丁苯酞減輕小鼠腦缺血再灌注損傷

張勝龍，秦歷杰，彭海林

(1.河南省人民醫(yī)院急診科，河南 鄭州；2.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，河南 鄭州)

0 引言

腦卒中是致死、致殘率高的世界難題，全球致死疾病排行第二，我國致死疾病排行甚至超過心血管病排行第一[1]。最常見的典型缺血性腦卒中是由大腦中動脈栓塞引起。目前缺血性腦卒中最有效治療方案包括溶栓和血栓抽吸，不僅受時間窗的限制還存在諸多禁忌癥。丁苯酞是我國自主研制的新藥，能通過多種途徑發(fā)揮保護(hù)缺血再灌注損傷作用[2]。目前國內(nèi)外對于其作用靶點和機制尚未闡明，而該藥上市時間較短，臨床上對藥物的研究方法和干預(yù)措施有限，因此有必要通過動物模型試驗探討該保護(hù)作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品和主要試劑

雄性、體重為26-28g的野生型C57BL/6小鼠，SPF級，武漢大學(xué)模式動物中心提供。丁苯酞注射液（恩必普）。凋亡蛋白抗體（購自 Cell Signaling Technology）。

1.2 小鼠分組及模型

使用2.0%的異氟烷和氧/氧化亞氮混合氣體吸入麻醉小鼠，75%醫(yī)用酒精濕潤頸部鼠毛，剔除鼠毛。剪去左顱頂部鼠毛，酒精擦拭，在顱頂部行縱向切口，暴露顱骨，剝離顱骨表面結(jié)締組織。將激光多普勒血流儀的光纖探頭用生物膠固定在前囟后方1.5mm、距離顱骨中縫3-4mm的部位。翻轉(zhuǎn)小鼠使其處于仰臥位并固定，將光纖從鼠板的凹槽中傳出，連接到激光多普勒血流儀，記錄初始狀態(tài)的腦血流灌注量，插入肛溫探頭，保持體溫在37±0.5℃。行頸部正中切口，暴露左側(cè)頸總動脈，頸內(nèi)動脈和頸外動脈。使用8-0絲線結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端，在頸外動脈穿入另一根8-0絲線，在靠近頸總動脈分叉處打一個活結(jié)。使用動脈夾分別夾閉頸內(nèi)動脈、勁總動脈。在距離頸外動脈結(jié)扎線下1mm處剪一個小口，將一根602156號硅膠線栓從小口中插入。松開頸內(nèi)動脈夾，在小口處剪斷頸外動脈，回抽線栓、反轉(zhuǎn)使其進(jìn)入頸內(nèi)動脈，并向內(nèi)插入willis環(huán)-大腦中動脈段，線栓的插入深度距離頸總動脈分叉處約9±1mm，稍微系緊活結(jié)。此時激光多普勒血流儀檢測到的血流量下降75%以上。缺血45min后拔掉線栓，結(jié)扎外動脈近心端，松開動脈夾，大腦血流再灌注，縫合傷口，常規(guī)飼養(yǎng)。建模成功后隨機分為丁苯酞組和對照組。丁苯酞組每天腹腔注射丁苯酞注射液4.5mg/kg 1次，對照組每天腹腔注射等量的生理鹽水，持續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)2周。

1.3 鼠神經(jīng)功能評分及TTC染色

基于Berderson評分改進(jìn)方法（9分制）。0分：無神經(jīng)受損的癥狀；1分：提尾時對側(cè)前肢蜷曲，或者不能完全到達(dá)患側(cè)前肢；2分：提尾時對側(cè)肩膀內(nèi)收；3分：平推：向?qū)?cè)推動時阻力下降；4分：可自發(fā)的向各個方向運動，但在脫尾巴時只向?qū)?cè)轉(zhuǎn)彎；5分：自發(fā)運動時轉(zhuǎn)圈或只向?qū)D(zhuǎn)；6分：無自主運動，只在刺激時運動；7分：無自主運動，刺激時也無運動；8分：與腦缺血有關(guān)的死亡。評分完成后，用3%戊巴比妥鈉對小鼠腹腔注射0.07mL麻醉小鼠，沿正中線充分暴露心臟，用0.55號頭皮針連一次性輸液器，灌注4℃ PBS緩沖液進(jìn)行灌流，之后用4%多聚甲醛溶液灌流8min，以固定血管內(nèi)膜面，取腦組織。

將腦組織于-20℃冰箱冷凍30min，用刀片切成1mm厚的切片，切7片（前囟前方切4片，后方切3片）。將切片立即置于10mL 2%TTC的血清瓶中，37℃恒溫孵育10min。不時翻動腦片，使組織均勻染色。正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區(qū)呈蒼白色。

1.4 RT-PCR檢測

采用TRizol （15596-026, Invitrogen）試劑提取組織中的mRNA， 使 用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（04896866001, Roche, Basel, Switzerland）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實驗。之后利用SYBR Green PCR Master Mix （04887352001, Roche）進(jìn)行PCR擴增，以β-actin的表達(dá)為內(nèi)參對目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行歸一化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計軟件采用SPSS 21.0，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01差異非常顯著。使用Image Pro Plus （version 6.0）軟件進(jìn)行梗死面積百分比統(tǒng)計結(jié)果代替梗死體積百分比。梗死體積百分比=梗死面積百分比=（（第一片梗死面積+倒數(shù)第二片梗死面積）/2+剩余各片梗死面積）/對側(cè)7片面積和。

2 結(jié)果

2.1 丁苯酞組Bederson神經(jīng)功能評分更低

兩周后丁苯酞組12只小鼠普遍提尾時對側(cè)肩膀有內(nèi)收功能，對照組12只小鼠向?qū)?cè)推動時阻力明顯下降，丁苯酞組神經(jīng)評分均值為2.4，對照組均值為3.4，兩組間t=4.464，P=0.000，見Fig1A。

2.2 丁苯酞組TTC染色梗死體積百分比更少

2周后TTC染色，白色提示梗死區(qū)，紅色提示正常腦組織色，梗死區(qū)位于皮層和紋狀體，對照組梗死體積百分比均值為17.7%，丁苯酞組梗死體積百分比均值為6.5%，兩組間t=4.878，P=0.005，見Fig1B。

圖1 丁苯酞神經(jīng)功能保護(hù)作用（A）丁苯酞組與對照組改良Bedserson評分（9分制）（B）丁苯酞組和對照組腦組織切片TTC染色，紅色區(qū)域為正常腦組織，白色為梗死腦組織，柱狀圖為梗死面積(體積)百分比（＊＊ P＜0.01）

2.3 丁苯酞組抑制凋亡的基因表達(dá)上調(diào)，凋亡基因的表達(dá)下調(diào)

2周后，丁苯酞組相對于對照組，丁苯酞組抑制凋亡的基因表達(dá)上調(diào)，丁苯酞組Bcl-2相對表達(dá)量1.98，t=-9.052，P=0.000，Bcl-xl相對表達(dá)量為1.54，t=-4.892，P=0.003，凋亡基因表達(dá)下調(diào)，丁苯酞組Bax相對表達(dá)量為0.43，t=6.920，P=0.003，Bad相對表達(dá)量為 0.57，t=7.458，P=0.000，Bid相對表達(dá)量為 0.53，t=6.335，P=0.001。

圖2 RT-PCR測凋亡相關(guān)基因mRNA相對量比較。（＊ P＜0.05，＊＊P＜0.01）

3 討論

丁苯酞在缺血性腦卒中的治療中效果肯定，但是關(guān)于丁苯酞的治療機制并未完全研究清楚。目前對于缺血再灌注損傷的機制研究包括興奮性氨基酸毒性，線粒體損傷，炎癥反應(yīng)，鈣超載，抗自由基，抗細(xì)胞凋亡等[3]。在缺血中心區(qū)，血流低于正常水平的10-25%，將會發(fā)生不可逆性神經(jīng)細(xì)胞壞死，在缺血半暗帶，存在廣泛的炎癥反應(yīng)，能進(jìn)一步刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生更多的炎癥因子，能量的缺乏，酸性毒性物質(zhì)進(jìn)一步積累，都會使缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4,5]，神經(jīng)細(xì)胞的壞死過程不可逆，但是凋亡過程可以通過調(diào)控上游信號進(jìn)行逆轉(zhuǎn)[5]。因次逆轉(zhuǎn)缺血半暗帶細(xì)胞的凋亡是減少腦缺血再灌注損傷重要的調(diào)控機制。

凋亡進(jìn)程分為三期，誘導(dǎo)期細(xì)胞接受不同信號產(chǎn)生效應(yīng)，效應(yīng)期由Bcl-2家族等調(diào)控分子使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的程序性死亡，降解期可見細(xì)胞凋亡。凋亡發(fā)生是凋亡相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果，同時受到鈣超載、氧自由基、線粒體等內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)[6]。Bcl-2基因最早發(fā)現(xiàn)[7]于B淋巴濾泡細(xì)胞染色體易位斷點t（14；18），Bcl-2蛋白家族按功能分為抑制凋亡蛋白和促凋亡蛋白。大多數(shù)定位線粒體外膜，或受到刺激后轉(zhuǎn)移到線粒體外膜。Bcl-2，Bcl-xl含有4個BH結(jié)構(gòu)域，屬于抗凋亡蛋白家族成員，多數(shù)缺血再灌注損傷保護(hù)的研究發(fā)現(xiàn)他們的表達(dá)往往是上調(diào)的。Pan等研究[8]發(fā)現(xiàn)通過激活pi3k/akt/mtor生存途徑減少線粒體中bcl-2/rac1復(fù)合物的形成，從而抑制體內(nèi)腦缺血再灌注損傷和體外高葡萄糖誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞神經(jīng)毒性的缺血再灌注后腦損傷。Song,DD等研究鞘氨醇激酶2通過BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2相互作用，可以激活自噬并抵抗小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞氧葡萄糖剝奪引起的細(xì)胞損傷[9]。Dixon, BJ在大鼠幼崽接受單側(cè)頸動脈結(jié)扎缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷后，發(fā)現(xiàn)IFNβ通過刺激STAT3和Bcl-2過表達(dá)，導(dǎo)致caspase-3的表達(dá)減少[10]。Bid、Bad屬于僅含BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白成員，是細(xì)胞凋亡啟動子和抗凋亡蛋白家族的拮抗劑，調(diào)控他們基因表達(dá)下調(diào)可以保護(hù)缺血再灌注損傷。Talebi等研究[11]雷帕霉素在大鼠MCAO模型中mTOR信號通路時發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素治療可改善缺血后梗死體積，神經(jīng)功能缺失，腦水腫和血腦屏障通透性，可能通過降低Mir-1基因表達(dá)，從而降低靶基因Bad的表達(dá)保護(hù)缺血再灌注后腦損傷。Bax屬于Bax亞家族促凋亡蛋白成員，含有3個BH結(jié)構(gòu)域，通過調(diào)節(jié)線粒體外膜穩(wěn)定性允許凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)促進(jìn)凋亡[12]。

Bcl-2家族蛋白相互作用對腦缺血再灌注損傷的研究表明可能是細(xì)胞應(yīng)激后僅含BH3的Bid、Bad等啟動細(xì)胞凋亡程序，拮抗Bcl-2、Bcl-xl等抗凋亡蛋白，并激活Bax亞家族成員。激活的Bax從胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移到線粒體外膜，并與膜上的電壓依賴陰離子通道作用，通道開放使線粒體內(nèi)凋亡因子細(xì)胞色素C等釋放到細(xì)胞質(zhì)，引起細(xì)胞凋亡[13]。很多研究已經(jīng)表明通過抗凋亡基因表達(dá)的上調(diào)和促凋亡基因表達(dá)的下調(diào)可以保護(hù)腦缺血再灌注損傷。

丁苯酞注射液腹腔注射兩周后，促凋亡基因Bax、Bid、Bad的表達(dá)明顯下調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2、bcl-xl表達(dá)明顯上調(diào)，由此推測丁苯酞注射液參與了凋亡基因的表達(dá)過程，其保護(hù)缺血再灌注腦損傷的具體靶點和調(diào)控機制需要進(jìn)一步來研究。

4 結(jié)論

丁苯酞能減輕急性期腦缺血再灌注損傷，可能與上調(diào)抑制凋亡基因表達(dá)和下調(diào)促凋亡基因表達(dá)有關(guān)。