攜IL-8單克隆抗體靶向造影劑對(duì)兔VX2肝癌超聲成像的實(shí)驗(yàn)研究

陳建福，徐飛，張湘敏，楊寒凝，楊媛，陸永萍★

(1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南 大理；2. 云南省第二人民醫(yī)院超聲科，云南 昆明)

0 引言

原發(fā)性肝癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是死亡率極高的惡性腫瘤，而我國每年肝癌死亡人數(shù)占據(jù)全球總構(gòu)成的50%以上[1-2]。肝癌早期無顯著臨床特征，多數(shù)患者于中晚期檢出，失去了肝移植或手術(shù)切除的最佳時(shí)機(jī)[3]。因此，如何早期快速而準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)、診斷肝癌已成為臨床攻克肝癌的重中之重。

超聲顯像是肝臟腫瘤的傳統(tǒng)檢查方法之一，隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，超聲造影已展示出廣闊的應(yīng)用前景，超聲造影提高了臨床可疑肝臟占位性病變的早期檢出率及其良惡性鑒別診斷的準(zhǔn)確性，是肝癌早期診斷的主要影像學(xué)手段之一[4]。本研究采用IL-8單克隆抗體（簡稱“IL-8單抗”）偶聯(lián)SonoVue聲學(xué)微泡合成新型靶向微泡造影劑，通過肝臟腫瘤組織內(nèi)靶向造影劑各時(shí)相顯影分析，研究傳統(tǒng)超聲造影劑聯(lián)合IL-8單抗靶向顯影在肝癌診斷效能中的應(yīng)用，為臨床研究和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年日本大耳兔42只，荷瘤兔2只，雌雄不限，體質(zhì)量（2.5±0.5）kg，均由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?/h3>

以3%戊巴比妥鈉將實(shí)驗(yàn)兔麻醉，仰臥位固定，分離皮膚和皮下組織，充分暴露左肝葉并固定，使用15G穿刺針將腫瘤顆粒（取自荷瘤兔）注入肝葉的背離腹壁面，確定腫瘤顆粒包埋于肝組織后退針，同時(shí)使用明膠海綿壓迫切口止血，術(shù)后肌注40萬單位抗生素預(yù)防感染。采用此改良開腹包埋法[5]，對(duì)42只日本大耳兔行瘤塊種植，建立理想VX2 肝癌模型（腫瘤最大徑＞1cm）。

1.3 靶向造影劑的制備

IL-8單抗通過異型雙功能交聯(lián)劑（SPDP）偶聯(lián)SonoVue聲學(xué)微泡，即共價(jià)偶聯(lián)法。制成微泡懸液，并經(jīng)玻片凝集實(shí)驗(yàn)[6]鑒定，成功制備靶向造影劑。

1.4 儀器設(shè)備

意大利百勝公司（EsaoteMylab Twice）超聲診斷儀；選用頻率為5.0-8.0MHz探頭，二維灰階增益70%。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

對(duì)同一實(shí)驗(yàn)兔均用普通SonoVue造影劑和攜IL-8單抗靶向造影劑行造影檢查（前后相隔24小時(shí)），前者記為普通組，后者記為IL-8組。

1.5.2 造影檢查及圖像采集

所有實(shí)驗(yàn)兔均經(jīng)耳緣靜脈建立靜脈通道，并用體積分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉注射液（30mg/kg）注射麻醉，常規(guī)二維超聲檢查全肝，清晰顯示VX2腫瘤及其周圍正常肝組織。實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，從靜脈通道團(tuán)注普通SonoVue造影劑（0.2mL/kg），并用2mL生理鹽水沖注，注射靶向造影劑前采集圖像1次，造影后采集圖像11次（前90s內(nèi)每隔10s1次，90s-150s內(nèi)每隔30s1次）。共采集圖像12幀，時(shí)長150s。24小時(shí)后，再次從靜脈通道團(tuán)注攜IL-8單抗靶向造影劑（0.2mL/kg），并用2mL生理鹽水沖注，并在相同的時(shí)間點(diǎn)采集圖像。使用機(jī)器自帶軟件分析腫瘤組織的上升時(shí)間（RT）、達(dá)峰時(shí)間（TTP）、峰值強(qiáng)度（PI）、平均渡越時(shí)間（MTT），回聲強(qiáng)度測定點(diǎn)選自肝臟腫瘤中心，所有選取位點(diǎn)均避開壞死區(qū)域。分析過程采取盲法，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)編號(hào)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，用表示。2組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型建立

VX2腫瘤種植時(shí)間為2周，42只日本大耳兔中有34只存活并長出腫瘤，2只在腫瘤種植麻醉過程中死亡，6只在腫瘤形成期間死亡，經(jīng)B超檢查證實(shí)34只模型兔中有6只腫瘤最大徑均≤1cm，最終將28只模型兔（腫瘤最大徑均＞1cm）納入實(shí)驗(yàn)分析。

2.2 超聲顯像

2.2.1 二維灰階顯像和CDFI顯像

灰階超聲顯示腫瘤呈不均質(zhì)低回聲結(jié)節(jié)，內(nèi)可見無回聲壞死區(qū)及多個(gè)點(diǎn)狀強(qiáng)回聲鈣化（圖1a）；CDFI顯示腫瘤內(nèi)可見多個(gè)短線狀或條索狀血流信號(hào)（圖1b）。

圖1 兔VX2肝癌模型造影前超聲顯像a.灰階超聲顯示腫瘤內(nèi)呈不均質(zhì)低回聲（箭）；b.CDFI顯示腫瘤內(nèi)可見短線狀血流信號(hào)（箭）

2.2.2 造影顯像

造影劑經(jīng)留置針注入兔耳緣靜脈后，約10-30s出現(xiàn)動(dòng)脈相增強(qiáng)，腫瘤周邊呈明顯“環(huán)形”強(qiáng)化，內(nèi)部呈“片狀”或“樹枝狀”強(qiáng)化，部分壞死區(qū)無強(qiáng)化,腫瘤整體強(qiáng)化程度明顯高于周邊正常組織；約30-120s出現(xiàn)門脈相增強(qiáng)，腫瘤內(nèi)部仍可見部分強(qiáng)化，整體輪廓更加清晰，因該時(shí)相周邊正常組織造影進(jìn)一步增強(qiáng)，而腫瘤組織強(qiáng)化減弱，腫瘤整體強(qiáng)化程度近似或稍低于周邊正常組織；120s以后為延遲相，造影劑于該時(shí)相已完全退出腫瘤組織，腫瘤呈現(xiàn)低回聲，腫瘤整體強(qiáng)化程度明顯低于周邊正常組織。全部造影過程表現(xiàn)為“快進(jìn)快出”的特點(diǎn)，是典型惡性腫瘤的增強(qiáng)方式。普通組與IL-8組均于造影劑注入后20s、80s、150s三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取圖作為動(dòng)脈相、門脈相、延遲相的顯像。普通組動(dòng)脈相：腫瘤周邊明顯強(qiáng)化，內(nèi)部可見小片狀強(qiáng)化（圖2a）；IL-8組動(dòng)脈相：腫瘤周邊及內(nèi)部均明顯強(qiáng)化，內(nèi)部可見多個(gè)片狀及樹枝狀強(qiáng)化區(qū)（圖2b）；普通組門脈相：腫瘤呈低回聲，強(qiáng)化程度低于周邊正常組織（圖2c）；IL-8組門脈相：腫瘤呈稍低回聲，強(qiáng)化程度略低于周邊正常組織，其內(nèi)仍可見少量造影劑充填（圖2d）；普通組延遲相：腫瘤呈低至無回聲，強(qiáng)化程度明顯低于周邊正常組織（圖2e）；IL-8組延遲相：腫瘤回聲明顯減低，其內(nèi)可見極少量造影劑充填（圖2f）。

圖2 兩組兔VX2肝癌模型在三個(gè)時(shí)相的造影顯像 a.普通組動(dòng)脈相（箭）；b.IL-8組動(dòng)脈相（箭）；c.普通組門脈相（箭）；d.IL-8組門脈相（箭）；e.普通組延遲相（箭）；f.IL-8組延遲相（箭）

2.3 造影參數(shù)分析

兩組不同造影劑進(jìn)入腫瘤后，其上升時(shí)間的比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而達(dá)峰時(shí)間、峰值強(qiáng)度及平均渡越時(shí)間的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。提示攜IL-8單抗的靶向微泡在最初進(jìn)入腫瘤時(shí)的速率及數(shù)量與普通脂質(zhì)微泡相似，在腫瘤顯影的初始階段無明顯差異；隨后，由于靶向作用，靶向微泡與炎癥因子（IL-8）快速結(jié)合，IL-8組的達(dá)峰時(shí)間明顯短于普通組，且IL-8組腫瘤組織回聲強(qiáng)度隨著時(shí)間繼續(xù)増高，當(dāng)結(jié)合達(dá)到飽和時(shí)，回聲強(qiáng)度達(dá)到峰值而不再增加，其峰值強(qiáng)度明顯高于普通組；全部造影過程中靶向微泡與炎癥因子（IL-8）的結(jié)合作用持續(xù)存在，IL-8組的平均渡越時(shí)間較普通組明顯延長。

表1 兩組造影劑對(duì)兔VX2肝癌模型的造影參數(shù)比較

3 討論

近年來，超聲造影劑的研究進(jìn)展主要體現(xiàn)在微泡直徑的減?。╠＜8μm）和穩(wěn)定性的提高，微泡造影劑可通過無創(chuàng)注射從血液循環(huán)到達(dá)靶器官或靶組織內(nèi)持續(xù)性顯影[7]，這些都提高了病灶超聲造影診斷的準(zhǔn)確性，然而目前大多數(shù)超聲造影劑不具備靶向選擇性[8]。研究表明[9-10]，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中存在大量炎性反應(yīng)，并在組織內(nèi)釋放多種炎癥因子，其中IL-8是參與肝癌炎性反應(yīng)最重要的炎癥因子之一。故此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)普通超聲造影劑進(jìn)行特殊改造，將IL-8單抗連接修飾于普通聲學(xué)造影劑表面[11]，通過特殊的結(jié)合反應(yīng)，攜IL-8單抗靶向造影劑可快速、準(zhǔn)確的到達(dá)腫瘤內(nèi)。相較傳統(tǒng)超聲造影劑，攜IL-8單抗靶向造影劑具備高度靶向選擇病灶，與病灶特異性結(jié)合且持續(xù)顯影的優(yōu)勢。

肝臟腫瘤多由肝動(dòng)脈供血，而正常肝臟主要由門脈供血[12]。超聲造影檢查利用肝臟腫瘤與正常肝臟供血系統(tǒng)的不同，在注入聲學(xué)造影劑后，通過兩者間增強(qiáng)顯影時(shí)間及回聲強(qiáng)度的差異來進(jìn)行腫瘤的檢測[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種造影劑對(duì)VX2肝癌的顯影均表現(xiàn)為“快進(jìn)快出”的增強(qiáng)方式，不同的是，在造影的三期（動(dòng)脈相、門脈相、延遲相）中，普通造影劑對(duì)腫塊的顯影強(qiáng)度均低于攜IL-8單抗靶向造影劑。由此可認(rèn)為，腫瘤炎癥反應(yīng)中釋放的炎性因子IL-8與IL-8單抗之間存在明顯的靶向趨化作用。

通過對(duì)造影參數(shù)的比較，在保持其他實(shí)驗(yàn)因素一致的情況下，攜IL-8單抗靶向造影劑對(duì)腫瘤顯影的速度、強(qiáng)度及渡越時(shí)間均優(yōu)于普通聲學(xué)造影劑。分析其原因可能為普通脂質(zhì)微泡不具有靶向性，不能與腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性黏附，在后繼微泡的推動(dòng)、血流剪切力等外力的作用下被帶離腫塊，而靶向微泡能與釋放IL-8的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合，其本質(zhì)為具有高度特異性抗原-抗體的非共價(jià)結(jié)合，依靠正、負(fù)電荷吸引形成穩(wěn)定復(fù)合物[14]，血流的沖擊力和剪切力亦不易使其脫離腫塊。當(dāng)攜IL-8單抗與IL-8識(shí)別且結(jié)合后，大量靶向微泡迅速聚集于腫瘤內(nèi)，其達(dá)峰時(shí)間大幅縮短但顯影強(qiáng)度卻明顯高于普通微泡；當(dāng)靶向微泡與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合達(dá)到飽和時(shí)，病灶區(qū)域回聲強(qiáng)度不再增強(qiáng)。但由于這種特異性結(jié)合持續(xù)作用，其渡越時(shí)間仍長于普通微泡。由此可說明，攜IL-8單抗靶向造影劑對(duì)于肝癌的定位和診斷均優(yōu)于二維超聲和普通造影劑，具有高度靈敏性、特異性和靶向性的特點(diǎn)，且造影劑在腫瘤內(nèi)停留時(shí)間更長，不僅可以適當(dāng)減輕癌灶內(nèi)的炎癥反應(yīng)，亦可以為肝癌的相關(guān)治療如射頻消融治療等提供更多的定位顯影時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)所采用的靶向微泡在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較為廣泛，但仍需解決某些問題，如何對(duì)微泡的組成或制備過程進(jìn)行改進(jìn),平衡微泡造影劑與組織細(xì)胞損傷之間的關(guān)系,使經(jīng)超聲顯影的組織不發(fā)生實(shí)質(zhì)性的變化，使病灶有效顯影，又不致使正常組織細(xì)胞受損，這將成為后期實(shí)驗(yàn)繼續(xù)關(guān)注的重點(diǎn)之一。

綜上所述，攜IL-8單抗靶向造影劑可在短時(shí)內(nèi)精準(zhǔn)顯影于肝癌腫塊內(nèi)，明顯提高對(duì)肝癌診斷的效率和診斷準(zhǔn)確性，同時(shí)IL-8單抗與IL-8的結(jié)合作用可以緩和一部分腫瘤內(nèi)的炎癥反應(yīng)，延長顯影時(shí)間，這有望成為臨床上對(duì)肝癌診斷、治療的另一突破點(diǎn)。