頭孢拉定對(duì)尾草履蟲形態(tài)和種群數(shù)量的影響研究

劉曉航，李璟，謝明松，黃宇飛

（成都理工大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610059）

水環(huán)境中藥物的殘留問(wèn)題對(duì)當(dāng)前水體安全而言是一個(gè)新的挑戰(zhàn)[1]?，F(xiàn)有污水處理工藝主要是消除常規(guī)化學(xué)污染物如COD、BOD等[2-5]，并沒有明確針對(duì)抗生素類藥物（如頭孢類、磺胺類等）的處理方法。這類藥物在城市生活污水、動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)污水、醫(yī)院污水、地表水、地下水、飲用水、海水等水體中均有檢出[6-8]。據(jù)報(bào)道，水環(huán)境抗生素污染不僅可能誘導(dǎo)耐藥性致病菌的產(chǎn)生，毒害水生生物，而且可通過(guò)污染飲用水、土壤和食物等對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在危害[1，7]。

頭孢類抗生素是當(dāng)今世界上研發(fā)最活躍、應(yīng)用最廣泛的抗生素類藥物，關(guān)于其在水環(huán)境中行為規(guī)律的研究報(bào)道較少，僅有對(duì)水環(huán)境細(xì)菌、大型生物影響的報(bào)道[8]。頭孢類抗生素對(duì)水生生物的生態(tài)毒性研究多以魚類和藻類等多細(xì)胞動(dòng)物或植物為對(duì)象，對(duì)原生動(dòng)物的影響研究鮮有報(bào)道。原生動(dòng)物以藻類、細(xì)菌及有機(jī)物碎屑為食，處于食物鏈底部，在水生生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中具有重要作用；同時(shí)原生動(dòng)物對(duì)環(huán)境因子敏感，可將毒性效應(yīng)沿食物鏈傳遞[9]。尾草履蟲是原生動(dòng)物中較早用于毒理學(xué)研究的模式生物，具有體積小、生命力強(qiáng)、易于培養(yǎng)等特點(diǎn)。本研究以尾草履蟲（Paramecium caudatum）為研究對(duì)象，探索其在頭孢拉定水環(huán)境中的響應(yīng)，以期對(duì)環(huán)境污染防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和受試生物 頭孢拉定（RAD），純度97%，購(gòu)自齊魯制藥有限公司。

尾草履蟲，購(gòu)自山東某公司。草履蟲母液為預(yù)先用稻草培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d的草履蟲。

1.2 主要儀器 恒溫恒濕培養(yǎng)箱、微量移液器、高壓滅菌鍋、抽濾漏斗等。

1.3 抗生素的配制 先取頭孢拉定以蒸餾水為溶劑配制成10 g/L原液，頭孢拉定對(duì)尾草履蟲 的作用濃度梯度設(shè)置為0、10、30、50、100、300 μg/mL。

1.4 培養(yǎng)基的配制 稻草浸出液培養(yǎng)基制作方法：干稻草10 g加入蒸餾水中煮沸5 min，定容至1 000mL。

1.5 毒性效應(yīng)試驗(yàn)方法

1.5.1 頭孢拉定對(duì)尾草履蟲形態(tài)的影響 向配制好的10 g/L稻草培養(yǎng)基中加入不同濃度的頭孢拉定抗生素，使其終濃度分別為0、10、30、50、100、300 μg/mL，然后分別向其中加入0.1 mL草履蟲母液，置于20 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5 d。第5 d時(shí)每個(gè)培養(yǎng)基各取5 mL，經(jīng)飽和升汞溶液固定后，于3 000 r/min離心5 min，收集沉淀斑在光學(xué)顯微鏡下觀察。每組隨機(jī)選10個(gè)草履蟲，在顯微鏡下測(cè)量細(xì)胞大小，統(tǒng)計(jì)并進(jìn)行方差分析。

1.5.2 頭孢拉定對(duì)尾草履蟲種群數(shù)量的影響 向配制好的10g/L稻草培養(yǎng)基中加入不同濃度的頭孢拉定抗生素，使其終濃度分別為0、10、30、50、100、300 μg/mL，然后分別向其中加入0.1 mL草履蟲母液，置于20 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，每24 h在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄尾草履蟲的活體數(shù)量，持續(xù)記錄7 d，每個(gè)頭孢拉定濃度組做5個(gè)平行試驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)分析 使用Origin 2018軟件統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行方差分析檢驗(yàn)差異顯著性和誤差分析。使用ImageJ圖像處理軟件對(duì)草履蟲個(gè)體形態(tài)進(jìn)行測(cè)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 頭孢拉定對(duì)尾草履蟲個(gè)體形態(tài)的影響 頭孢拉定對(duì)尾草履蟲個(gè)體形態(tài)的影響結(jié)果如表1所示。在本試驗(yàn)頭孢濃度范圍內(nèi)，尾草履蟲個(gè)體的體長(zhǎng)隨著頭孢拉定濃度的增加而減小，而體寬變化不明顯。在高效氯氰菊酯對(duì)草履蟲的個(gè)體生長(zhǎng)以及2，4-D丁酯對(duì)草履蟲的影響研究[10]中也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果。

表1 頭孢拉定對(duì)尾草履蟲個(gè)體形態(tài)的影響 μm

圖1 各濃度頭孢拉定條件下尾草履蟲種群數(shù)量的變化

2.2 頭孢拉定對(duì)尾草履蟲種群數(shù)量的影響 各濃度頭孢拉定對(duì)尾草履蟲種群數(shù)量的影響結(jié)果如圖1所示。整體而言，隨著頭孢拉定濃度的增加，尾草履蟲的種群數(shù)量遞減。在頭孢拉定濃度為0、10、30 μg/mL時(shí)，尾草履蟲種群數(shù)量的峰值出現(xiàn)在第5 d；在頭孢拉定濃度為50 μg/mL時(shí)，尾草履蟲種群數(shù)量的峰值出現(xiàn)在第4 d；當(dāng)頭孢拉定濃度為300 μg/mL時(shí)，該組已觀察不到尾草履蟲?？梢婋S頭孢拉定濃度的增加，尾草履蟲的種群數(shù)量遞減，且響應(yīng)時(shí)間縮短。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，10 μg/mL頭孢拉定組的尾草履蟲數(shù)量與對(duì)照組（0 μg/mL頭孢拉定）相比差異不顯著（P＝0.066 5）；30、50、100 μg/mL頭孢拉定組與對(duì)照組相比差異顯著（P值分別為0.010 8、0.002和0.000 4，均小于0.05）。隨著頭孢拉定濃度的增加，與對(duì)照組的差異越明顯，說(shuō)明頭孢拉定對(duì)尾草履蟲有明顯的抑制作用。

頭孢拉定為廣譜抗生素，作用機(jī)制與其他頭孢菌素相似，主要抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有殺滅作用[11]。尾草履蟲作為原生動(dòng)物沒有細(xì)胞壁，而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)頭孢拉定對(duì)尾草履蟲有明顯的抑制作用，因此頭孢拉定可能存在某種能夠抑制尾草履蟲生長(zhǎng)的作用機(jī)制。在四環(huán)素及鹽酸四環(huán)素對(duì)尾草履蟲的毒性效應(yīng)研究[12]，幾種新生污染物對(duì)嗜熱四膜蟲的分子生態(tài)毒性研究以及四環(huán)素類抗生素對(duì)纖毛蟲的毒性效應(yīng)研究中，同樣發(fā)現(xiàn)了原生動(dòng)物在受抗生素脅迫時(shí)生長(zhǎng)發(fā)育均受到抑制。說(shuō)明抗生素的使用對(duì)原生動(dòng)物的生存環(huán)境以及整個(gè)生態(tài)環(huán)境存在影響。

3 結(jié)論

原生動(dòng)物尾草履蟲具有明顯的死亡特征，易于養(yǎng)殖，容易鑒定和觀察。本研究發(fā)現(xiàn)頭孢拉定對(duì)原生動(dòng)物尾草履蟲具有毒性效應(yīng)，可以改變尾草履蟲的數(shù)量和形態(tài)。以頭孢拉定為代表的頭孢類抗生素的濫用，可能對(duì)生物鏈具有潛在影響，因此必須重視對(duì)抗生素生物學(xué)和環(huán)境毒性的監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)。