因此需要尋找更精確的檢測方式。

近年來，CaSR活性檢測法作為一種新型γ-kokumi肽的檢測方法逐漸受到學(xué)者的關(guān)注[37-38]。CaSR作為人體感知kokumi物質(zhì)受體，與基本味覺的受體有味覺信號功能偶聯(lián)性。Brennan等[39]對kokumi類物質(zhì)的信號傳遞做出以下猜想：CaSR在接收到kokumi物質(zhì)受體時，接收刺激釋放Ca2+增加胞內(nèi)濃度，產(chǎn)生一系列的味覺信號傳導(dǎo)，如增加ATP釋放加強接收鮮味物質(zhì)的信號，從而達(dá)到降低鮮味物質(zhì)閾值的效果。Ohsu等[38]合成一系列γ-谷氨酰肽，采用CaSR結(jié)合感官評價檢測法檢測kokumi呈味效果，結(jié)果表明經(jīng)過感官驗證確定的γ-kokumi肽均能激活CaSR，且呈味閾值的高低與激活CaSR的激活力密切相關(guān)。后來，Yusuke[18]和Kuroda[40]等進(jìn)一步研究了CaSR的感應(yīng)機制，檢測了一系列人工合成的γ-kokumi肽，結(jié)合感官評價驗證，發(fā)現(xiàn)γ-kokumi肽的閾值越低，刺激CaSR釋放Ca2+的能力越強。由此表明CaSR活性檢測法可作為一種新型γ-kokumi肽的檢測方式。但是CaSR方法檢測存在一定局限性，因為CaSR易受到某些陽離子、堿性肽類和多胺類物質(zhì)的刺激釋放Ca2+導(dǎo)致檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確性[41-42]。因此CaSR活性檢測法通常是與感官評價法共同使用對kokumi物質(zhì)進(jìn)行檢測。

1.4 γ-kokumi肽的制備

盡管γ-kokumi肽具有非常強的增味功能，但是市場上γ-kokumi肽類食物增味劑非常少，僅有GSH或富含GSH的酵母提取物成功商業(yè)化并用于增強食物的濃厚味[43-45]，其中最重要的一個原因是γ-kokumi肽的大規(guī)模生產(chǎn)能力較低。目前制備γ-kokumi肽方法主要有化學(xué)合成、微生物發(fā)酵和酶法合成。

化學(xué)合成法以簡單底物作為原料進(jìn)行合成γ-kokumi肽，例如Yusuke等[18]通過N-α-芐氧羰基保護(hù)γ-谷氨?；⒅饌€地將Glu、Val、Gly殘基縮合到主鏈制備γ-Glu-Val-Gly，最終得率為54%，但化學(xué)合成由于反應(yīng)途徑長、基團(tuán)修飾操作復(fù)雜、成本高、化學(xué)物毒性等問題，不適用于γ-kokumi肽的工業(yè)化水平大規(guī)模生產(chǎn)。由于當(dāng)前大部分γ-kokumi肽來源于發(fā)酵風(fēng)味食品，傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵也是獲得γ-kokumi肽濃厚味物質(zhì)有效選擇之一。然而目前常見的發(fā)酵風(fēng)味食品都是傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵，存在時間長、產(chǎn)量低、純化難，工業(yè)化難度較高等問題，僅有少許γ-kokumi肽，如GSH通過液態(tài)發(fā)酵實現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)，且優(yōu)化發(fā)酵工藝提高了其產(chǎn)量[46]，但產(chǎn)物分離純化難等問題亟待解決。酶法合成是通過生物酶催化合成γ-kokumi肽。文獻(xiàn)中已報道的酶主要有兩種：1）谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）。該酶具有一定的γ-谷氨?；D(zhuǎn)移活性[47-48]，有少數(shù)學(xué)者通過谷氨酰胺酶合成γ-kokumi肽，用于提升食物風(fēng)味[29-30,49]。但谷氨酰胺酶受體的底物特異性較差，γ-谷氨?；D(zhuǎn)移活性較低，難以用于γ-kokumi肽的工業(yè)化生產(chǎn)。2）GGT。GGT屬于轉(zhuǎn)移酶而不是合成酶，它不需要ATP等能量來源，并且酶活力較高，具有大規(guī)模生產(chǎn)γ-kokumi肽的應(yīng)用前景。關(guān)于GGT轉(zhuǎn)肽催化生產(chǎn)重要γ-谷氨酰類化合物如：L-茶氨酸、γ-谷氨酰-多巴等[13-15]的研究已經(jīng)比較成熟，為GGT催化生產(chǎn)γ-kokumi肽提供了強有力的參考。

綜上所述，在γ-kokumi肽的制備中，由于化學(xué)合成的步驟復(fù)雜、成本高以及傳統(tǒng)發(fā)酵法的產(chǎn)量低、純度低等缺點，酶法合成被視為一種有效的、低成本的生產(chǎn)手段。其中，GGT因具有較強的轉(zhuǎn)肽活性而在γ-谷氨酰類化合物的合成中備受重視，使用GGT生產(chǎn)γ-kokumi肽將有效促進(jìn)γ-kokumi肽的生產(chǎn)及在食品調(diào)味中的應(yīng)用。

2 γ-kokumi肽合成酶GGT

2.1 GGT的來源及結(jié)構(gòu)分析

GGT也稱“谷氨?；D(zhuǎn)移酶”或“谷酰轉(zhuǎn)肽酶”，從20世紀(jì)中葉開始，人們從細(xì)菌、植物、動物中相繼發(fā)現(xiàn)GGT，如奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，Pm）GGT[50]、大腸桿菌（Escherichia coli，Ec）GGT[51]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，Bs）GGT[52]、幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，HpGGT）[53]、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis，Bl）GGT[54]和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens，Ba）GGT[55]、洋蔥和老鼠、牛、馬、人（human GGT，HGGT）的肝、腎、胰提取物等[50,56]。GGT在原核生物和真核生物的分布情況具有一定的差異性，真核生物中GGT定位于細(xì)胞膜，原核生物中則分布在周質(zhì)空間或者被分泌到細(xì)胞外[57-58]。正是由于這種分布的差異性，原核生物來源的GGT更便于提取和純化，因此在工業(yè)生產(chǎn)中主要采用原核來源的GGT進(jìn)行生產(chǎn)γ-谷氨酰基化合物，如采用EcGGT酶法合成γ-谷氨酰類化合物茶氨酸[51,59]，或?qū)sGGT添加到“moromi”半固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵液中可提升成品的醇厚滋味感[60]。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)得到了全新的突破，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的分辨率越來越高，有助于深入理解蛋白結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。近年來，多個研究團(tuán)隊解析了不同來源的GGT晶體結(jié)構(gòu)，以期從接近原子水平的精密結(jié)構(gòu)解釋其生化特性存在的差異性。對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的GGT序列比對（圖2）和結(jié)構(gòu)比對（圖3）分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)活性中心區(qū)域空間構(gòu)象的不同可以分成兩類。

第一類為帶有“活性開關(guān)裝置”活性中心的GGT，如HGGT（PDB：4Z9O）[61]、HpGGT（PDB：2QM6）[62]、EcGGT（PDB：2DBU）[63]等。以EcGGT活性中心結(jié)構(gòu)為例（圖3a），其活性中心是一個有“封口的口袋”，該結(jié)構(gòu)的形成是由于：GGT自裂解催化過程中，位于活性中心的EcGGT的大亞基C端末尾氨基酸（第375～390位）圍繞Ile378發(fā)生偏轉(zhuǎn)，并遠(yuǎn)離小亞基N端Thr 30?以上?？粘鰜淼膮^(qū)域形成一個能夠接受γ-谷氨酰化合物的活性口袋，并且活性口袋的上方存在大部分真核細(xì)胞中才會存在的“蓋子-突環(huán)”結(jié)構(gòu)（lid-loop）[64]，該loop結(jié)構(gòu)柔性較大，形成一個活性開關(guān)裝置，控制著底物和產(chǎn)物進(jìn)出的速率。第二類為“開放式”活性中心GGT，如BsGGT（PDB：3A75）[64]和BlGGT（PDB：4OTT）（圖3b）[65]等。與第一類GGT活性中心區(qū)別在于，這類GGT在自在酶自成熟的過程中大亞基的C端末尾在成熟前后沒有發(fā)生偏移構(gòu)象的改變，位于小亞基的N端附近，并且在活性中心上方不存在lid-loop結(jié)構(gòu)，從而形成開放式的活性中心結(jié)構(gòu)。

圖 2 不同來源GGT序列比對[50-55,61]Fig. 2 Alignment of GGT sequences from different sources[50-55,61]

圖 3 EcGGT（a）[63]和BlGGT（b）[65]的三維結(jié)構(gòu)差異Fig. 3 Three-dimensional structural differences between EcGGT (a) and BlGGT (b)

對GGT活性中心及周邊區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，存在活性中心上方的lid-loop結(jié)構(gòu)起著隔離活性中心和外部環(huán)境的作用，在酶催化反應(yīng)過程中作為底物和產(chǎn)物進(jìn)出的開關(guān)[62]。而控制lid-loop結(jié)構(gòu)靈活的關(guān)鍵性氨基酸為蓋環(huán)頂點處的芳香族氨基酸[62,66]。原核生物以EcGGT為例（圖4a），lid-loop上保守的Tyr444上的酚羥基與保守的Asn411的側(cè)鏈酰胺官能團(tuán)形成氫鍵保持lid-loop的空間位置，從而起到保護(hù)活性中心的功能[67]。而HGGT的酶活力高于原核生物來源的GGT，原因在于lid-loop中心處EcGGT Tyr444所對應(yīng)的氨基酸殘基為Phe433，該殘基不存在酚羥基，因此不能形成氫鍵（圖4b），這樣增加了lid-loop的靈活性，有利于底物的進(jìn)入和產(chǎn)物的釋放[68]。Terzyan等[61]對HGGT進(jìn)行結(jié)晶進(jìn)一步證明HGGT不含上述可以固定lid-loop結(jié)構(gòu)的氫鍵（圖4b），從而導(dǎo)致HGGT的lid-loop柔性較高，具有有高遷移率。Calvio等[69]也對lid-loop結(jié)構(gòu)的作用進(jìn)行進(jìn)一步探究，將EcGGT上的lid-loop結(jié)構(gòu)通過基因設(shè)計到BsGGT中，在突變體BsGGT催化反應(yīng)過程中，lid-loop結(jié)構(gòu)展現(xiàn)出優(yōu)先允許小分子γ-谷氨酰底物進(jìn)入酶的活性中心而大分子后進(jìn)入的調(diào)控功能，并且突變過后BsGGT的酶活力和穩(wěn)定性比原酶顯著提升，酶穩(wěn)定性增高的原因可能是lid-loop結(jié)構(gòu)對活性中心有一定的保護(hù)作用。以上的研究發(fā)現(xiàn)有助于選擇用于生產(chǎn)γ-kokumi肽及其他γ-谷氨?；衔餅槟康漠a(chǎn)物的GGT，還為設(shè)計具有高酶活力的突變體GGT提供一定參考意見。

圖 4 EcGGT（a）[63]和HGGT（b）[61]的lid-loop結(jié)構(gòu)差異Fig. 4 Lid-loop structural differences between EcGGT (a)[63]and HGGT (b)[61]

2.2 GGT的成熟機制

圖 5 EcGGT自催化剪切過程[63]Fig. 5 Autocatalytic cleavage process of EcGGT[63]

GGT屬于N末端親核水解酶家族的成員之一，這類酶家族成員的共同特點是：轉(zhuǎn)錄翻譯生成的前體蛋白沒有酶活力，需要激活N端的Ser或者是Thr進(jìn)行自催化裂解后才能產(chǎn)相應(yīng)生酶活力，稱為自催化裂解成熟機制[63,70-71]。在GGT的自催化裂解過程中，其關(guān)鍵氨基酸為小亞基N端高度保守的Thr[63,72]。Okada等[63,73]使用Ala將EcGGT小亞基N端Thr取代，獲得的突變體T391A在形成二聚體過后沒有酶活力，Pica[74]、Murty[75]、Kristin[76]等采用類似的方法對BlGGT、BsGGT等不同來源的GGT進(jìn)行突變驗證，也得到相同的結(jié)果。以上研究表明小亞基N端的Thr對GGT自催化裂解反應(yīng)起著關(guān)鍵性的作用。GGT自催化裂解具體過程如圖5所示，GGT基因首先通過轉(zhuǎn)錄翻譯形成前體蛋白，小亞基N端的Thr作為親核試劑進(jìn)攻大亞基C端的羰基形成過渡狀態(tài)的四面體中間體，Thr上的氨基通過質(zhì)子化裂解C—N形成酯中間體，最后細(xì)胞基質(zhì)中的水作為活性劑進(jìn)攻中間體的羰基，前體蛋白裂解成為二聚體。二聚體的大亞基分子質(zhì)量通常為38～72 kDa，小亞基的分子質(zhì)量為20～66 kDa。

2.3 GGT的催化機理

小亞基N端高度保守的Thr不僅是GGT前體蛋白自催化裂解成熟的關(guān)鍵氨基酸，也是GGT催化反應(yīng)中進(jìn)攻底物的關(guān)鍵催化位點。GGT在催化反應(yīng)屬于乒乓反應(yīng)機制，分為?；磻?yīng)和去酰反應(yīng)兩個步驟（圖6）[72,77-79]。?；磻?yīng)：首先是γ-谷氨酰底物進(jìn)入GGT的活性中心，GGT小亞基N端上的Thr羥基氧原子親核進(jìn)攻底物上γ-谷氨酰的羰基肽，形成γ-谷氨?；?GGT中間體[80]；去酰化反應(yīng)[12]：水、氨基酸或者多肽類（一般為二肽或者三肽）等作為親核試劑物質(zhì)進(jìn)入GGT活性中心進(jìn)攻γ-谷氨酰基-GGT四面體中間體的羰基，中間體鍵斷裂從而生成新的γ-谷氨?；衔?。根據(jù)去?；H和試劑的種類不同分為水解反應(yīng)、轉(zhuǎn)肽反應(yīng)和自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。GGT反應(yīng)類型與所處環(huán)境的pH值密切相關(guān)相關(guān)，水解反應(yīng)在酸性或者中性條件下進(jìn)行，而轉(zhuǎn)肽反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行。

圖 6 GGT的催化機理及反應(yīng)類型[63]Fig. 6 Catalytic mechanism and reaction type of GGT[63]

2.4 GGT轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的應(yīng)用

目前已有報道表明，使用GGT可成功催化生產(chǎn)多種γ-谷氨酰類化合物，如：L-茶氨酸、γ-谷氨酰-多巴等[13-15]，但是GGT在堿性條件下極易發(fā)生不可逆的變性失活，限制其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。彭清等[15]發(fā)現(xiàn)GGT在高pH值下容易失活的原因是亞基解聚導(dǎo)致活性中心構(gòu)象發(fā)生改變[81]，為穩(wěn)定GGT的亞基結(jié)構(gòu)，在遠(yuǎn)離酶活性中心的亞基表面選擇合適的位點進(jìn)行改造，增強亞基的疏水性能，最終得到穩(wěn)定性較強的突變酶Y280V比原酶在高pH值下活力提高至58%以上。Keillor[12]及Carlo[82]等發(fā)現(xiàn)GGT在堿性條下進(jìn)行轉(zhuǎn)肽反應(yīng)時，自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)也存在，這導(dǎo)致得到的產(chǎn)物產(chǎn)量和純度較低。因此，在GGT工程化方面，如何降低自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的發(fā)生以及提高轉(zhuǎn)肽反應(yīng)效率從而提高產(chǎn)物量是當(dāng)前亟待解決的重要問題。

最近，Lin Longliu[65]、Lin Minguan[83]等發(fā)現(xiàn)來源于地衣芽孢桿菌的BlGGT轉(zhuǎn)肽酶活力較高，對其活性口袋中的關(guān)鍵位點和周圍的氨基酸空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖7），發(fā)現(xiàn)BlGGT活性中心結(jié)構(gòu)由周圍殘基形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)所固定，其中，構(gòu)成氫鍵網(wǎng)絡(luò)的保守殘基Asn450對活性中心的穩(wěn)定具有重要影響，對該點活性改造設(shè)計得到的突變體N450D不僅明顯提高轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的催化能力，還將轉(zhuǎn)肽反應(yīng)/水解反應(yīng)比例從3.5最高提升到18。Bindal等[84]對Arg109的定點突變研究發(fā)現(xiàn)，其帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)對底物的結(jié)合和自轉(zhuǎn)肽催化至關(guān)重要，突變體R109K自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的活性降低，轉(zhuǎn)肽反應(yīng)合成茶氨酸效率得到了明顯的提高。Pica[74]、Nakajima[85]和Chi Mengchun[86]等則對Arg109在BlGGT活性中心的具體作用進(jìn)行了研究，改造與活性中心Arg109側(cè)鏈相互作用的Gly482和Gly482，酶的整體構(gòu)象幾乎沒有發(fā)生改變，但是活性中心的Arg109空間位置發(fā)生較大偏移從而導(dǎo)致對酶活性產(chǎn)生了影響。由于GGT催化的相似性，其他來源的GGT可參考上述結(jié)果進(jìn)行酶工程改造以提高轉(zhuǎn)肽活性和降低自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)活性，為生產(chǎn)γ-kokumi肽提供良好的酶催化劑。

圖 7 BlGGT活性中心的關(guān)鍵殘基[65,74,83-84,86]Fig. 7 Key residues in the active center of BlGGT[65,74,83-84,86]

3 GGT合成γ-kokumi肽的應(yīng)用

3.1 GGT合成γ-kokumi肽的優(yōu)勢

GGT具有獨特轉(zhuǎn)肽催化特性，對于γ-谷氨酰類化合物特別是γ-kokumi肽的工業(yè)化生產(chǎn)非常有意義。相較于其他合成方法，使用GGT作為生物酶催化劑生產(chǎn)γ-kokumi肽具有多方面的優(yōu)勢[87]：1）和化學(xué)合成法相比，GGT催化合成無需對氨基酸或其他活性基團(tuán)進(jìn)行基團(tuán)保護(hù)和去保護(hù)操作，酶僅同γ-谷氨?；w和受體相互作用，反應(yīng)過程簡單；2）GGT屬于轉(zhuǎn)移酶而不是合成酶，進(jìn)行催化時不需要ATP、金屬陽離子等能量物質(zhì)或輔助因子；3）GGT對γ-谷氨?；荏w的底物特異性非常廣泛，添加不同的受體即可生成相應(yīng)的γ-谷氨酰類化合物；4）細(xì)菌來源的GGT以未糖基化修飾的可溶性蛋白形式存在于細(xì)胞的周質(zhì)空間或胞外，因此細(xì)菌來源的GGT比較容易獲得；5）不同于哺乳動物來源的GGT，細(xì)菌來源的GGT轉(zhuǎn)肽催化時能使用較廉價的γ-谷氨酰基供體，如谷氨酰胺等，可有效地降低生產(chǎn)成本。

3.2 GGT合成γ-kokumi肽實際應(yīng)用

在21世紀(jì)之前，γ-谷氨酰肽的kokumi味性質(zhì)未被廣泛了解，GGT曾作為一種風(fēng)味改善酶進(jìn)行研究，證實該酶可改善食物的整體風(fēng)味并能減弱苦味氨基酸的苦味[35,88-89]。近10 年來，對于GGT合成γ-kokumi肽并改善食品風(fēng)味的可行性研究報道逐漸增多。2009年，Toelstede等[5]研究證明青霉菌（Penicillium roqueforti）來源的GGT直接參與了藍(lán)色脈紋奶酪中γ-kokumi肽的合成，對奶酪的濃厚味具有重要的貢獻(xiàn)作用。Hillmann等[10]也證實牛奶原料中的GGT是帕瑪森芝士成熟過程中濃厚味物質(zhì)——γ-kokumi二肽形成的關(guān)鍵因素。類似地，van Ho等[60]在日本發(fā)酵豆醬中添加BsGGT合成γ-kokumi肽以提升豆醬的濃厚感味，結(jié)果表明γ-Glu-Val和γ-Glu-Val-Gly兩種γ-kokumi肽濃度分別提高到70 μmol/L和16 μmol/L，同時提升了產(chǎn)品的鮮味，增強了豆醬的風(fēng)味。

GGT催化合成γ-kokumi肽的能力得到驗證后，研究人員逐步開始通過添加特異性γ-谷氨?；荏w的方式用GGT催化合成特定的γ-kokumi肽。Suzuki等[35]以細(xì)菌來源的GGT為生物催化劑合成γ-Glu-Phe，在Gln和Phe濃度200 mmol/L、酶活力0.5 U/mL、pH 10.4及溫度37 ℃的條件下反應(yīng)1.5 h，最終γ-Glu-Phe的產(chǎn)率為70%，遠(yuǎn)高于化學(xué)合成；隨后，Suzuki等[33]按照同樣的方法，優(yōu)化反應(yīng)條件后，GGT催化合成γ-Glu-Val的產(chǎn)率高達(dá)88%。2012年，Speranza等[31]通過添加不同受體的方式成功合成了γ-Glu-S-allyl-Cys和γ-Glu-Met及其衍生物，但γ-kokumi肽的產(chǎn)率較低，可能的原因是該實驗中GGT來源于馬腎，轉(zhuǎn)肽反應(yīng)活性較低。近些年，Lee[34]、Chi Mengchun[86]、Chen Yiyu[90]等使用BlGGT逐步合成了γ-Glu-S-allyl-Cys、γ-Glu-Phe和γ-Glu-Leu 3 種γ-kokumi肽，并通過條件優(yōu)化提高這些肽的產(chǎn)量；值得注意的是，該團(tuán)隊還研究了BlGGT的固定化催化應(yīng)用[91]，通過共價鍵或非共價鍵的方式將BlGGT固定在氧化石墨烯納米片上催化合成γ-Glu-Phe和γ-Glu-Leu，最終產(chǎn)物收率都超過31%，其中共價固定的GGT在30 d的儲存期間具有與游離酶相當(dāng)?shù)拿阜€(wěn)定性，可以循環(huán)催化9 次，9 次使用后其酶活力約為初始酶活力的45.3%。另外，Suzuki等[92]創(chuàng)新性地將谷氨酰胺酶和GGT組成雙酶合成系統(tǒng)，添加到麥麩和大豆蛋白后高效進(jìn)行γ-谷氨酰物水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，最終生產(chǎn)獲得濃厚味較強的增味劑?？偟貋碚f，由于GGT具有以上諸多優(yōu)點，利用GGT催化是合成γ-kokumi肽的一種有效的、低成本的生產(chǎn)手段，并且結(jié)合酶工程改造、酶固定化催化及雙酶合成系統(tǒng)等工程化策略能有效提高GGT生產(chǎn)能力，并降低生產(chǎn)成本，有助于酶法合成γ-kokumi肽的工業(yè)化生產(chǎn)。

4 結(jié) 語

前期關(guān)于γ-kokumi肽結(jié)構(gòu)特征、調(diào)味應(yīng)用及酶法合成的研究取得了很大的進(jìn)步，但仍然有許多科學(xué)及工程等各方面的問題值得進(jìn)一步研究。1）γ-kokumi肽的穩(wěn)定性和安全性。由于γ-kokumi肽的目標(biāo)是開發(fā)相關(guān)肽類增味劑，在產(chǎn)品貯藏、消費以及食用過程中其穩(wěn)定性和安全性應(yīng)得到高度重視，相配套的食品準(zhǔn)入門檻和定性、定量分析檢測標(biāo)準(zhǔn)也需同步進(jìn)行探索和研究。2）γ-kokumi肽的三維構(gòu)象特征。關(guān)于γ-kokumi肽二級結(jié)構(gòu)與呈味的關(guān)系研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但更為重要的三維構(gòu)象特征未被清楚認(rèn)識，而γ-kokumi肽正是因為特殊的三維構(gòu)象才能激活kokumi受體并傳遞信號，產(chǎn)生濃厚味；因此，應(yīng)加強基于kokumi受體的γ-kokumi肽三維結(jié)構(gòu)特征分析，從分子層面理解γ-kokumi肽呈味機制，也為新型γ-kokumi肽的設(shè)計和挖掘提供參考。3）GGT合成γ-kokumi肽的效率和產(chǎn)量還有待提高。目前文獻(xiàn)已報道的GGT催化合成γ-kokumi肽幾乎都處于實驗室級生產(chǎn)水平，還未找到同時滿足高轉(zhuǎn)化率、高產(chǎn)量、高強度的GGT，后續(xù)的研究可以通過篩選高活性的GGT和GGT酶工程改造，或結(jié)合液態(tài)發(fā)酵、固定化酶等工程化策略提高γ-kokumi肽的合成效率和強度，同時加強生產(chǎn)工藝的研究提高其產(chǎn)量，為γ-kokumi肽低成本、高產(chǎn)量的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

雖然國內(nèi)對于γ-kokumi肽的研究起步較晚，但也有多個優(yōu)秀的研究團(tuán)隊在開展相關(guān)工作，隨著多方面問題的深入研究，會有更多的濃厚味增味劑出現(xiàn)在餐桌上，為我們創(chuàng)造更綠色、健康、美味的幸福生活。