DNK-A400全自動(dòng)微生物聯(lián)合檢測(cè)儀檢測(cè)真菌1-3-β-D葡聚糖和曲霉半乳甘露聚糖的性能評(píng)價(jià)

張雨虹，王云英

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶)

0 引言

臨床上侵襲性真菌?。↖nvasive fungal disease，IFD）感染率和致死率不斷增高，真菌感染的早期診斷和治療可顯著降低患者死亡率[1-2]。IFD的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要為真菌鏡檢、各種培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定、組織病理學(xué)診斷，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、成本高昂、工序復(fù)雜等缺點(diǎn)[3]。1-3-β-D 葡聚糖（1-3-β-DGlucan, G）實(shí)驗(yàn)及曲霉半乳甘露聚糖（Galactomannan, GM）實(shí)驗(yàn)可以對(duì)IFD進(jìn)行快速診斷，已成為IFD早期檢測(cè)的重要手段之一，被列入真菌診斷和治療指南[4]。由此，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院引進(jìn)了基于G實(shí)驗(yàn)與GM實(shí)驗(yàn)的儀器設(shè)備，對(duì)患者進(jìn)行真菌快速診斷。研究使用新購(gòu)進(jìn)的丹娜生物DNK-A400全自動(dòng)微生物聯(lián)合檢測(cè)儀分別進(jìn)行G實(shí)驗(yàn)和GM實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證儀器精密度、正確度、線性范圍及抗干擾等指標(biāo)，進(jìn)行綜合性能評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

于川大華西醫(yī)院收集G實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、陰性血清樣本各10例，重醫(yī)附一院GM實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、陰性血清樣本各10例，一次性無(wú)菌無(wú)熱原真空采血管按標(biāo)準(zhǔn)方法采取靜脈血4mL，3000 r/min離心10min，收集血清。精密度驗(yàn)證采用多個(gè)不同濃度的血清相互混勻，設(shè)置為高、低兩個(gè)濃度；正確度實(shí)驗(yàn)樣本為以上兩所醫(yī)院提供的帶有原始結(jié)果數(shù)據(jù)的留存樣本；線性范圍驗(yàn)證使用高、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品按一定比例配成為指南設(shè)計(jì)最高/最低檢測(cè)范圍內(nèi)不同濃度梯度的六個(gè)樣本；干擾評(píng)價(jià)采用含有高水平膽紅素的黃疸血清分別與陽(yáng)性和陰性標(biāo)本按照 1：9、3：7、1：1三種不同比例混合，以設(shè)置為高、中、低程度的干擾[5]。

1.2 儀器與材料

儀器：丹娜生物DNK-A400全自動(dòng)微生物聯(lián)合檢測(cè)儀，以及金屬浴孵育器、漩渦混合器、高速離心機(jī)（10000r/min）。

材料：廠商提供的G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)所用試劑盒材料，內(nèi)含反應(yīng)主劑、處理液、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、溶解液及主劑復(fù)溶液。

1.3 檢測(cè)方法

參照全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程，嚴(yán)格按照儀器的操作規(guī)程和試劑說明書操作，在室內(nèi)質(zhì)量控制結(jié)果允許范圍內(nèi)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。由DNK-A400全自動(dòng)微生物聯(lián)合檢測(cè)儀自動(dòng)化完成精密度、正確度、線性范圍及干擾因素實(shí)驗(yàn)所需數(shù)據(jù)的測(cè)量。通過參考G實(shí)驗(yàn)與GM實(shí)驗(yàn)的相關(guān)指南及各類報(bào)道發(fā)現(xiàn)：目前該兩種實(shí)驗(yàn)儀器的性能評(píng)價(jià)尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則[6-8]。因此，對(duì)于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的判定方法參照《GBT 26124-2011臨床化學(xué)體外診斷試劑（盒）》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與《YYT 1183-2010 酶聯(lián)免疫吸附法試劑（盒）》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。方法如下：

1.3.1 精密度驗(yàn)證

將高、低兩個(gè)濃度的樣本每天連續(xù)檢測(cè)5次，持續(xù)檢測(cè)3天，用得出的15組數(shù)據(jù)，計(jì)算精密度（cv%）；若CV值不超過10%，則精密度驗(yàn)證通過[9]。

1.3.2 正確度驗(yàn)證

G實(shí)驗(yàn)以川大華西醫(yī)院丹娜檢測(cè)結(jié)果作為對(duì)照，GM實(shí)驗(yàn)以重醫(yī)附一院伯樂檢測(cè)結(jié)果作為對(duì)照，在DNK-A400全自動(dòng)微生物聯(lián)合檢測(cè)儀上對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本測(cè)試1次，用卡方檢驗(yàn)評(píng)價(jià)兩者結(jié)果的一致性[10]。

1.3.3 線性范圍

在試劑說明書的線性范圍兩端選取高、低濃度的兩份標(biāo)準(zhǔn)品，為高值（H）樣本和低值（L）樣本，按 5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L、5L配置成6個(gè)濃度梯度的樣本，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)2次，計(jì)算平均值。將理論值和實(shí)測(cè)值進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r2；若G實(shí)驗(yàn)r2＞0.99，GM實(shí)驗(yàn)r2＞0.98，則表明線性關(guān)系良好，可接受其分析測(cè)量范圍[11]。

1.3.4 干擾實(shí)驗(yàn)

采用添加外源性膽紅素的方式進(jìn)行抗干擾實(shí)驗(yàn)，將高水平膽紅素的黃疸血清分別與陽(yáng)性和陰性樣本按照1：9、3：7、1：1三種不同的比例混合，檢測(cè)其濃度，計(jì)算檢測(cè)濃度與理論濃度間的偏倚（%），作為干擾率，以干擾率≤10%作為是否存在明顯干擾為判斷標(biāo)準(zhǔn)[12]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用Microsoft office Excel和SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證

DNK-A400全自動(dòng)微生物聯(lián)合檢測(cè)儀進(jìn)行G、GM實(shí)驗(yàn)，G實(shí)驗(yàn)高、低兩個(gè)濃度樣本精密度分別為6.78%、7.85%， GM實(shí)驗(yàn)高、低兩個(gè)濃度樣本精密度分別為7.53%、9.83%，均低于試劑盒的精密度指標(biāo)，符合臨床要求（見表1、表2）。

表1 G實(shí)驗(yàn)精密度評(píng)估結(jié)果（n=15）

表2 GM實(shí)驗(yàn)精密度評(píng)估結(jié)果（n=15）

2.2 正確度驗(yàn)證

檢測(cè)G實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、陰性樣本各10例，DNK-A400全自動(dòng)微生物聯(lián)合檢測(cè)儀檢測(cè)的定性結(jié)果與川大華西醫(yī)院陽(yáng)性值符合率90%，陰性值符合率為90%；檢測(cè)GM實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性、陰性樣本各10例，其定性結(jié)果與重醫(yī)附一院伯樂的陽(yáng)性值符合率90%（P＞0.05），陰性值符合率為90%（P＞0.05），均符合廠商指標(biāo)（見表3、表4）。

表3 G實(shí)驗(yàn)正確度評(píng)估結(jié)果（n=20）

表4 GM實(shí)驗(yàn)正確度評(píng)估結(jié)果（n=20）

2.3 線性范圍驗(yàn)證

根據(jù)G實(shí)驗(yàn)和GM實(shí)驗(yàn)的樣本結(jié)果分別制定了回歸曲線（見圖1、圖2），可以看出，G實(shí)驗(yàn)線性相關(guān)系數(shù)r2＞0.99，GM實(shí)驗(yàn)線性相關(guān)系數(shù)r2＞0.98，數(shù)據(jù)呈線性關(guān)系，線性良好；驗(yàn)證的G實(shí)驗(yàn)和GM實(shí)驗(yàn)分析測(cè)量范圍分別為 38.8～606.680pg /mL、0.351～4.292ug/L，與廠商指標(biāo)37.5-600pg/mL、0.25-5ug /L相近，可以接受廠商的分析測(cè)量范圍（見表5）。

圖1 G實(shí)驗(yàn)濃度與OD值線性關(guān)系

圖2 GM試驗(yàn)濃度與OD值線性關(guān)系

表5 G實(shí)驗(yàn)及GM實(shí)驗(yàn)線性范圍評(píng)估結(jié)果

表6 G實(shí)驗(yàn)干擾因素驗(yàn)證結(jié)果（n=8）

表7 GM實(shí)驗(yàn)干擾因素驗(yàn)證結(jié)果（n=8）

2.4 干擾因素驗(yàn)證

將含高水平膽紅素的黃疸血清按一定比例分別與G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性和陰性樣本混合成高、中、低程度干擾樣本，檢測(cè)后計(jì)算其干擾率，以干擾率≤10%作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行性能驗(yàn)證。結(jié)果顯示G實(shí)驗(yàn)高濃度干擾范圍為-45.58%-41.25%，中濃度干擾范圍為-31.36%-39.68%，低濃度干擾范圍為-9.42%-9.63%，GM實(shí)驗(yàn)高濃度干擾范圍為-11.03%-11.46%，中濃度干擾范圍為-10.44%-9.70%，低濃度干擾范圍為-9.22%-8.54%，表明G實(shí)驗(yàn)在低濃度膽紅素干擾下影響較小，GM實(shí)驗(yàn)在高、中、低濃度膽紅素干擾下影響輕微，干擾率基本低于10%（表6、表7）。

3 總結(jié)與討論

DNK-A400全自動(dòng)微生物聯(lián)合檢測(cè)儀是丹娜生物公司提供的一款自動(dòng)化侵襲性真菌檢測(cè)設(shè)備，具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性和穩(wěn)定性好、適用性強(qiáng)和抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)。然而，不同實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度、水質(zhì)及人員操作習(xí)慣等檢測(cè)條件有很大差異。因此，按照IS015189“醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的專用要求”的規(guī)定，設(shè)備應(yīng)在安裝及常規(guī)使用中顯示出能夠達(dá)到規(guī)定的性能標(biāo)準(zhǔn)，并且符合相關(guān)檢驗(yàn)所要求的規(guī)格。

精密度是檢測(cè)中最基本的性能指標(biāo)，本研究驗(yàn)證了丹娜生物DNK-A400全自動(dòng)微生物聯(lián)合檢測(cè)儀在G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)精密度分別為6.78%～7.85%、7.53%～9.83%，精密度良好，表明該儀器在本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)環(huán)境中系統(tǒng)重復(fù)性符合要求，符合臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量要求。

正確度為若干次測(cè)量結(jié)果平均數(shù)與定值的質(zhì)量控制品或校準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比，所得出的準(zhǔn)確程度。因目前G、GM檢測(cè)無(wú)公認(rèn)的參考物質(zhì)，也無(wú)合適的室間質(zhì)評(píng)材料。因此采用將G實(shí)驗(yàn)所測(cè)結(jié)果與川大華西醫(yī)院檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，GM實(shí)驗(yàn)與重醫(yī)附一院伯樂檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，通過陰陽(yáng)性符合率來(lái)評(píng)估儀器正確度。本次檢測(cè)中陰性、陽(yáng)性符合率均達(dá)到90%，符合該儀器檢測(cè)系統(tǒng)正確度性能要求。

線性范圍評(píng)價(jià)表明，G實(shí)驗(yàn)線性相關(guān)系數(shù)r2為0.9999，GM實(shí)驗(yàn)線性相關(guān)系數(shù)r2為0.9854，符合線性關(guān)系。因此可以接受廠商提供的37.5-600pg /mL、0.25-5ug /L分別作為G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)分析測(cè)量范圍。

因本所醫(yī)院感染科病人極多，黃疸病人的血清中膽紅素?zé)o法祛除，因此設(shè)計(jì)膽紅素干擾實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證其性能。干擾結(jié)果表明，G實(shí)驗(yàn)在低濃度膽紅素干擾下影響較小，GM實(shí)驗(yàn)在高、中、低濃度膽紅素干擾下影響輕微。我們猜測(cè)是由于G實(shí)驗(yàn)是通過動(dòng)態(tài)顯色法檢測(cè)血清中的真菌1-3-β-D葡聚糖，膽紅素血清中色素?zé)o法祛除，對(duì)其有一定干擾；GM實(shí)驗(yàn)是通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中的曲霉半乳甘露聚糖，膽紅素血清對(duì)其影響輕微。

丹娜生物DNK-A400全自動(dòng)微生物聯(lián)合檢測(cè)儀進(jìn)行G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲性真菌的方法學(xué)性能良好，性能評(píng)價(jià)所有項(xiàng)目均能夠基本達(dá)到預(yù)期，能為臨床快速提供準(zhǔn)確、可靠的檢驗(yàn)結(jié)果，能夠滿足急診檢驗(yàn)工作的需要，對(duì)侵襲性真菌的早期診斷和臨床用藥具有重要意義。